La biogenèse ribosomale débute avec la transcription de l'ARN ribosomal (ARNr). La structure du nucléole, la formation des ribosomes et le recrutement des centaines de protéines et de Small Nucleolar Ribonucleic Acid (snoRNA) qui sont essentiels pour la biogenèse ribosomale dépendent de l'activité transcriptionnelle des gènes d’ARNr. Les génomes haploïdes murins et humains possèdent à peu près 200 copies de gènes d’ARNr présents sur le bras court de cinq chromosomes acrocentriques. Ces loci correspondent aux Nucleolar Organizer Regions (NORs) et restent en majorité hypocondensés par rapport au reste des chromosomes durant la mitose. Au commencement de chaque cycle cellulaire, les nucléoles se reforment autour des gènes d’ARNr actifs. Ces gènes d’ARNr sont transcrits par l'ARN polymérase I, ce qui nécessite la formation d'un complexe de pré-initiation de la transcription (Pre-Initiation Complex, PIC). À partir d'expériences in vitro, deux facteurs basaux pour l'ARN polymérase I ont été identifiés: Selectivity Factor 1 (SL1) et Upstream Binding Factor (UBF). Le complexe SL1 contient la protéine TATA-box Binding Protein (TBP) ainsi que plusieurs TBP-Associated Factor (TAF) qui permettent de reconnaître les séquences promotrices des gènes d’ARNr. Les données existantes à ce jour suggèrent qu'UBF est un facteur architectural qui permet la formation d'une structure nucléoprotéique, l'enhancesome, dans laquelle un dimère d'UBF forme une boucle d'ADN de 360° d'environ 140 paires de bases (pb) d'ADN, et de ce fait, aide à la formation du PIC. UBF a également été impliqué dans la régulation de l'élongation de la transcription. Cependant, il n'a pas encore été déterminé si UBF accomplit ces deux fonctions in vivo et si UBF est essentiel pour la transcription des gènes d'ARNr. Pour résoudre cette question fondamentale, nous avons généré des souris ainsi que des cellules murines qui portent une mutation conditionnelle du gène Ubf. L'inactivation du gène Ubf a entraîné un arrêt développemental au stade morula, ceci révélant l'importance du facteur pour la prolifération des cellules et pour le développement embryonnaire. L'inactivation conditionnelle du gène Ubf en culture cellulaire a mené à l'arrêt de la transcription ribosomale, à l'absence de formation du complexe PIC sur les gènes d’ARNr, à la mise en état inactif des gènes d’ARNr sans méthylation de l'ADN, à l'altération de la structure nucléolaire et à la formation d'une structure nucléaire qui contient les facteurs de l'initiation de la transcription et de la maturation des ARNr mais qui est dépourvue des NORs. L'inactivation conditionnelle d'Ubf dans les cellules a conduit à un arrêt de la prolifération cellulaire et à l'apoptose des cellules de manière indépendante p53, et ceci exclusivement dans les cellules transformées de manière oncogénique. Ces résultats suggèrent qu'UBF constituerait une cible de choix pour la chimiothérapie. / Ribosomal biogenesis starts with transcription of ribosomal RNA (rRNA). Nucleolus structure, ribosomes formation and recruitment of hundreds of proteins and snoRNAs Small Nucleolar Ribonucleic Acid essential for ribosomal biogenesis depend on transcription of rRNA. Human and mouse haploid genomes contain around 200 copies of rDNA genes on the short arms of five acrocentric chromosomes. These loci correspond to the NORs Nucleolar Organizer Regions and stay undercondensed during mitosis as compared with the rest of the chromosomes. At the beginning of each cell cycle, nucleoli are reformed around rDNA genes. rDNA genes are transcribed by RNA polymerase I, which requires the formation of the PIC. Two RNA polymerase I basal transcription factors were identified; SL1 Selectivity Factor 1 and UBF Upstream Binding Factor. The SL1 complex contains the TBP TATA-box Binding Protein protein and the TAF TBP-Associated Factor allowing the promoter sequences recognition on rDNA genes. Data suggest that UBF is an architectural factor that allows the formation of a nucleoproteic structure, the enhancesome, in which a UBF dimer forms a DNA loop of 360° of almost 140 bp of DNA and in this way aids PIC formation. However, UBF has also been implicated in the regulation of transcription elongation. But whether or not UBF actually performs either of these functions in vivo, or indeed is even essential for the transcription of the rRNA genes at all is still unknown. To resolve this fundamental question we have generated mice and mouse cells conditionally lacking the single copy Ubf gene. Inactivation of the Ubf gene in mouse leads to developmental arrest at morula stage, this revealing the factor's importance for cell proliferation and embryonic development. Conditional inactivation of Ubf gene in cell culture leads to shut-down of ribosomal transcription, to failure of PIC formation loss on rDNA genes, to a DNA methylation-independent inactivation of rDNA genes, to nucleolus structure alteration and to the formation of a sub-nuclear structure containing the initiation of transcription and the processing factors lacking the NORs. Conditional inactivation of Ubf gene in cells leads to a proliferation cell arrest and to a p53-independent apoptosis exclusively in oncogenically transformed cells, suggesting that UBF could represent a unique target for chemotherapy.

Dans le but d'élucider les mécanismes de régulation de la transcription de l'ARN ribosomique et de la biosynthèse des ribosomes, deux facteurs de transcription ribosomique, soit UBF et TTF -l, furent étudiés dans le but de mieux caractériser leurs fonctions in vivo. Un modèle , de désactivation conditionnelle du gène codant pour UBF chez la souris fut élaboré. Après l'inactivation d'un allèle chez des animaux hétérozygotes aucun défaut développemental, physique ou comportemental n'a été observé lors d' investigations préliminaires. Un modèle de diminution inductible de TTF-I par le ciblage par shRNAmir fut développé. Des études de marquage métabolique au tritium ont permis de conclure qu'une diminution de TTF -l avait un effet appréciable sur la transcription ribosomique et un effet encore plus marqué sur la maturation des ARN ribosomiques. On voit une inhibition claire et nette de la maturation des ARN ribosomiques et aucune accumulation appréciable du précurseur ce qui indique aussi un problème de transcription. Des études du cycle cellulaire, effectués par ±fluorescence-assisted cell sorting¿, ont permis de détecter un arrêt partiel en G 1 qui se traduit en une diminution de la vitesse de passage de la phase G 1 à G2/M lors d'une diminution de TTF-I. Finalement, un modèle de récupération fut développé en introduisant un vecteur conditionnel capable d'exprimer la forme pleine longueur de TTF-I dans les cellules de diminution conditionnelle. L'induction double et simultanée d'une forme pleine longueur de TTF-I et du shRNAmir ciblant TTF-I permit la récupération de la diminution de TTF -l chez ces cellules. Ce modèle de récupération permit de confirmer que les effets observés étaient dus à la diminution de TTF -l en excluant des effets secondaires.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. [232-250]. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

La biogenèse des ribosomes, aussi appelée la synthèse ribosomale, est un processus cellulaire important se déroulant dans le nucléole et implique la transcription par les trois ARN polymérases nucléaires. L’étape initiale et limitante de ce processus est la transcription des ARNs ribosomaux catalytiques, 28S, 18S and 5.8S, sous la forme d’un long précurseur d’ARN ribosomal (pre-ARNr/47S) par l’ARN polymérase I (RPI). RPI possède un ensemble de facteurs de transcription généraux responsables de son activation. Ces facteurs sont la protéine architecturale UBF, le facteur SL1 qui contient TBP, le facteur d’initiation RRN3 et le facteur de terminaison TTF1. La synthèse de l’ARN ribosomale est finement régulée et correspond à 30-50% de l’ensemble de la transcription de la cellule. De plus, ce processus est lié à la croissance cellulaire, la transformation, la prolifération et à l’activité des facteurs suppresseurs de tumeurs et des oncogènes. UBF et RRN3 sont notamment activés par plusieurs voies de signalisation de croissance cellulaire. Dans les cellules de mammifère, il existe ~200 copies d’ADNr par génome haploïde. Les fragments répétés d’ADN ribosomal sont arrangés en répétition en tandem sur les bras courts des chromosomes acrocentriques. De façon intéressante, dans les cellules somatiques, seulement la moitié des copies d’ADNr sont actives, alors que les autres sont maintenues dans une forme inactive par les modifications épigénétiques et la formation d’hétérochromatine. La raison pour laquelle le génome contient autant de copies et la régulation de leur activité ne sont pas bien comprises. Cette thèse présente l’analyse de l’importance in vivo d’UBF et de RRN3 pour la régulation de la transcription de l’ARNr et pour le maintien de la structure chromatinienne de l’ADNr. Nous avons précédemment analysé la perte de fonction de UBF dans les fibroblastes embryonnaires de souris en utilisant le système de perte de fonction conditionnelle dépendante du tamoxifène. Puisque l’un de nos objectifs était de comparer la fonction de RRN3 dans un modèle similaire, nous avons réanalysé la perte de fonction de RRN3 chez la souris et généré des lignées cellulaires comme préalablement réalisées avec la perte de fonction d’UBF. Nous avons déterminé que RRN3 est essentiel à la préimplantation et le développement est arrêté à E3.5, ce qui contredit les résultats obtenus par un autre groupe qui avait obtenu un arrêt du développement beaucoup plus tardif, à E9.5. Une lignée de fibroblastes embryonnaires de souris inductible au tamoxifène a été créée pour RRN3 de façon similaire à ce qui avait été fait pour UBF. La perte de fonction d’UBF ou de RRN3 inhibe la transcription par RPI. Par contre, nous démontrons que UBF est responsable du recrutement à l’ADNr des autres facteurs associés à RPI et du maintient de l’état ouvert de la chromatine. En comparaison, RRN3 est requis simplement pour le recrutement de RPI. Dans cette étude, nous avons également identifié une région frontalière en amont de l’ADNr formée de H2A.Z, TTF1, CTCF et des modifications d’histones activatrices. Nous avons également découvert que la perte d’UBF entraine une mort cellulaire synchronisée par apoptose, indépendamment de p53 et ce spécifiquement dans les lignées cellulaires transformées. Ce résultat suggère qu’il pourrait être possible de cibler UBF dans le traitement contre le cancer puisque la perte de UBF dans les lignées cellulaires primaires cause un arrêt de prolifération sans entrainer l’apoptose. Finalement, nous avons observé que le niveau d’activité de l’ADNr dans les cellules pluripotentes est différent que dans les cellules différenciées. Des lignées de cellules souches embryonnaires (ESCs) ont été générées à partir des souris conditionnelles pour UBF et RRN3 et nos résultats préliminaires suggèrent que la totalité des gènes de l’ADNr est active dans les cellules pluripotentes. Ce modèle est idéal pour étudier la régulation de l’ADNr ainsi que le rôle de UBF et RRN3 dans cette régulation après l’induction de la différentiation. En résumé, ces résultats permettront de clarifier le rôle in vivo de UBF et RRN3 dans la transcription de l’ARN ribosomal et dans le maintien de l’intégrité de l’ADNr. / Ribosome biogenesis, or the synthesis of ribosomes, is an important cell process occurring in the nucleolus that utilizes transcription by all three nuclear RNA polymerases. The initial and rate-limiting step is the transcription of the catalytic ribosomal RNAs 28S, 18S and 5.8S in the form of a precursor ribosomal RNA (pre-rRNA/47S) by RNA polymerase I (RPI, also known as Pol1 and POLR1). RPI has a dedicated set of basal factors responsible for its activation. These are the architectural factor UBF, the TBP containing factor SL1, the initiation factor RRN3, and the termination factor TTF1. Ribosomal RNA synthesis is tightly regulated and accounts for 30-50% of total gene transcription. As such, this process is linked to cell growth, transformation, proliferation and the actions of tumour suppressors and oncogenes. Notably, UBF and RRN3 are activated by many of the same growth signaling pathways. The human and mouse haploid genome contain ~200 copies of the ribosomal RNA genes, the ribosomal DNA (rDNA). These ribosomal DNA copies are arranged in tandem repeats on the short arms of acrocentric chromosomes. Interestingly, only a fraction of the rDNA copies are active, and a significant number are epigenetically silenced and heterochromatic. The reason for having so many copies and their regulation in vivo by silencing is not yet understood, though it has been connected with genome stability. This thesis presents the analysis of the in vivo requirements for UBF and RRN3 in rRNA transcription and rDNA chromatin structure. We had previously analyzed the loss of UBF in mouse embryonic fibroblasts using tamoxifen-dependent conditional knockout. As we wanted to compare the loss of RRN3 in a similar model, we re-analyzed the RRN3 knockout mice and created cell lines as was performed for the UBF knockout. Importantly, we find that RRN3 is essential for preimplantation and its loss arrests development at E3.5, contrary to previous work that showed a late E9.5 developmental arrest. Using mouse embryonic fibroblast (MEF) cell lines conditional for UBF or RRN3, we found that the loss of either factor prevented RPI transcription. However, we found that UBF was essential for the recruitment of the other RPI transcription factors and the formation of the preinitiation complex, as well as to maintain an open rDNA chromatin structure, while RRN3 was required only for RPI recruitment. These studies allowed us to identify an upstream boundary element on the rDNA formed of H2A.Z, TTF1, CTCF and activating histone marks, which is independent of RPI activity. We also found that UBF loss, but not RRN3 loss, led to a synchronous and massive p53-independent apoptosis, specifically in oncogenically transformed cells. This strongly suggests that drug targeting UBF could be a viable cancer treatment. Finally, we have observed that the rDNA activity status in pluripotent cells differs from that of differentiated cells. Embryonic stem cells (ESCs) were also generated from the mice conditional for UBF and RRN3. Preliminary results indicate that, unlike somatic cells, all the rRNA genes in these and other pluripotent cell lines are potentially active. This makes ESCs and their differentiation an ideal model in which to study the establishment of rDNA silencing and the role of UBF and/or RRN3 in this process. Together these data define the in vivo roles of UBF and RRN3 in ribosomal RNA transcription and suggest mechanisms by which they maintain rDNA integrity and may drive cell differentiation.

La transcription des gènes de l'ARN ribosomique (ARNr) est essentielle à la synthèse des ribosomes qui sont eux-mêmes requis pour la production des protéines et donc de l'ensemble des fonctions cellulaires. Malgré ce rôle fondamental, les mécanismes de la synthèse des ARN ribosomiques sont peu élucidés. Mes travaux ont d'abord porté sur la caractérisation du facteur de liaison en amont UBF (Upstream Binding Factor) dans la régulation de l'activité de l'ARN polymerase I (RPI). UBF lie l'ADN des gènes ribosomiques (ADNr) et forme une structure appelée l'Enhancesome. La phosphorylation par ERK des boîtes HMG1 d'UBF provoque un changement de conformation de l'Enhancesome. La signalisation ERK augmente rapidement la transcription ribosomique, mais ne change pas le nombre de polymerases engagées sur les gènes. La phosphorylation d'UBF par ERK le rend plus permissif au passage de RPI, ce qui en fait un modulateur de l'élongation transcriptionnel dépendant de la signalisation par des facteurs de la croissance. Dans un autre ordre d'idées, la méthylation de l'ADN est associée au silencing épigénétique. Nous avons montré que la perte totale de méthylation CpG suscite une réactivation partielle des gènes ribosomiques silencieux et provoque des défauts prononcés de transcription et de maturation des ARNr. J'ai ensuite démontré que la chromatine est plus accessible qu'à la normale, ce qui permet à l'ARN polymerase II (RPIJ) de se lier et transcrire de façon aberrante sur le locus ribosomique. Je me suis de plus intéressé à TTF-I (Transcription Termination Factor-I), un facteur de transcription régulé par le suppresseur de tumeur ARF et que nous avons observé faire la navette entre le noyau et les gènes ribosomiques. En plus de son interaction avec les gènes ribosomiques, TTF-I est retrouvé aux promoteurs de gènes codants des protéines, bien que sa fonction sur ces gènes reste à déterminer. En outre, j'ai développé un essai d'immunoprecipitation séquentielle de la chromatine des gènes ribosomique afin de disposer d'un outil puissant pour comprendre les différences qui distinguent les gènes actifs et inactifs. Les résultats préliminaires indiquent une absence d'histone et une association d'UBF marquée sur les régions activement transcrites de l'ADNr.

Ribosomal transcription produces RNAs essential for the structure and function of the ribosomes. The up-regulation of this transcription during growth is known to address the increased needs of the cell for proteins and thus for ribosomes. However, the mechanisms involved in this regulation are not well characterized. Our laboratory was the first to demonstrate a direct link between growth and ribosomal transcription. Stimulation of mammalian cells with serum or EGF causes an immediate increase in ribosomal RNA synthesis. This activation is dependant on the ERK pathway and on the phosphorylation of the architectural factor UBF by ERK. However, the increase of transcription resulting from this stimulation is not correlated with an increase in RNA polymerase I loading on the ribosomal genes but is rather explained by a higher elongation rate of the polymerase. We also showed that UBF blocks elongation when it is not phosphorylated and is permissive to it when it is phosphorylated by ERK. These results argue against the actual model suggesting that regulation occurs only at initiation level and demonstrate for the first time the existence of a regulation at the elongation level. Theoretically, ribosomal transcription could also be regulated at the level of gene activation since more than half of the ribosomal genes are silenced at ail times. According to the current view, DNA methylation is involved in the silencing process, but we have found that, at least in human cells, it is only important to silence a certain portion of the ribosomal genes. Loss of methylation following genetic inactivation of both DNA methyltransferase 1 and 3b in human colorectal carcinoma cell line results in a decrease in both ribosomal transcription and proliferation rates and in defects in ribosomal RNA processing and nucleolar structure. Moreover, loss of DNA methylation leads to an ingression of RNA polymerase II in the ribosomal locus thus probably causing the problems observed in these cells. We suggest that both DNA methylation and regulation of the elongation rates are essential mechanisms to maintain a high density of RNA polymerase I elongating complexes on the ribosomal genes in order to exclude RNA polymerase II and ensure an efficient ribosome biogenesis. / La transcription ribosomale synthétise les ARN qui sont au coeur de la fonction et de la structure des ribosomes. L'augmentation de cette transcription en condition de croissance est connue et répond aux besoins accrus de la cellule en protéines et donc en ribosomes. Toutefois, les mécanismes impliqués dans cette régulation étaient inconnus. Notre laboratoire a montré l'existence d'un lien direct entre la croissance et la transcription ribosomale. Nous avons montré que la stimulation de cellules de mammifères par le facteur EGF ou l'ajout de sérum cause une augmentation rapide de la transcription ribosomale. Cette activation est dépendante de la voie ERK qui cible le facteur architectural UBF. Nous avons aussi montré que cette stimulation n'entraîne pas de recrutement massif d'ARN polymérases 1 aux gènes ribosomaux, et ce malgré l'augmentation de la synthèse d'ARN ribosomaux. Par contre, la vitesse d'élongation de la polymérase explique quantitativement cette augmentation et celle-ci est régulée par l'état de phosphorylation d'UBF par ERK. Ces résultats remettent en question le modèle actuel de régulation unique au niveau de l'initiation des transcrits et démontrent pour la première fois l'existence d'une régulation au niveau de l'élongation. La proportion élevée de gènes ribosomaux silencieux suggère que ceux-ci puissent être activés et constituer un troisième niveau de régulation de la transcription ribosomale. La méthylation de l'ADN est suggérée comme étant importante pour l'établissement et le maintien de ces gènes dans un état silencieux. Or, nous avons montré que la méthylation de l'ADN explique l'état silencieux d'une partie et non de la totalité de ces gènes dans des cellules humaines en culture. De plus, nous avons montré que la perte de méthylation, suite à l'inactivation génique de DNMTl et 3b, entraîne une diminution de la transcription ribosomale et de la vitesse de prolifération ainsi que des défauts dans la transformation de TARN précurseur et dans la structure nucléolaire. De plus, la perte de méthylation entraîne une incursion de TARN polymérase II dans le locus ribosomal ce qui cause vraisemblablement les problèmes observés. Nous suggérons que la méthylation de l'ADN et la régulation de l'élongation des transcrits sont des mécanismes essentiels pour le maintien d'une forte densité de complexes en élongation sur les gènes ribosomaux de façon à exclure TARN polymérase II pour ainsi assurer une biogenèse efficace des ribosomes.