La biogenèse ribosomale débute avec la transcription de l'ARN ribosomal (ARNr). La structure du nucléole, la formation des ribosomes et le recrutement des centaines de protéines et de Small Nucleolar Ribonucleic Acid (snoRNA) qui sont essentiels pour la biogenèse ribosomale dépendent de l'activité transcriptionnelle des gènes d’ARNr. Les génomes haploïdes murins et humains possèdent à peu près 200 copies de gènes d’ARNr présents sur le bras court de cinq chromosomes acrocentriques. Ces loci correspondent aux Nucleolar Organizer Regions (NORs) et restent en majorité hypocondensés par rapport au reste des chromosomes durant la mitose. Au commencement de chaque cycle cellulaire, les nucléoles se reforment autour des gènes d’ARNr actifs. Ces gènes d’ARNr sont transcrits par l'ARN polymérase I, ce qui nécessite la formation d'un complexe de pré-initiation de la transcription (Pre-Initiation Complex, PIC). À partir d'expériences in vitro, deux facteurs basaux pour l'ARN polymérase I ont été identifiés: Selectivity Factor 1 (SL1) et Upstream Binding Factor (UBF). Le complexe SL1 contient la protéine TATA-box Binding Protein (TBP) ainsi que plusieurs TBP-Associated Factor (TAF) qui permettent de reconnaître les séquences promotrices des gènes d’ARNr. Les données existantes à ce jour suggèrent qu'UBF est un facteur architectural qui permet la formation d'une structure nucléoprotéique, l'enhancesome, dans laquelle un dimère d'UBF forme une boucle d'ADN de 360° d'environ 140 paires de bases (pb) d'ADN, et de ce fait, aide à la formation du PIC. UBF a également été impliqué dans la régulation de l'élongation de la transcription. Cependant, il n'a pas encore été déterminé si UBF accomplit ces deux fonctions in vivo et si UBF est essentiel pour la transcription des gènes d'ARNr. Pour résoudre cette question fondamentale, nous avons généré des souris ainsi que des cellules murines qui portent une mutation conditionnelle du gène Ubf. L'inactivation du gène Ubf a entraîné un arrêt développemental au stade morula, ceci révélant l'importance du facteur pour la prolifération des cellules et pour le développement embryonnaire. L'inactivation conditionnelle du gène Ubf en culture cellulaire a mené à l'arrêt de la transcription ribosomale, à l'absence de formation du complexe PIC sur les gènes d’ARNr, à la mise en état inactif des gènes d’ARNr sans méthylation de l'ADN, à l'altération de la structure nucléolaire et à la formation d'une structure nucléaire qui contient les facteurs de l'initiation de la transcription et de la maturation des ARNr mais qui est dépourvue des NORs. L'inactivation conditionnelle d'Ubf dans les cellules a conduit à un arrêt de la prolifération cellulaire et à l'apoptose des cellules de manière indépendante p53, et ceci exclusivement dans les cellules transformées de manière oncogénique. Ces résultats suggèrent qu'UBF constituerait une cible de choix pour la chimiothérapie. / Ribosomal biogenesis starts with transcription of ribosomal RNA (rRNA). Nucleolus structure, ribosomes formation and recruitment of hundreds of proteins and snoRNAs Small Nucleolar Ribonucleic Acid essential for ribosomal biogenesis depend on transcription of rRNA. Human and mouse haploid genomes contain around 200 copies of rDNA genes on the short arms of five acrocentric chromosomes. These loci correspond to the NORs Nucleolar Organizer Regions and stay undercondensed during mitosis as compared with the rest of the chromosomes. At the beginning of each cell cycle, nucleoli are reformed around rDNA genes. rDNA genes are transcribed by RNA polymerase I, which requires the formation of the PIC. Two RNA polymerase I basal transcription factors were identified; SL1 Selectivity Factor 1 and UBF Upstream Binding Factor. The SL1 complex contains the TBP TATA-box Binding Protein protein and the TAF TBP-Associated Factor allowing the promoter sequences recognition on rDNA genes. Data suggest that UBF is an architectural factor that allows the formation of a nucleoproteic structure, the enhancesome, in which a UBF dimer forms a DNA loop of 360° of almost 140 bp of DNA and in this way aids PIC formation. However, UBF has also been implicated in the regulation of transcription elongation. But whether or not UBF actually performs either of these functions in vivo, or indeed is even essential for the transcription of the rRNA genes at all is still unknown. To resolve this fundamental question we have generated mice and mouse cells conditionally lacking the single copy Ubf gene. Inactivation of the Ubf gene in mouse leads to developmental arrest at morula stage, this revealing the factor's importance for cell proliferation and embryonic development. Conditional inactivation of Ubf gene in cell culture leads to shut-down of ribosomal transcription, to failure of PIC formation loss on rDNA genes, to a DNA methylation-independent inactivation of rDNA genes, to nucleolus structure alteration and to the formation of a sub-nuclear structure containing the initiation of transcription and the processing factors lacking the NORs. Conditional inactivation of Ubf gene in cells leads to a proliferation cell arrest and to a p53-independent apoptosis exclusively in oncogenically transformed cells, suggesting that UBF could represent a unique target for chemotherapy.

Dans le but d'élucider les mécanismes de régulation de la transcription de l'ARN ribosomique et de la biosynthèse des ribosomes, deux facteurs de transcription ribosomique, soit UBF et TTF -l, furent étudiés dans le but de mieux caractériser leurs fonctions in vivo. Un modèle , de désactivation conditionnelle du gène codant pour UBF chez la souris fut élaboré. Après l'inactivation d'un allèle chez des animaux hétérozygotes aucun défaut développemental, physique ou comportemental n'a été observé lors d' investigations préliminaires. Un modèle de diminution inductible de TTF-I par le ciblage par shRNAmir fut développé. Des études de marquage métabolique au tritium ont permis de conclure qu'une diminution de TTF -l avait un effet appréciable sur la transcription ribosomique et un effet encore plus marqué sur la maturation des ARN ribosomiques. On voit une inhibition claire et nette de la maturation des ARN ribosomiques et aucune accumulation appréciable du précurseur ce qui indique aussi un problème de transcription. Des études du cycle cellulaire, effectués par ±fluorescence-assisted cell sorting¿, ont permis de détecter un arrêt partiel en G 1 qui se traduit en une diminution de la vitesse de passage de la phase G 1 à G2/M lors d'une diminution de TTF-I. Finalement, un modèle de récupération fut développé en introduisant un vecteur conditionnel capable d'exprimer la forme pleine longueur de TTF-I dans les cellules de diminution conditionnelle. L'induction double et simultanée d'une forme pleine longueur de TTF-I et du shRNAmir ciblant TTF-I permit la récupération de la diminution de TTF -l chez ces cellules. Ce modèle de récupération permit de confirmer que les effets observés étaient dus à la diminution de TTF -l en excluant des effets secondaires.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2011-2012 / Les suppresseurs de tumeurs Rb, p53, INK4a et ARF sont essentiels et ils sont partie intégrante d'un réseau complexe qui régule le cycle cellulaire ainsi que la réponse aux stress oncogéniques. La biogénèse des ribosomes, donc la synthèse et l'assemblage des ribosomes, est une activité essentielle pour la prolifération cellulaire et est fortement affectée par les changements environnementaux ainsi que différentes formes de stress. Il est donc peu surprenant d'apprendre que plusieurs suppresseurs de tumeurs et oncogenes, dont Rb, ARF, p53 et MDM2 travaillent de concert ou en opposition afin de maintenir le niveau de la production de ribosomes à un niveau optimal pour répondre à la demande cellulaire. ARF, un des produits du gène CDKN2A, est reconnu pour causer la stabilisation de p53 en inhibant son ubiquitine ligase MDM2 et ainsi induire l'arrêt du cycle cellulaire et/ou l'apoptose. ARF peut aussi être un suppresseur de tumeurs en l'absence de p53/TP53, car il peut causer un arrêt de prolifération en inhibant, en partie, la synthèse des ARN ribosomiques (ARNrs) dans des cellules p53-/-. ARF cause l'ubiquitination et la dégradation de la chaperonne NPM/B23 qui est impliquée dans la maturation de l'ARNr 28S, cependant ARF inhibe aussi la production de l'ARNr 18S ainsi que l'ARNr précurseur (47S). L'effet de ARF sur NPM n'explique pas l'ensemble des effets de ARF sur la production et la maturation des ARNrs. Nous avons démontré que ARF contrôle la localisation sub-nucléaire du Facteur de Terminaison de la Transcription de la Polymerase I, TTF-I. TTF-I est dynamique et se déplace entre le nucléoplasme et le nucléole avec l'aide de NPM et d'un signal de localisation nucléolaire dans son domaine de régulation en N-terminal. ARF inhibe la localisation nucléolaire de TTF-I en interagissant avec le signal de localisation nucléolaire causant son accumulation dans le nucléoplasme. La réduction de TTF-I récapitule les effets de ARF sur la synthèse et la maturation des ARNrs et le phénotype est récupéré par l'introduction d'un transgène de TTF-I. La surexpression de TTF-I affecte, de façon similaire à une réduction, la biogénèse des ribosomes et le niveau cellulaire de TTF-I est critique et régulé par l'ubiquitine ligase MDM2. ARF inhibe l'interaction de MDM2 avec TTF-I ainsi que son ubiquitination. De plus, ARF et Senp3 régulent la sumoylation de TTF-I. Nos résultats montrent comment ARF, NPM et MDM2 peuvent réguler et limiter la synthèse des ARNrs.

La transcription des gènes de l'ARN ribosomique (ARNr) est essentielle à la synthèse des ribosomes qui sont eux-mêmes requis pour la production des protéines et donc de l'ensemble des fonctions cellulaires. Malgré ce rôle fondamental, les mécanismes de la synthèse des ARN ribosomiques sont peu élucidés. Mes travaux ont d'abord porté sur la caractérisation du facteur de liaison en amont UBF (Upstream Binding Factor) dans la régulation de l'activité de l'ARN polymerase I (RPI). UBF lie l'ADN des gènes ribosomiques (ADNr) et forme une structure appelée l'Enhancesome. La phosphorylation par ERK des boîtes HMG1 d'UBF provoque un changement de conformation de l'Enhancesome. La signalisation ERK augmente rapidement la transcription ribosomique, mais ne change pas le nombre de polymerases engagées sur les gènes. La phosphorylation d'UBF par ERK le rend plus permissif au passage de RPI, ce qui en fait un modulateur de l'élongation transcriptionnel dépendant de la signalisation par des facteurs de la croissance. Dans un autre ordre d'idées, la méthylation de l'ADN est associée au silencing épigénétique. Nous avons montré que la perte totale de méthylation CpG suscite une réactivation partielle des gènes ribosomiques silencieux et provoque des défauts prononcés de transcription et de maturation des ARNr. J'ai ensuite démontré que la chromatine est plus accessible qu'à la normale, ce qui permet à l'ARN polymerase II (RPIJ) de se lier et transcrire de façon aberrante sur le locus ribosomique. Je me suis de plus intéressé à TTF-I (Transcription Termination Factor-I), un facteur de transcription régulé par le suppresseur de tumeur ARF et que nous avons observé faire la navette entre le noyau et les gènes ribosomiques. En plus de son interaction avec les gènes ribosomiques, TTF-I est retrouvé aux promoteurs de gènes codants des protéines, bien que sa fonction sur ces gènes reste à déterminer. En outre, j'ai développé un essai d'immunoprecipitation séquentielle de la chromatine des gènes ribosomique afin de disposer d'un outil puissant pour comprendre les différences qui distinguent les gènes actifs et inactifs. Les résultats préliminaires indiquent une absence d'histone et une association d'UBF marquée sur les régions activement transcrites de l'ADNr.