La cellule eucaryote constitue un système complexe composé d'un grand nombre d'entités, dont trois ensembles particulièrement importants : l'ADN, l'ARN et les protéines. Ces entités vont interagir ensemble et former des complexes ribonucléoprotéiques possédant des activités biochimiques qui vont permettre à la cellule de se réguler et de s'adapter à son milieu. Ces complexes sont des acteurs dans les mécanismes d'expression génique et de régulation. Au cours du siècle dernier, l'étude de ces entités a fait l'objet d'un intérêt tellement important de la part des biologistes qu'elle a donné naissance à un domaine scientifique particulier : la biologie moléculaire. Plus récemment, bien que celle-ci se soit à ses débuts focalisée sur l'ADN et les protéines, les ARN, et leur sous-ensemble les petits ARN non-codants (pARNnc), sont apparus comme des acteurs clés de la régulation de mécanismes cellulaires fondamentaux. En outre, le développement de technologies dites de séquençage à haut débit a permis d'en étudier la diversité des classes. Ainsi, durant les 20 dernières années, des efforts importants ont été consacré à la découverte et à l'étude de nouvelles classes de pARNnc, leur biogenèse et leur fonction. Cependant, l'étude de ces pARNnc par le biais de protocoles de séquençage des pARNnc (pARN-seq) ainsi que les outils bioinformatiques ont été conçus pour concentrer les analyses sur les séquences considérées comme les plus importantes. De ce fait, il apparait généralement que les pARNnc de moins de 15 nucléotides (nt) et ceux issus des ARN ribosomiques ont été presque systématiquement écartés des analyses. Dans le cadre de ce doctorat, nous avons voulu remettre en question cette croyance en préservant l'ARN ribosomique (ARNr) dans nos échantillons, et en abaissant à 8 nt la fenêtre de taille minimale des ARN séquencés. Grâce à cette approche, nous avons justement découvert une nouvelle famille d'ARN exceptionnellement courts qui correspondent à l'extrémité 5' de l'ARNr 5.8S, que nous avons appelé dodécaARN (doARN), reflétant ainsi le nombre de nucléotides de base (12 nt) que contiennent leurs membres. À cet effet, nous avons développé une méthode de détection quantitative afin de confirmer nos données de pARN-Seq, et de valider l'existence de deux doARN (i.e. la séquence minimale de 12 nt doARN, et sa variante portant une cytosine additionnelle en 5', le C-doARN) chez la souris et l'homme. Cette méthode spécifique et sensible est basée sur une ligature assistée par un pont à ADN d'un adaptateur à l'extrémité 5' des doARN, suivie d'une rétro-transcription, et d'amplification quantitative par qPCR. Nous avons ainsi pu confirmer nos résultats de pARN-seq et déterminé que les deux doARN sont plus abondants que certains microARN. La caractérisation de ces ARN nous a conduit à établir que le doARN et le C-doARN sont principalement localisés dans le cytoplasme des cellules, et interagissent avec les ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNP) A0, A1 et A2B1, mais pas Argonaute 2. Enfin, l'étude de la régulation de leur expression a permis d'identifier que le niveau du C-doARN était augmenté en cas de privation de sérum, tandis que le doARN était diminué dans les cellules et tissus cancéreux de la prostate humaine comparés à celles et ceux normaux. Plus intéressant encore, nous avons pu établir à l'aide de test de blessure que le CdoARN était capable de réduire la migration/prolifération cellulaire, alors que le do-ARN pourrait fonctionner comme un régulateur global de la traduction. Entre autres, nous avons établi que la présence d'un site de fixation pour le doARN au sein de la séquence 5'UTR d'un ARNm pourrait impacter la traduction de celui-ci. Bien que ces études nous aient permis d'affirmer la présence et la fonctionnalité d'ARN inférieurs à 15 nt, leurs mécanismes d'action, ainsi que leur biogenèse restent néanmoins à être élucidés. Notamment, je porterai une grande attention dans la discussion aux perspectives de recherche concernant l'hypothèse selon laquelle une méthylation spécifique de l'uracile 14 de l'ARNr 5.8S puisse être liée à la génération des doARN / The eukaryotic cell is a complex system composed of many entities, including three particularly important sets: DNA, RNA, and proteins. These entities interact together to form ribonucleoprotein complexes with biochemical activities that allow the cell to regulate and adapt to its environment. These complexes are actors in the mechanisms of gene expression and regulation. During the last century, the study of these entities has been the subject of such great interest by biologists that it has given rise to a particular scientific field: molecular biology. More recently, although molecular biology initially focused on DNA and proteins, RNAs, and their small non-coding RNAs (sRNA) subset, have emerged as key players in the regulation of fundamental cellular mechanisms. In addition, the development of so-called high-throughput sequencing technologies has made it possible to study the diversity of their classes. Thus, during the last 20 years, significant efforts have been devoted to the discovery and study of new classes of ncRNAs, their biogenesis and their function. However, the study of these sRNA through sRNA sequencing protocols (sRNA-seq) as well as bioinformatics pipelines have been designed to focus analyses on the sequences considered most important. As a result, it generally appears that sRNA of less than 15 nucleotides (nt) and those derived from ribosomal RNA were almost systematically excluded from the analyses. In this Ph.D. work, we wanted to challenge this belief by preserving the ribosomal RNA (rRNA) in our samples, and by lowering the minimum size window of sequenced RNA to 8 nt. Thanks to this approach, we discovered a new family of exceptionally short RNA that correspond to the 5' end of the 5.8S rRNA, which we called dodecaRNA (doRNA), reflecting the number of core nucleotides (12 nt) shared by its members. For this purpose, we developed a quantitative detection method to confirm our sRNASeq data, and to validate the existence of two doRNAs (i.e., the minimum 12 nt doRNA sequence, and its variant carrying an additional 5' cytosine, C-doRNA). This specific and sensitive method is based on DNA-bridge-assisted ligation of an adaptor at the 5' end of the doRNAs, followed by retrotranscription, and quantitative amplification by qPCR. We were thus able to confirm our sRNA-seq results and determined that both doRNAs may be more abundant than microRNAs. The characterization of these RNAs led us to establish that doRNA and C-doRNA are mainly localized in the cytoplasm of cells and interact with heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNPs) A0, A1 and A2B1, but not Argonaute 2. Finally, the study of the regulation of their expression identified that the level of C-doRNA was increased during serum deprivation, while doRNA was decreased in human prostate cancer cells and tissues compared to normal cells and tissues. More interestingly, we were able to establish through cell culture wound testing that C-doRNA was able to reduce cell migration/proliferation, while do-RNA could function as a global regulator of translation. Among other things, we established that the presence of a binding site for doRNA within the 5'UTR sequence of an mRNA could impact its translation. Although these studies have allowed us to affirm the presence and functionality of RNA below 15 nt, their mechanisms of action, as well as their biogenesis remain to be elucidated. In particular, I will pay close attention in the discussion to the research prospects concerning the hypothesis that a specific methylation of uracil 14 of 5.8S rRNA can be linked to the generation of our doRNA

La cellule eucaryote constitue un système complexe composé d'un grand nombre d'entités, dont trois ensembles particulièrement importants : l'ADN, l'ARN et les protéines. Ces entités vont interagir ensemble et former des complexes ribonucléoprotéiques possédant des activités biochimiques qui vont permettre à la cellule de se réguler et de s'adapter à son milieu. Ces complexes sont des acteurs dans les mécanismes d'expression génique et de régulation. Au cours du siècle dernier, l'étude de ces entités a fait l'objet d'un intérêt tellement important de la part des biologistes qu'elle a donné naissance à un domaine scientifique particulier : la biologie moléculaire. Plus récemment, bien que celle-ci se soit à ses débuts focalisée sur l'ADN et les protéines, les ARN, et leur sous-ensemble les petits ARN non-codants (pARNnc), sont apparus comme des acteurs clés de la régulation de mécanismes cellulaires fondamentaux. En outre, le développement de technologies dites de séquençage à haut débit a permis d'en étudier la diversité des classes. Ainsi, durant les 20 dernières années, des efforts importants ont été consacré à la découverte et à l'étude de nouvelles classes de pARNnc, leur biogenèse et leur fonction. Cependant, l'étude de ces pARNnc par le biais de protocoles de séquençage des pARNnc (pARN-seq) ainsi que les outils bioinformatiques ont été conçus pour concentrer les analyses sur les séquences considérées comme les plus importantes. De ce fait, il apparait généralement que les pARNnc de moins de 15 nucléotides (nt) et ceux issus des ARN ribosomiques ont été presque systématiquement écartés des analyses. Dans le cadre de ce doctorat, nous avons voulu remettre en question cette croyance en préservant l'ARN ribosomique (ARNr) dans nos échantillons, et en abaissant à 8 nt la fenêtre de taille minimale des ARN séquencés. Grâce à cette approche, nous avons justement découvert une nouvelle famille d'ARN exceptionnellement courts qui correspondent à l'extrémité 5' de l'ARNr 5.8S, que nous avons appelé dodécaARN (doARN), reflétant ainsi le nombre de nucléotides de base (12 nt) que contiennent leurs membres. À cet effet, nous avons développé une méthode de détection quantitative afin de confirmer nos données de pARN-Seq, et de valider l'existence de deux doARN (i.e. la séquence minimale de 12 nt doARN, et sa variante portant une cytosine additionnelle en 5', le C-doARN) chez la souris et l'homme. Cette méthode spécifique et sensible est basée sur une ligature assistée par un pont à ADN d'un adaptateur à l'extrémité 5' des doARN, suivie d'une rétro-transcription, et d'amplification quantitative par qPCR. Nous avons ainsi pu confirmer nos résultats de pARN-seq et déterminé que les deux doARN sont plus abondants que certains microARN. La caractérisation de ces ARN nous a conduit à établir que le doARN et le C-doARN sont principalement localisés dans le cytoplasme des cellules, et interagissent avec les ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNP) A0, A1 et A2B1, mais pas Argonaute 2. Enfin, l'étude de la régulation de leur expression a permis d'identifier que le niveau du C-doARN était augmenté en cas de privation de sérum, tandis que le doARN était diminué dans les cellules et tissus cancéreux de la prostate humaine comparés à celles et ceux normaux. Plus intéressant encore, nous avons pu établir à l'aide de test de blessure que le CdoARN était capable de réduire la migration/prolifération cellulaire, alors que le do-ARN pourrait fonctionner comme un régulateur global de la traduction. Entre autres, nous avons établi que la présence d'un site de fixation pour le doARN au sein de la séquence 5'UTR d'un ARNm pourrait impacter la traduction de celui-ci. Bien que ces études nous aient permis d'affirmer la présence et la fonctionnalité d'ARN inférieurs à 15 nt, leurs mécanismes d'action, ainsi que leur biogenèse restent néanmoins à être élucidés. Notamment, je porterai une grande attention dans la discussion aux perspectives de recherche concernant l'hypothèse selon laquelle une méthylation spécifique de l'uracile 14 de l'ARNr 5.8S puisse être liée à la génération des doARN / The eukaryotic cell is a complex system composed of many entities, including three particularly important sets: DNA, RNA, and proteins. These entities interact together to form ribonucleoprotein complexes with biochemical activities that allow the cell to regulate and adapt to its environment. These complexes are actors in the mechanisms of gene expression and regulation. During the last century, the study of these entities has been the subject of such great interest by biologists that it has given rise to a particular scientific field: molecular biology. More recently, although molecular biology initially focused on DNA and proteins, RNAs, and their small non-coding RNAs (sRNA) subset, have emerged as key players in the regulation of fundamental cellular mechanisms. In addition, the development of so-called high-throughput sequencing technologies has made it possible to study the diversity of their classes. Thus, during the last 20 years, significant efforts have been devoted to the discovery and study of new classes of ncRNAs, their biogenesis and their function. However, the study of these sRNA through sRNA sequencing protocols (sRNA-seq) as well as bioinformatics pipelines have been designed to focus analyses on the sequences considered most important. As a result, it generally appears that sRNA of less than 15 nucleotides (nt) and those derived from ribosomal RNA were almost systematically excluded from the analyses. In this Ph.D. work, we wanted to challenge this belief by preserving the ribosomal RNA (rRNA) in our samples, and by lowering the minimum size window of sequenced RNA to 8 nt. Thanks to this approach, we discovered a new family of exceptionally short RNA that correspond to the 5' end of the 5.8S rRNA, which we called dodecaRNA (doRNA), reflecting the number of core nucleotides (12 nt) shared by its members. For this purpose, we developed a quantitative detection method to confirm our sRNASeq data, and to validate the existence of two doRNAs (i.e., the minimum 12 nt doRNA sequence, and its variant carrying an additional 5' cytosine, C-doRNA). This specific and sensitive method is based on DNA-bridge-assisted ligation of an adaptor at the 5' end of the doRNAs, followed by retrotranscription, and quantitative amplification by qPCR. We were thus able to confirm our sRNA-seq results and determined that both doRNAs may be more abundant than microRNAs. The characterization of these RNAs led us to establish that doRNA and C-doRNA are mainly localized in the cytoplasm of cells and interact with heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNPs) A0, A1 and A2B1, but not Argonaute 2. Finally, the study of the regulation of their expression identified that the level of C-doRNA was increased during serum deprivation, while doRNA was decreased in human prostate cancer cells and tissues compared to normal cells and tissues. More interestingly, we were able to establish through cell culture wound testing that C-doRNA was able to reduce cell migration/proliferation, while do-RNA could function as a global regulator of translation. Among other things, we established that the presence of a binding site for doRNA within the 5'UTR sequence of an mRNA could impact its translation. Although these studies have allowed us to affirm the presence and functionality of RNA below 15 nt, their mechanisms of action, as well as their biogenesis remain to be elucidated. In particular, I will pay close attention in the discussion to the research prospects concerning the hypothesis that a specific methylation of uracil 14 of 5.8S rRNA can be linked to the generation of our doRNA

Le nucléole est un compartiment spécialisé où les ARN ribosomiques (ARNr) sont transcrits, maturent et sont assemblés pour former les sous-unités du ribosome. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, l'ADN ribosomique est transcrit en un précurseur de 35S qui code pour l'ARN 18S de la petite sous-unité ribosomique ainsi que les ARN 5.8S et 25S de la grande sous-unité du ribosome. Le nucléole contient environ 100 petites ribonucléoprotéines nucléolaires (snoRNP), qui sont constituées d'une molécule d'ARN (snoRNA) et de quelques protéines. Les snoRNA forment deux grandes familles: les familles à boîtes C/D et à boîtes H/ACA. Ces snoRNA servent de guides pour des modifications post-transcriptionnelles des ARNr, i.e. méthylation du ribose en 2'-OH (C/D) et pseudouridylation (H/ACA). Le snoRNA va d'abord s'apparier à l'ARNr et les protéines associées au snoRNA vont effectuer les modifIcations. Certains de ces snoRNA sont requis pour des réactions de clivage du précurseur des ARNr; ces clivages servent à éliminer des régions espaceur dans le pré-ARNr. Les snoRNP de la famille H/ACA contiennent quatre protéines essentielles, Cbf5p, Garlp, Nhp2p, et Nop10p. Contrairement aux autres snoRNA H/ACA, snR30 n'a pas de cible pour la pseudouridylation. Par contre, le snoRNA snR30 est essentiel dans les étapes de maturation menant à la production de l'ARNr 18S, ce qui n'est pas le cas des autres snoRNA H/ACA. Le but de cette recherche est de purifier le complexe snR30 et d'identifier ses composantes protéiques. snR30 possède probablement des protéines qui lui sont spécifiques, en plus des quatre protéines H/ACA, et qui contribuent à ses propriétés fonctionnelles uniques, à savoir, son rôle dans la maturation des ARNr. Afin de purifier snR30, l'aptamère SI a été utilisé et le contenu protéique de snR30 identifié par spectrométrie de masse. L'aptamère SI est une courte séquence d'acides nucléiques qui possède une haute affinité et spécificité pour la streptavidine. Cette séquence a été introduite par mutagenèse dirigée par PCR dans la séquence codant pour SNR30 et cette construction S1-SNR30 a été exprimée in vivo à partir d'un vecteur d'expression de levure. Il a ensuite été possible de purifier le complexe S1-snR30 par chromatographie d'affinité utilisant des billes couplées à la streptavidine. Le snoRNA SI-snR30 est associé non seulement aux protéines H/ACA Garlp et Nhp2p mais aussi à plusieurs autres protéines. Ces protéines doivent maintenant être identifiées afin de les caractériser et élucider leur(s) rôle(s) dans la maturation des ARNr. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : SnR30, Nucléole, Ribosome, ARN ribosomique (ARNr), Petit ARN nucléolaire (snoRNA), petite ribonucléoprotéine nucléolaire (snoRNP), H/ACA, Chromatographie d'affinité, Aptamère.

Le nucléole de la levure contient près de 100 petites ribonucléoprotéines nucléolaires (snoRNP), qui sont constituées d'une molécule d'ARN (snoRNA) et de quelques protéines. Les snoRNA forment deux grandes familles : la famille à boîtes C/D et à boîtes H/ACA. Ces snoRNA servent de guides pour des modifications post-transcriptionnelles des ARN ribosomiques (ARNr), c'est-à-dire la méthylation en 2'-OH de riboses (C/D) et la pseudouridylation (H/ACA). Certains de ces snoRNA sont requis pour des réactions de clivage sur le précurseur des ARNr; ces clivages servent à éliminer des régions espaceur dans le pré-ARNr. Contrairement aux autres snoRNA H/ACA, snR30 n'a pas de cible pour la pseudouridylation. Par contre, la snoRNP snR30 est essentielle aux clivages précoces des pré-ARNr menant à la production de l'ARNr 18S. Le but de ces travaux de recherche est de purifier le complexe snR30 afin d'identifier et caractériser ses composantes protéiques pour déterminer leur rôle dans la fonction particulière de snR30. De plus, nous voulons mieux saisir le rôle de snR30 dans la maturation de l'ARNr. Afin d'identifier le contenu protéique de snR30, nous avons mis au point un système de purification permettant d'isoler de façon spécifique snR30; d'une part, nous avons enrichi les échantillons en snoRNP H/ACA en purifiant la protéine H/ACA Garl et, d'autre part, nous avons isolé spécifiquement snR30 grâce à un aptamère d'ARN introduit dans la séquence de snR30. Cette méthode de purification nous a permis de montrer une association entre snR30 et la protéine nucléolaire Nop6, les protéines ribosomiques S9 et S18, ainsi que les histones H2B et H4. Ces protéines interagissent aussi avec d'autres snoRNA. Comme plusieurs éléments suggéraient que Nop6 était impliquée dans la biogenèse des ribosomes, nous avons voulu définir son rôle dans la maturation des ARNr. Nos analyses ont montré que Nop6 localise au nucléole et que cette protéine cosédimente avec snR30 dans un gradient de sucrose. Grâce à des expériences d'extension d'amorces, nous avons démontré que snR30 est nécessaire pour les clivages aux sites A0, A1 et A2 et que l'absence de Nop6 diminue l'efficacité de clivage au site A2. De plus, une analyse par microscopie électronique de cellules déplétées de snR30 indique que ce snoRNA est requis pour la formation du SSU processome, un complexe ribonucléoprotéique nécessaire à la biogenèse de la petite sous-unité du ribosome. L'ensemble de ces résultats suggère que le SSU processome n'est pas seulement composé du snoRNA U3 et de ses protéines associées, mais pourrait contenir plusieurs autres snoRNP, dont snR30. On sait que certaines protéines ribosomiques ont des rôles « extraribosomiques », c'est-à-dire qu'en plus d'être des constituants du ribosome, elles ont d'autres fonctions cellulaires. Comme la protéine ribosomique Rps18 peut être associée à snR30, ceci laisse supposer qu'elle pourrait avoir un rôle dans la maturation des ARNr. Chez la levure, Rps18 est exprimée à partir de gènes dupliqués (RPS18A et RPS18B) qui encodent des pré-ARNm dont la séquence diffère (principalement au niveau de l'intron) mais qui génèrent des protéines de séquences identiques. Afin d'étudier la fonction de Rps18, nous avons généré des souches de levures où l'expression de RPS18A ou RPS18B est modifiée. Nos résultats indiquent que ces protéines sont régulées de manières différentes et qu'elles ont des fonctions cellulaires distinctes. Nous montrons aussi qu'en plus d'être un constituant du ribosome, la protéine S18 est essentielle à la maturation de l'ARNr 18S. Somme toute, nos résultats suggèrent que Rps18B a un rôle plus important dans la maturation des ARNr tandis que Rps18A serait plus impliquée dans l'assemblage des ribosomes. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Nucléole, Ribosome, Ribonucléoprotéine, Ribosomopathies, ARNr

Les mécanismes qui entrent en jeu dans la maturation de l'ARN ribosomique (ARNr) restent toujours obscurs. Dbp4 est une ARN hélicase putative qui fait partie du groupe des hélicases « DEAD-box ». Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, Dbp4 aurait un rôle à jouer dans la maturation du pré-ARNr 35S. Les ARN hélicases ont généralement une activité ATPasique dépendante de la présence d'ARN. De plus, la plupart des hélicases possèdent des domaines supplémentaires en N-et en C-terminal qui pourraient être nécessaires pour l'activité et/ou pour conférer la spécificité pour un substrat. Nous désirons déterminer les caractéristiques biochimiques de Dbp4. Cette enzyme est pourvue d'un très long domaine C-terminal qui contient un motif de liaison protéique « coiled-coil ». La présence de ce motif suggère que Dbp4 pourrait nécessiter l'assistance de protéine(s) cofacteur(s) pour avoir une activité ATPasique et/ou hélicasique. Des tests d'interaction dans le système double hybride de levure ont permis d'identifier une interaction entre Dbp4 et les protéines Bfr2, Esf1 et Enp2. Les conditions optimales pour l'activité ATPasique sont une incubation à 37 °C dans un tampon HEPES à pH 7.5 avec 10 µg d'ARN total de levure. Dbp4 possède une activité ATPasique qui augmente de quatre à cinq fois en présence d'ARN. La protéine Dbp4 recombinante sans la section C-terminale a été produite et des tests d'activité ATPasique ont été effectués. Selon nos observations, la section C-terminale de Dbp4 joue un rôle important pour l'activité ATPasique. Finalement, la production d'anticorps anti-Dbp4 chez le lapin nous a donné deux anticorps, A et B, capables de détecter Dbp4. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Hélicase, ATPase, ARNr, DEAD-box, Dbp4, Saccharomyces cerevisiae, Double hybride et coloration au vert de malachite.

Titre de l'écran-titre (visionné le 26 mars 2024) / La biogenèse des ribosomes est un processus cellulaire important qui se produise dans le nucléole et qui nécessite la participation des trois ARN polymérases nucléaires. L'étape initiale et limitante de ce processus est la transcription de l'ARN ribosomal précurseur (pré-ARNr/47S) contenant les ARN 28S, 18S et 5,8S par l'ARN polymérase I (RPI, également connue sous le nom de Pol1 et POLR1). RPI dispose d'un ensemble dédié de facteurs basaux responsables pour son action : le facteur architectural UBF ou UBTF, le facteur SL1, le facteur d'initiation RRN3 et le facteur de terminaison TTF1. La synthèse de l'ARN ribosomal est étroitement régulée et représente 40 % de la transcription totale des gènes. Le déséquilibre de la synthèse de l'ARN ribosomal a été observé dans de nombreuses maladies comme le cancer. Par conséquent, ce processus est lié à la croissance, la transformation, la prolifération cellulaire et aux actions des suppresseurs de tumeurs et des oncogènes. Par conséquent, l'étude de la régulation transcriptionnelle des ARN ribosomiques revêt une importance cruciale dans la compréhension et le traitement ultérieur de ces maladies. Le génome haploïde humain et murin contient environ 200 copies des gènes de l'ARN ribosomal, l'ADN ribosomal (ADNr). Ces copies d'ADN ribosomique sont disposées en répétitions sur les bras courts des chromosomes acrocentriques. Il est intéressant de noter que seule une fraction des copies d'ADNr est active et qu'un nombre important est épigénétiquement silencieux et hétérochromatique. Cependant, les mécanismes à l'origine de la reconnaissance et de l'inactivation du promoteur de gène de l'ARN ribosomal ne sont pas encore bien compris. Cette thèse propose un modèle d'ajustement induit pour la reconnaissance du promoteur de l'ARN polymérase I et présente les rôles du facteur de terminaison de la transcription I dans la régulation du gène ribosomal. Nous montrons que la coopération entre SL1 et le variant d'épissage UBTF1 génère la spécificité requise pour la reconnaissance du promoteur de l'ADNr dans la cellule. Nous constatons que la suppression conditionnelle de la sous-unité Taf1b de SL1 provoque une déplétion de l'UBTF au niveau des deux promoteurs de l'ADNr, mais pas ailleurs dans l'ADNr. Nous constatons également que même si les variants UBTF1 et -2 se lient dans toute la région exempte de nucléosomes de l'ADNr, seul UBTF1 est présent avec SL1 au niveau des promoteurs. Ainsi, les données suggèrent fortement un modèle d'ajustement induit de reconnaissance du promoteur RPI dans lequel UBTF1 joue un rôle architectural. Parmi les promoteurs ribosomiques, on note la présence du promoteur spacer situé 2 kb en amont du promoteur principal du gène où se lie TTF1. Nous avons montré que cette liaison est importante pour empêcher l'ARN polymérase I de transcrire la région dites « enhancer repeats » interférant ainsi avec l'assemblage du complexe de pré-initiation au niveau du promoteur principal du gène ribosomique via un mécanisme d'occlusion du promoteur induit par un long ARN non codant, inhibant ainsi la transcription de l'ADN ribosomique et cela se produit en réponse à l'activité du suppresseur de tumeur ARF. Le même scénario est observé lors de la différenciation des cellules souches embryonnaires en cellules neuronales où nous avons montré que KLF4 régule la transcription de RPI via la régulation de ses facteurs associés TTF1 et RRN3. En prenant toutes les données ensemble, nous suggérons deux nouveaux mécanismes qui régulent le gène ribosomal : le modèle d'ajustement induit pour la reconnaissance du promoteur RPI et le mécanisme d'occlusion du promoteur induit par un long ARN non codant suite à l'activation du suppresseur de tumeur ARF dans la cellule. / Ribosome biogenesis is an important cellular process occurring in the nucleolus that requires the transcription by all three nuclear RNA polymerases. The initial and rate-limiting step of this process is the transcription of the precursor ribosomal RNA (pre-rRNA/47S) containing the catalytic RNAs 28S, 18S and 5.8S by RNA polymerase I (RPI, also known as Pol1 and POLR1). RPI has a dedicated set of basal factors responsible for its action: the architectural factor UBF or UBTF, the TBP containing factor SL1, the initiation factor RRN3, and the termination factor TTF1. Ribosomal RNA synthesis is tightly regulated and accounts for 40% of total gene transcription. The imbalance of ribosomal RNA synthesis has been observed in many diseases such as cancer. Therefore, this process is linked to cell growth, transformation, proliferation and the actions of tumor suppressors and oncogenes. Consequently, the study of transcriptional regulation of ribosomal RNAs is of crucial importance in the understanding and subsequent treatment of these diseases. The human and mouse haploid genome contain ~200 copies of the ribosomal RNA genes, the ribosomal DNA (rDNA). These ribosomal DNA copies are arranged in tandem repeats on the short arms of acrocentric chromosomes. Interestingly, only a fraction of the rDNA copies is active, and a significant number are epigenetically silenced and heterochromatic. However, the mechanisms behind ribosomal RNA gene promoter recognition and silencing are not yet fully understood. This thesis suggests an induced-fit model for RNA polymerase I promoter recognition and presents the roles played by the transcription termination factor I in regulating the ribosomal gene. We show that cooperation between SL1 and the UBTF1 splice variant generates the specificity required for rDNA promoter recognition. We find that conditional deletion of the Taf1b subunit of SL1 causes a striking depletion of UBTF at both rDNA promoters but not elsewhere across the rDNA. We also find that while both UBTF1 and -2 variants bind throughout the rDNA nucleosome-free region, only UBTF1 is present with SL1 at the promoters. Thus, the data strongly suggest an induced-fit model of RPI promoter recognition in which UBTF1 plays an architectural role. Of the ribosomal promoters, we note the presence of the spacer promoter located 2Kb upstream the main gene promoter where TTF1 binds. We showed that this binding is important to block the RNA polymerase I from transcribing the enhancer repeat region. We further demonstrated that the spacer promoter is the source of a lncRNA that interferes with the assembly of the pre-initiation complex at the main gene promoter via promoter interference or occlusion thereby inhibiting rDNA transcription. The mechanism is proposed to explain the action of the p19ARF tumor suppressor activity in limiting cell growth. The same scenario is observed during ESCs to NPCs differentiation where we showed that KLF4 determines RPI transcription by regulating the genes encoding TTF1 and RRN3. Our data suggest two novel mechanisms that regulate the ribosomal genes: the RPI promoter recognition induced-fit model and the lncRNA-induced promoter occlusion mechanism driven by ARF displacement of TTF1, and further suggests a role for rDNA regulation in differentiation and loss of pluripotency of embryonic stem cells.

Au centre du ribosome, lui-même centre de synthèse de toutes les protéines, se trouve quatre molécules d’ARN, nommées les ARNs ribosomiques. Ces ARNs sont synthétisés dans le nucléole des cellules eucaryotes à partir des gènes répétés en tandem, les gènes d’ARN ribosomiques. Ces gènes nécessitent une régulation très stricte de la transcription des ARN ribosomiques pour permettre un cycle cellulaire contrôlé et surtout contrôlable. En effet, un débalancement de la transcription des ARN ribosomiques a été observée dans de nombreuses maladies comme par exemple le cancer. En conséquence, l’étude de la régulation de la synthèse des ARN ribosomiques est d’une importance cruciale dans la compréhension et subséquemment le traitement de ces maladies. En raison du nombre de répétitions des gènes d’ARN ribosomiques, souvent évaluées aux alentours de 175 par génome haploïde pour les mammifères, l’étude in vivo de leur régulation est difficile par les techniques de mutagénèse. L’approche que j’ai développée durant cette thèse de doctorat est celle de l’immuno-précipitation de chromatine suivie de séquençage à haut débit (ChIP-Seq) en combinaison avec des lignées cellulaires conditionnelles pour des facteurs essentiels de la transcription ribosomique. Les gènes d’ARN ribosomique possèdent la particularité d’être transcrits grâce à une machinerie entièrement dédiée à sa transcription. Ces facteurs généraux de transcription agissent de concert pour effectuer efficacement leur rôle. Dans l’organisme modèle utilisé ici, à savoir Mus musculus, l’ARN polymérase I transcrit ces gènes avec l’aide, lors de l’initiation, des facteurs UBF, Rrn3/TIF-1A et SL-1/TIF-1B. Le facteur de terminaison TTF-1 permet de terminer la transcription de l’ARN précurseur, et joue plusieurs rôles dans la régulation de l’état des gènes. Dans un premier temps, nous avons été amenés à développer, en complément du séquençage à haut débit, une approche de déconvolution des données pour permettre d’améliorer l’interprétation subséquente. Cette approche a été validée par l’amélioration notamment des profils d’immuno-précipitation de chromatine obtenus avec l’ARN polymérase I qui montrent une distribution homogène le long des gènes d’ARNr comme montrée par la technique de Miller Spread. Cette amélioration des données a également pu mettre en avant un double rôle d’UBF en fonction soit de sa complémentarité avec SL-1 soit de son affinité pour les séquences riches en GC de l’ADN. Par la suite nous avons pu mettre en évidence la localisation des régions régulatrices et, en amont de ces régions, d’une barrière nucléosomique permettant de créer et maintenir une zone sans nucléosomes le long des gènes d’ARN ribosomiques. Cette barrière possède deux particularités. La première est d’être identifiée par les marques épigénétiques associées habituellement à l’activation de la transcription comme H3K4me3, H2A.Z ou encore l’acétylation de H2A.Z. La deuxième particularité est d’être indépendante de la présence d’UBF qui est elle-même indépendante de la transcription. Cependant, ce travail n’a pas détecté la présence des marques épigénétiques de l’activation de la transcription le long des gènes d’ARNr remettant en question certaines hypothèses sur la régulation de la transcription ribosomique. Finalement, les études en parallèle dans les cellules souche embryonnaires (mESC) et fibroblastes embryonnaires (MEF) a permis d’identifier 3 catégories de gènes ribosomiques dans une même cellule. Une première forme nucléosomale ou l’ADN est méthylé et hétérochromatique, une deuxième nucléosomale mais non méthylée et finalement une forme transcrite. Une comparaison quantitative de la synthèse d'ARNr dans les mESCs et les MEFs a montré que le nombre de gènes actifs n'est pas un facteur significatif dans la régulation de la synthèse d’ARNr. Dans des cellules souches embryonnaires, tous les gènes sont transcrits en même temps avec une faible efficacité. Dans des cellules différenciées, une faible portion des gènes est transcrite mais très efficacement, cette efficacité étant relié au nombre de polymérase en cours de transcription. Les différents profils d'interaction de Rrn3 et de PolI près du site d'initiation de la transcription suggèrent que cette différence est due à une régulation de l'initiation / At the heart of the ribosome, itself the center of synthesis of all proteins, are four RNA molecules, called ribosomal RNAs. These RNAs are synthesized in the nucleolus of eukaryotic cells from the tandemly repeated genes, the ribosomal RNA genes. A very strict regulation of the transcription of ribosomal RNA needs to be made to allow a controlled and above all a controllable cell cycle. Indeed, the imbalance of ribosomal RNA synthesis has been observed in many diseases such as cancer. Consequently, the study of transcriptional regulation of ribosomal RNAs is of crucial importance in the understanding and subsequent treatment of these diseases. Due to the number of repeats of ribosomal RNA genes, evaluated at around 175 per haploid genome for mammals, the in vivo study of their regulation by mutagenesis techniques is difficult. The approach I developed during this doctoral thesis is that of chromatin immunoprecipitation followed by high throughput sequencing (ChIP-Seq) applied to cell lines conditional for the basal transcription factors. The ribosomal RNA genes have the particularity of being transcribed thanks to an entirely dedicated transcriptional machinery. In mice, these general transcription factors act in concert to perform their role effectively. In the model organism used here, namely Mus musculus, RNA polymerase I transcribes the genes with the help, during initiation, of the factors UBF, Rrn3 / TIF-1A and SL-1 / TIF-1B. The TTF-1 termination factor makes it possible to terminate transcription of precursor ribosomal RNA, and also plays roles in gene regulation. In addition to high-throughput sequencing, we have developed a deconvolution approach to improve the interpretation of ChIP-Seq data. This approach has been validated by the improvement in particular of immunoprecipitation profiles obtained for RNA polymerase I that confirm the electron microscopy images of Miller spread type. This improvement of the data could also highlight a dual role of UBF depending on its complementarity with SL-1 and its affinity for GC-rich sequences of DNA. Subsequently we have been able to highlight the upstream localization of the regulatory regions and of a nucleosome barrier allowing to create and maintain a zone without nucleosomes along the rRNA genes. This barrier has two peculiarities, the first is that it contains the epigenetic marks usually associated with the activation of transcription such as H3K4me3, H2A.Z or the acetylation of H2A.Z. The second particularity is that it is independent of the presence of UBF, which is itself independent of transcription. Challenging certain assumptions about the regulation of ribosomal transcription, our work did not detect the presence of epigenetic markers of transcriptional activation throughout the rRNA gene body. Finally, parallel studies in embryonic stem cells (ESC) and embryonic fibroblasts (MEFs) made it possible to identify 3 categories of ribosomal genes in the same cell. First, a heterochromatic DNA methylated and nucleosomal form, a nucleosomal but non-DNA methylated form, and finally a transcribed form. A quantitative comparison of rRNA synthesis in ESCs and MEFs has shown that the number of active genes is not a significant factor in the regulation of rRNA synthesis. In embryonic cells, all genes are transcribed at the same time with low efficiency. In differentiated cells, a small portion of the genes are transcribed but very efficiently, this efficiency being related to the number of polymerase being transcribed. The different interaction profiles of Rrn3 and PolI near the transcription initiation site suggest that this difference is due to the regulation of initiation.

Dans le but d'élucider les mécanismes de régulation de la transcription de l'ARN ribosomique et de la biosynthèse des ribosomes, deux facteurs de transcription ribosomique, soit UBF et TTF -l, furent étudiés dans le but de mieux caractériser leurs fonctions in vivo. Un modèle , de désactivation conditionnelle du gène codant pour UBF chez la souris fut élaboré. Après l'inactivation d'un allèle chez des animaux hétérozygotes aucun défaut développemental, physique ou comportemental n'a été observé lors d' investigations préliminaires. Un modèle de diminution inductible de TTF-I par le ciblage par shRNAmir fut développé. Des études de marquage métabolique au tritium ont permis de conclure qu'une diminution de TTF -l avait un effet appréciable sur la transcription ribosomique et un effet encore plus marqué sur la maturation des ARN ribosomiques. On voit une inhibition claire et nette de la maturation des ARN ribosomiques et aucune accumulation appréciable du précurseur ce qui indique aussi un problème de transcription. Des études du cycle cellulaire, effectués par ±fluorescence-assisted cell sorting¿, ont permis de détecter un arrêt partiel en G 1 qui se traduit en une diminution de la vitesse de passage de la phase G 1 à G2/M lors d'une diminution de TTF-I. Finalement, un modèle de récupération fut développé en introduisant un vecteur conditionnel capable d'exprimer la forme pleine longueur de TTF-I dans les cellules de diminution conditionnelle. L'induction double et simultanée d'une forme pleine longueur de TTF-I et du shRNAmir ciblant TTF-I permit la récupération de la diminution de TTF -l chez ces cellules. Ce modèle de récupération permit de confirmer que les effets observés étaient dus à la diminution de TTF -l en excluant des effets secondaires.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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