Le nucléole est un compartiment spécialisé où les ARN ribosomiques (ARNr) sont transcrits, maturent et sont assemblés pour former les sous-unités du ribosome. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, l'ADN ribosomique est transcrit en un précurseur de 35S qui code pour l'ARN 18S de la petite sous-unité ribosomique ainsi que les ARN 5.8S et 25S de la grande sous-unité du ribosome. Le nucléole contient environ 100 petites ribonucléoprotéines nucléolaires (snoRNP), qui sont constituées d'une molécule d'ARN (snoRNA) et de quelques protéines. Les snoRNA forment deux grandes familles: les familles à boîtes C/D et à boîtes H/ACA. Ces snoRNA servent de guides pour des modifications post-transcriptionnelles des ARNr, i.e. méthylation du ribose en 2'-OH (C/D) et pseudouridylation (H/ACA). Le snoRNA va d'abord s'apparier à l'ARNr et les protéines associées au snoRNA vont effectuer les modifIcations. Certains de ces snoRNA sont requis pour des réactions de clivage du précurseur des ARNr; ces clivages servent à éliminer des régions espaceur dans le pré-ARNr. Les snoRNP de la famille H/ACA contiennent quatre protéines essentielles, Cbf5p, Garlp, Nhp2p, et Nop10p. Contrairement aux autres snoRNA H/ACA, snR30 n'a pas de cible pour la pseudouridylation. Par contre, le snoRNA snR30 est essentiel dans les étapes de maturation menant à la production de l'ARNr 18S, ce qui n'est pas le cas des autres snoRNA H/ACA. Le but de cette recherche est de purifier le complexe snR30 et d'identifier ses composantes protéiques. snR30 possède probablement des protéines qui lui sont spécifiques, en plus des quatre protéines H/ACA, et qui contribuent à ses propriétés fonctionnelles uniques, à savoir, son rôle dans la maturation des ARNr. Afin de purifier snR30, l'aptamère SI a été utilisé et le contenu protéique de snR30 identifié par spectrométrie de masse. L'aptamère SI est une courte séquence d'acides nucléiques qui possède une haute affinité et spécificité pour la streptavidine. Cette séquence a été introduite par mutagenèse dirigée par PCR dans la séquence codant pour SNR30 et cette construction S1-SNR30 a été exprimée in vivo à partir d'un vecteur d'expression de levure. Il a ensuite été possible de purifier le complexe S1-snR30 par chromatographie d'affinité utilisant des billes couplées à la streptavidine. Le snoRNA SI-snR30 est associé non seulement aux protéines H/ACA Garlp et Nhp2p mais aussi à plusieurs autres protéines. Ces protéines doivent maintenant être identifiées afin de les caractériser et élucider leur(s) rôle(s) dans la maturation des ARNr. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : SnR30, Nucléole, Ribosome, ARN ribosomique (ARNr), Petit ARN nucléolaire (snoRNA), petite ribonucléoprotéine nucléolaire (snoRNP), H/ACA, Chromatographie d'affinité, Aptamère.

Le nucléole de la levure contient près de 100 petites ribonucléoprotéines nucléolaires (snoRNP), qui sont constituées d'une molécule d'ARN (snoRNA) et de quelques protéines. Les snoRNA forment deux grandes familles : la famille à boîtes C/D et à boîtes H/ACA. Ces snoRNA servent de guides pour des modifications post-transcriptionnelles des ARN ribosomiques (ARNr), c'est-à-dire la méthylation en 2'-OH de riboses (C/D) et la pseudouridylation (H/ACA). Certains de ces snoRNA sont requis pour des réactions de clivage sur le précurseur des ARNr; ces clivages servent à éliminer des régions espaceur dans le pré-ARNr. Contrairement aux autres snoRNA H/ACA, snR30 n'a pas de cible pour la pseudouridylation. Par contre, la snoRNP snR30 est essentielle aux clivages précoces des pré-ARNr menant à la production de l'ARNr 18S. Le but de ces travaux de recherche est de purifier le complexe snR30 afin d'identifier et caractériser ses composantes protéiques pour déterminer leur rôle dans la fonction particulière de snR30. De plus, nous voulons mieux saisir le rôle de snR30 dans la maturation de l'ARNr. Afin d'identifier le contenu protéique de snR30, nous avons mis au point un système de purification permettant d'isoler de façon spécifique snR30; d'une part, nous avons enrichi les échantillons en snoRNP H/ACA en purifiant la protéine H/ACA Garl et, d'autre part, nous avons isolé spécifiquement snR30 grâce à un aptamère d'ARN introduit dans la séquence de snR30. Cette méthode de purification nous a permis de montrer une association entre snR30 et la protéine nucléolaire Nop6, les protéines ribosomiques S9 et S18, ainsi que les histones H2B et H4. Ces protéines interagissent aussi avec d'autres snoRNA. Comme plusieurs éléments suggéraient que Nop6 était impliquée dans la biogenèse des ribosomes, nous avons voulu définir son rôle dans la maturation des ARNr. Nos analyses ont montré que Nop6 localise au nucléole et que cette protéine cosédimente avec snR30 dans un gradient de sucrose. Grâce à des expériences d'extension d'amorces, nous avons démontré que snR30 est nécessaire pour les clivages aux sites A0, A1 et A2 et que l'absence de Nop6 diminue l'efficacité de clivage au site A2. De plus, une analyse par microscopie électronique de cellules déplétées de snR30 indique que ce snoRNA est requis pour la formation du SSU processome, un complexe ribonucléoprotéique nécessaire à la biogenèse de la petite sous-unité du ribosome. L'ensemble de ces résultats suggère que le SSU processome n'est pas seulement composé du snoRNA U3 et de ses protéines associées, mais pourrait contenir plusieurs autres snoRNP, dont snR30. On sait que certaines protéines ribosomiques ont des rôles « extraribosomiques », c'est-à-dire qu'en plus d'être des constituants du ribosome, elles ont d'autres fonctions cellulaires. Comme la protéine ribosomique Rps18 peut être associée à snR30, ceci laisse supposer qu'elle pourrait avoir un rôle dans la maturation des ARNr. Chez la levure, Rps18 est exprimée à partir de gènes dupliqués (RPS18A et RPS18B) qui encodent des pré-ARNm dont la séquence diffère (principalement au niveau de l'intron) mais qui génèrent des protéines de séquences identiques. Afin d'étudier la fonction de Rps18, nous avons généré des souches de levures où l'expression de RPS18A ou RPS18B est modifiée. Nos résultats indiquent que ces protéines sont régulées de manières différentes et qu'elles ont des fonctions cellulaires distinctes. Nous montrons aussi qu'en plus d'être un constituant du ribosome, la protéine S18 est essentielle à la maturation de l'ARNr 18S. Somme toute, nos résultats suggèrent que Rps18B a un rôle plus important dans la maturation des ARNr tandis que Rps18A serait plus impliquée dans l'assemblage des ribosomes. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Nucléole, Ribosome, Ribonucléoprotéine, Ribosomopathies, ARNr

Résumé: Mémoire présenté à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention du diplôme de maître sciences (M.Sc.) en biochimie, Faculté de médecine et des sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4. Le document présent est un mémoire par article, lequel explorera la fonction d'une protéine liant l'ARN, FMRP, dans la différenciation cellulaire. Cette protéine joue un rôle de premier plan puisque son absence conduit à des anomalies développementales durant la neurogenèse et à une plasticité synaptique déficiente. Ces anomalies sont observées chez la souris KO pour le gène FMR1, mais également dans le cerveau des individus avec le syndrome du X fragile (SXF). Ces derniers dont le gène FMR1 est muté présentent une déficience intellectuelle (DI). Puisque la DI est la principale manifestation du SXF, et que les neurones « normaux » expriment FMRP à des niveaux supérieures à ceux des autres tissus corporels, son rôle a presqu'exclusivement été étudié dans les cellules neuronales. Pourtant, FMRP est une protéine hautement conservée et est exprimée dans presque toutes les cellules du corps. Logiquement, FMRP devrait jouer un rôle important dans tous les tissus l’exprimant à des niveaux de base, bien que son absence dans les tissus ne se manifeste pas cliniquement. Cette polyvalence fonctionnelle est encore plus probable de par le fait que plusieurs ARNm différents ont la possibilité d’interagir avec FMRP puisqu’elle identifie ses cibles par reconnaissance de motifs. L'étude présentée se fonde sur l'hypothèse que FMRP effectue des fonctions de base critiques au développement de tous types de tissus humains, et non seulement dans les neurones. L’hypothèse sera davantage développée. Puis, un modèle innovateur de la différenciation cellulaire non-neuronal sera présenté pour l'étude de FMRP. L'enquête sur la distribution subcellulaire et les interactions dynamiques de cette protéine sera détaillée durant les différents changements morphologiques de la spécialisation et de la maturation cellulaire. Les résultats des expériences seront analysés en profondeur. Puis, un retour sur l'hypothèse en guise des résultats expérimentaux permettra de constater que FMRP semble bien jouer un rôle durant la différenciation cellulaire non-neuronale. Ce rôle est intimement lié à la réorganisation du cytosquelette et à la synthèse protéique locale, régulée dans les complexes mRNPs composés de FMRP et ses cibles d'ARNm qui sont régulés, stabilisés et transportés vers les régions en maturation. Ultimement, plusieurs éléments indiquent que FMRP doit interagir correctement avec de nombreuses molécules, décrites dans ce mémoire, afin de permettre aux cellules de se spécialiser et d'acquérir les caractéristiques désirées au cours d’une différenciation normale. / Abstract: The present article-based memoire will explore the involvement of an important RNA-binding protein, FMRP, in cellular differentiation. This protein is well-known for the developmental anomalies during neurogenesis as well as the loss of synaptic plasticity which occur when its gene, FMR1, is mutated. Since FMRP expression is most pronounced in neurons and because the absence of its expression results in the intellectual deficiency known as the Fragile X Syndrome, FMRP has nearly always been studied in neurons alone. However, FM RP is a highly conserved protein, expressed ubiquitously across the body. Additionally, its influence in cells can be vast since its motif - based RNA recognition renders it capable of binding a variety of transcripts. Logically speaking, FMRP should play a role of first rate importance in the other tissues where it is present. The clinical manifestation of its impact in those tissues is likely to be lessened only by the lower levels of FMRP expressed in the average human cell. The main hypothesis of the current study is that FMRP performs critical but basic functions involved in the development of all human tissues where it is present at basal levels, rather than exerting an impact limited to the nervous system alone. The hypothesis will be further elaborated. An innovative non-neuronal model will be presented for the study of FMRP throughout the differentiation process. The behaviour and dynamic interactions of FMRP during cell specialization and morphological maturation will be investigated. An in-depth analysis of the experimental results will follow. Returning to the hypothesis of the study with these results at hand, it will be concluded that FMRP does indeed appear to play a major role in the differentiation of non-neuronal cells. In fact, FMRP's function seems to be closely linked to cytoskeletal reorganization, as well as local protein synthesis through the formation of mRNP complexes with its target mRNAs, which are stabilized, regulated and transported towards the active areas of the cell in differentiation. Ultimately, it is clear that proper interaction between FMRP and certain types of molecules, described in this memoire, is required for cells to specialize and acquire the characteristics of mature cells through normal differentiation.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les virus ne sont rien de plus que des particules composées de lipides et/ou de protéines qui encapsulent de l'information génétique composée d'ARN ou d'ADN. Au cours du cycle viral, les virus entrent dans la cellule hôte où ils dupliquent leur génome, puis forment de nouvelles particules virales qui ressortiront de la cellule pour se diffuser. Alors que pour produire leurs protéines virales les virus détournent la machinerie cellulaire, ils utilisent pour la plupart leur propre polymérase spécifique pour répliquer leur génome.Les Bunyaviridae sont une grande famille des virus à ARN simple brin segmenté de polarité négative. Les Arenaviridae et les Orthomyxoviridae sont les deux autres familles de ce type. Certains bunyavirus provoquent des maladies humaines graves, comme des fièvres hémorragiques, des encéphalites et des méningites. D'autres infectent des plantes et animaux, posant une menace économique sérieuse en agronomie.Les ARN polymérases ARN-dépendante de virus à ARN négatif segmenté sont des machineries multi-fonctionnelles, capables de répliquer le génome viral et de le transcrire en ARNs messagers. La réplication est effectuée de novo, en utilisant un intermédiaire d'ARN complémentaire de polarité positive, alors que la transcription est initiée par vol de coiffe d'ARN cellulaire. Chaque segment du génome viral est recouvert par des nucléoprotéines et fixé à la polymérase par ses extrémités 3' et 5' conservées. Le complexe ARN viral/nucléoprotéines/polymérase forme une ribonucléoprotéine, qui est l'unité fonctionnelle de la réplication/transcription.L'objectif de mon projet de thèse était la caractérisation structurale et fonctionnelle de la polymérase du virus La Crosse, également nommée protéine L. Ce projet était basé sur l'hypothèse que toutes les polymérases de virus à ARN négatif segmenté pourraient partager une organisation et un mode d'action similaire. Lors de la première année de ma thèse, j'ai tenté de caractériser le domaine C-terminal, que nous supposions être responsable de la fixation de coiffe. Au cours de la deuxième année, j'ai étendu mes recherches sur l'étude de l'interaction entre les extrémités de l'ARN viral et la protéine L (protéine entière et construction tronquée en C-terminal). Confronté à des difficultés pour établir des tests de réplication et de transcription in vitro, j'ai poursuivi mes recherches en troisième année avec l'étude d'interactions et de co-cristallisation entre polymérase et ARN viral. Cela a finalement conduit au résultat principal de ma thèse - la détermination de la structure par cristallographie aux rayons X de la polymérase de virus de La Crosse en complexe avec les extrémités 3' et 5' de l‘ARN viral. La structure obtenue constitue une percée dans le domaine de bunyavirus. Elle révèle – à la différence de ce qui avait été initialement proposé – que les extrémités 3' et 5' de l'ARN se lient dans deux sites séparés et conservés. La liaison de l'extrémité 5' de l'ARN viral stabilise de façon allostérique l'un des motifs catalytiques du site actif de la polymérase. La structure révèle l'existence de deux tunnels séparés pour l'ARN produit et l'ARN matrice de sortir, ce qui suggère que le brin d'ARN naissant est séparé de la matrice et quitte la polymérase comme ARN simple brin. La proximité des tunnels d'entrée et de sortie de la matrice explique comment la polymérase peut se déplacer le long de l'ARN génomique avec une perturbation minimale de la ribonucléoprotéine.En parallèle de la structure de la polymérase du virus La Crosse, les structures des polymérases hétérotrimériques de la grippe A et B en complexe avec l'ARN viral ont également été déterminées au sein du groupe du Dr. Stephen Cusack. La comparaison de l'organisation des polymérases des deux familles et de la nature de leur liaison avec l'ARN viral montre que, malgré une homologie de séquence minimale, des similitudes structurelles sont frappantes. Cela suggère fortement la présence d'un ancêtre commun. / Viruses are not more than particles composed of lipids and/or proteins with genetic information – the viral RNA or DNA genome – embedded inside. In order to be efficient, once they enter the host cell they need to multiply this genetic information, package it into new viral particles and spread out from the cell. While in order to produce viral proteins viruses highjack cellular machinery, for replicating their genome most viruses use their own, specialized polymerases.Bunyaviridae is the largest viral family of segmented negative-strand RNA viruses, comprising also Arenaviridae and Orthomyxoviridae families. Some bunyaviruses are causative agents of severe human diseases including heamorrhagic fevers, encephalitis and meningitis. Others infect a variety of plants and animals posing a significant economic threat to the crop cultivation and cattle breeding.RNA-dependent RNA polymerases of segmented negative-strand RNA viruses are multifunctional machines, able to perform both de novo genome replication via positive-strand cRNA intermediate, and viral mRNA transcription using cap-snatched host-derived mRNA primer. Viral RNA genome of bunyaviruses, arenaviruses, and orthomyxoviruses is divided into three, two, and eight segments respectively. Each segment, coated by nucleoproteins and attached through its conserved 3′ and 5′ ends to the polymerase, constitutes an individual ribonucleoprotein particle – an autonomous RNA synthesis unit.The scope of the PhD project described in this thesis was the structural and functional characterization of the La Crosse orthobunyavirus polymerase, also named the L protein. It was based on the hypothesis that all polymerases of segmented negative-strand RNA viruses share a similar domain organization and mode of action. During the 1st year attempts were made to confirm and characterize a putative C-terminal cap-binding domain. During the 2nd year project was extended to study 3′ and 5′ vRNA ends interactions with the full length and C-terminus truncated L protein. Facing difficulties to establish replication and transcription assays in vitro, vRNA binding studies and co-crystallizastion were continued during the 3rd year. This finally led to the main achievement of the thesis – the x-ray structure of La Crosse orthobunyavirus polymerase in complex with vRNA. Obtained structure is a breakthrough in the bunyavirus field. It reveals – unlike it was initially believed – conserved, sequence specific and separate binding sites for 3′ and 5′ vRNA ends located within the polymerase. The 5′ vRNA end binding allosterically structures one of the conserved catalytic motifs within the polymerase active site. The structure sheds also some new light on bunyaviral replication and transcription mechanisms. There exist two distinct product and template exit channels, suggesting that the nascent RNA strand is separated from the template and leaves the polymerase as the single-strand RNA. Close proximity of the template entry and exit channels explains how the polymerase can translocate along the genomic template with minimal disruption of the RNP.In parallel to the La Crosse polymerase structure, structures of Influenza A and B heterotrimeric polymerases in complex with vRNA were also obtained in Stephen Cusack group. This gave a great opportunity to compare the domain organization and the nature of vRNA binding by viral polymerases belonging to Bunyaviriadae and Orthomyxoviridae families, and proved that despite minimal sequence homology the structural similarities are striking. This strongly suggests an evolutionary common ancestor, which can possibly be shared with non-segmented negative-strand RNA viruses as well.

Les protéines de liaison à l'ARN (PLA) s'assemblent en complexes cytoplasmiques avec les ARNm pour contrôler la traduction locale des ARNm et le transport axonal. Ces processus sont essentiels au maintien de la survie des neurones et leur déficience est impliquée dans le développement de nombreuses maladies neurodégénératives, telles que la SLA. Il a été montré ultérieurement que la déplétion nucléaire de TDP-43, liée à la SLA, entraîne l'accumulation d'une variante épissée alternativement de la ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène A1 (hnRNP A1). Cette isoforme, appelée hnRNP A1B, possède une région désordonnée (RID) et, dans le contexte neuronal, localise dans les neurites et dans le noyau, alors que la hnRNP A1 localise majoritairement dans le noyau. Ceci appui l'hypothèse que la hnRNP A1B peut avoir une fonction cytosolique dans les neurones qui n'est pas partagée avec la hnRNP A1. En outre, les hnRNP A1 et hnRNP A1B sont mutées dans de rares cas de SLA familiale, dont certaines mutations sont spécifiques à la hnRNP A1B. Jusqu'à présent, la littérature se concentre sur l'isoforme hnRNPA1 tandis que peu est répertorié sur la fonction de la hnRNP A1B. Ainsi, cette étude vise à déterminer et caractériser la fonction cytosolique de la hnRNP A1B dans les neurones. Puisque très peu est répertorié sur la hnRNP A1B, il a fallu tout d’abord déterminer des partenaires d’interaction. Ainsi, une immunoprécipitation utilisant un anticorps spécifique à la hnRNP A1B suivi d'une spectrométrie de masse (IP-MS) a été réalisée sur la moelle épinière de souris. Les résultats soulèvent que de nombreux interacteurs de la hnRNP A1B sont associés au trafic intracellulaire dépendant du cytosquelette. Les interactions avec KLC1/KIF5C/Myh9/DyncIHI ont été validées par des tests d'immunoprécipitation et de colocalisation. Aussi, l’impact de certains mutants hnRNP A1B associés à la SLA ont été étudiées au niveau des interactions avec les protéines motrices. Des expériences visant à évaluer comment la hnRNP A1B peut être transportée, ainsi que réguler le transport, sont en cours. Les résultats confirment que la hnRNP A1B peut avoir une fonction cytosolique dans les neurones pour le transport axonal/dendritique de l'ARNm. Des études futures exploreront cette nouvelle fonction dans le contexte de la SLA. / RNA-binding proteins (RBPs) assemble into cytoplasmic complexes with mRNAs to control mRNA local translation and axonal transport. These processes are essential for maintaining neuronal survival and their impairment is implicated in the development of many neurodegenerative diseases, such as ALS. We have discovered that TDP-43 depletion, linked to ALS, drives the accumulation of an alternatively spliced variant of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 (hnRNP A1). This isoform, termed hnRNP A1B, has an elongated prion-like domain (PrLD) and is present in neuronal processes, while hnRNP A1 is not. This finding supports a hypothesis that hnRNP A1B may have a cytosolic function in neurons that is not shared with hnRNP A1. In addition, hnRNP A1 and hnRNP A1B are mutated in rare cases of familial ALS with some mutations specific to hnRNP A1B. To date, the literature has mostly focused on the hnRNPA1 isoform and little is known about hnRNP A1B function. Thus, this study aims to identify and characterize the cytosolic function of hnRNP A1B in neurons. Since very little is known about hnRNP A1B, it was first necessary to identify interaction partners of the protein. Thus, immunoprecipitation using an antibody specific to hnRNP A1B followed by mass spectrometry (IP-MS) was performed on mouse spinal cord. Our results show that many hnRNP A1B interactors are associated with cytoskeletal-dependent intracellular trafficking. We then proceed to validate the interactions with the motor proteins KLC1/KIF5C/Myh9, by immunoprecipitation and proximity ligation assays. In addition, some hnRNP A1B ALS mutants were studied in the context of these interactions. Experiments to evaluate how hnRNP A1B may be transported, as well as regulate transport are currently underway. Our findings support that hnRNP A1B may have a cytosolic function in neurons in mRNA axonal/dendritic transport. Future studies will explore this novel function in the ALS context.

Résumé La Ribonucléase P (RNase P) est une enzyme principalement reconnue pour sa participation à la maturation en 5’des ARN de transfert (ARNt). Cependant, d’autres substrats sont reconnus par l’enzyme. En général, la RNase P est composée d’une sous-unité ARN (le P-ARN, codé par le gène rnpB) qui porte le centre actif de l’enzyme et d’une ou de plusieurs sous-unités protéiques (la P-protéine). Les P-ARN chez toutes les bactéries, la majorité des archéobactéries et dans le génome nucléaire de la plupart des eucaryotes, possèdent généralement une structure secondaire très conservée qui inclut le noyau (P1-P4); l’hélice P4 constitue le site catalytique de l’enzyme et l’hélice P1 apparie les extrémités du P-ARN en stabilisant sa structure globale. Les P-ARN mitochondriaux sont souvent moins conservés et difficiles à découvrir. Dans certains cas, les seules régions de structure primaire qui restent conservées sont celles qui définissent le P4 et le P1. Pour la détection des gènes rnpB, un outil de recherche bioinformatique, basé sur la séquence et le profil de structure secondaire, a été développé dans le laboratoire. Cet outil permet le dépistage de toutes les séquences eucaryotes (nucléaires et mitochondriales) du gène avec une très grande confiance (basée sur une valeur statistique, E-value). Chez les champignons, plusieurs ascomycètes encodent un gène rnpB dans leur génome mitochondrial y compris tous les membres du genre d’Aspergillus. Cependant, chez les espèces voisines, Neurospora crassa, Podospora anserina et Sordaria macrospora, une version mitochondriale de ce gène n’existe pas. Au lieu de cela, elles contiennent deux copies nucléaires du gène, légèrement différentes en taille et en contenu nucléotidique. Mon projet a été établi dans le but d’éclaircir l’évolution de la RNase P mitochondriale (mtRNase P) chez ces trois espèces voisines d’Aspergillus. En ce qui concerne les résultats, des modèles de structures secondaires pour les transcrits de ces gènes ont été construits en se basant sur la structure consensus universelle de la sous-unité ARN de la RNase P. Pour les trois espèces, par la comparaison de ces modèles, nous avons établi que les deux copies nucléaires du gène rnpB sont assez distinctes en séquence et en structure pour pouvoir y penser à une spécialisation de fonction de la RNase P. Chez N. crassa, les deux P-ARN sont modifiés probablement par une coiffe et les extrémités 5’, 3’ sont conformes à nos modèles, ayant un P1 allongé. Encore chez N. crassa, nous avons constaté que les deux copies sont transcrites au même niveau dans le cytoplasme et que la plus petite et la plus stable d’entre elles (Nc1) se retrouve dans l’extrait matriciel mitochondrial. Lors du suivi du P-ARN dans diverses sous-fractions provenant de la matrice mitochondriale soluble, Nc1 est associée avec l’activité de la RNase P. La caractérisation du complexe protéique, isolé à partir de la fraction active sur un gel non dénaturant, révèle qu’il contient au moins 87 protéines, 73 d’entre elles ayant déjà une localisation mitochondriale connue. Comme chez la levure, les protéines de ce complexe sont impliquées dans plusieurs fonctions cellulaires comme le processing de l’ADN/ARN, le métabolisme, dans la traduction et d’autres (par exemple : la protéolyse et le repliement des protéines, ainsi que la maintenance du génome mitochondrial). Pour trois protéines, leur fonction est non déterminée. / Abstract Ribonuclease P (RNase P) is an endonuclease that cleaves 5’- leader sequences from tRNA precursors and a few other small RNAs. In most cases, the enzyme is a ribonucleo-protein complex (ribozyme), containing an RNA subunit (P-RNA; encoded by the rnpB gene) that carries the active centre of the enzyme, plus one or more protein subunits. P-RNAs in Bacteria, Eukarya and Archaea have a highly conserved secondary structure including the core P1 and P4 helices. P4 forms the catalytic site of the ribozyme, and P1 pairs the RNA termini, stabilizing overall structure and protecting from nuclease degradation. For processing of mitochondrial (mt) tRNAs, certain eukaryotic species (e.g., Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans) have separate mtDNA-encoded P-RNAs (of bacterial origin). Mt P-RNAs are often less conserved, and difficult to discover. To identify rnpB genes, we have developed a search tool based on sequence plus secondary structure profiles. It predicts all known eukaryotic (nuclear and organellar) rnpB genes with high confidence (based on E-values). In fungi, many ascomycetes encode a mitochondrial rnpB gene, including all members of Aspergillus. Yet, the closely related Neurospora crassa, Podospora anserina and Sordaria macrospora lack an mtDNA-encoded gene version. Instead, they contain two nuclear gene copies with slightly different sequences. My project aims to elucidate the evolution of mitochondrial RNase P in these three closely related species. We have established secondary structure models based on comparisons with the universal minimum consensus secondary structure for all nuclear gene mtP-RNAs copies in all three species. By comparison of these secondary structure models, we have established that the two nuclear copies of rnpB gene are quite distinct in sequence and structure, suggesting a specialization of function. In N. crassa, both P-RNAs are modified most likely by capping, and 5’- 3’ termini perfectly conform to P-RNA structure models that have an elongated P1 helical pairing. Furthermore, we find that the two nuclear copies of rnpB gene are present at about the same level in the cytoplasm, and that the shorter form of P-RNA (Nc1) translocates into the (soluble) mitochondrial matrix. When tracing P-RNA in different mitochondrial sub-fractions of a native gel, the presence of Nc1 and mitochondrial RNase P activity are associated. A proteomics characterization of a P-RNA complex isolated by native gel electrophoresis reveals that it contains at least 87 proteins, 73 of which are of known mitochondrial localization. Like in yeast, the complex contains proteins potentially involved in other DNA/RNA processing activities, but also in translation, in metabolism, and in protein folding. Only three proteins are of unknown function.

Résumé La Ribonucléase P (RNase P) est une enzyme principalement reconnue pour sa participation à la maturation en 5’des ARN de transfert (ARNt). Cependant, d’autres substrats sont reconnus par l’enzyme. En général, la RNase P est composée d’une sous-unité ARN (le P-ARN, codé par le gène rnpB) qui porte le centre actif de l’enzyme et d’une ou de plusieurs sous-unités protéiques (la P-protéine). Les P-ARN chez toutes les bactéries, la majorité des archéobactéries et dans le génome nucléaire de la plupart des eucaryotes, possèdent généralement une structure secondaire très conservée qui inclut le noyau (P1-P4); l’hélice P4 constitue le site catalytique de l’enzyme et l’hélice P1 apparie les extrémités du P-ARN en stabilisant sa structure globale. Les P-ARN mitochondriaux sont souvent moins conservés et difficiles à découvrir. Dans certains cas, les seules régions de structure primaire qui restent conservées sont celles qui définissent le P4 et le P1. Pour la détection des gènes rnpB, un outil de recherche bioinformatique, basé sur la séquence et le profil de structure secondaire, a été développé dans le laboratoire. Cet outil permet le dépistage de toutes les séquences eucaryotes (nucléaires et mitochondriales) du gène avec une très grande confiance (basée sur une valeur statistique, E-value). Chez les champignons, plusieurs ascomycètes encodent un gène rnpB dans leur génome mitochondrial y compris tous les membres du genre d’Aspergillus. Cependant, chez les espèces voisines, Neurospora crassa, Podospora anserina et Sordaria macrospora, une version mitochondriale de ce gène n’existe pas. Au lieu de cela, elles contiennent deux copies nucléaires du gène, légèrement différentes en taille et en contenu nucléotidique. Mon projet a été établi dans le but d’éclaircir l’évolution de la RNase P mitochondriale (mtRNase P) chez ces trois espèces voisines d’Aspergillus. En ce qui concerne les résultats, des modèles de structures secondaires pour les transcrits de ces gènes ont été construits en se basant sur la structure consensus universelle de la sous-unité ARN de la RNase P. Pour les trois espèces, par la comparaison de ces modèles, nous avons établi que les deux copies nucléaires du gène rnpB sont assez distinctes en séquence et en structure pour pouvoir y penser à une spécialisation de fonction de la RNase P. Chez N. crassa, les deux P-ARN sont modifiés probablement par une coiffe et les extrémités 5’, 3’ sont conformes à nos modèles, ayant un P1 allongé. Encore chez N. crassa, nous avons constaté que les deux copies sont transcrites au même niveau dans le cytoplasme et que la plus petite et la plus stable d’entre elles (Nc1) se retrouve dans l’extrait matriciel mitochondrial. Lors du suivi du P-ARN dans diverses sous-fractions provenant de la matrice mitochondriale soluble, Nc1 est associée avec l’activité de la RNase P. La caractérisation du complexe protéique, isolé à partir de la fraction active sur un gel non dénaturant, révèle qu’il contient au moins 87 protéines, 73 d’entre elles ayant déjà une localisation mitochondriale connue. Comme chez la levure, les protéines de ce complexe sont impliquées dans plusieurs fonctions cellulaires comme le processing de l’ADN/ARN, le métabolisme, dans la traduction et d’autres (par exemple : la protéolyse et le repliement des protéines, ainsi que la maintenance du génome mitochondrial). Pour trois protéines, leur fonction est non déterminée. / Abstract Ribonuclease P (RNase P) is an endonuclease that cleaves 5’- leader sequences from tRNA precursors and a few other small RNAs. In most cases, the enzyme is a ribonucleo-protein complex (ribozyme), containing an RNA subunit (P-RNA; encoded by the rnpB gene) that carries the active centre of the enzyme, plus one or more protein subunits. P-RNAs in Bacteria, Eukarya and Archaea have a highly conserved secondary structure including the core P1 and P4 helices. P4 forms the catalytic site of the ribozyme, and P1 pairs the RNA termini, stabilizing overall structure and protecting from nuclease degradation. For processing of mitochondrial (mt) tRNAs, certain eukaryotic species (e.g., Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans) have separate mtDNA-encoded P-RNAs (of bacterial origin). Mt P-RNAs are often less conserved, and difficult to discover. To identify rnpB genes, we have developed a search tool based on sequence plus secondary structure profiles. It predicts all known eukaryotic (nuclear and organellar) rnpB genes with high confidence (based on E-values). In fungi, many ascomycetes encode a mitochondrial rnpB gene, including all members of Aspergillus. Yet, the closely related Neurospora crassa, Podospora anserina and Sordaria macrospora lack an mtDNA-encoded gene version. Instead, they contain two nuclear gene copies with slightly different sequences. My project aims to elucidate the evolution of mitochondrial RNase P in these three closely related species. We have established secondary structure models based on comparisons with the universal minimum consensus secondary structure for all nuclear gene mtP-RNAs copies in all three species. By comparison of these secondary structure models, we have established that the two nuclear copies of rnpB gene are quite distinct in sequence and structure, suggesting a specialization of function. In N. crassa, both P-RNAs are modified most likely by capping, and 5’- 3’ termini perfectly conform to P-RNA structure models that have an elongated P1 helical pairing. Furthermore, we find that the two nuclear copies of rnpB gene are present at about the same level in the cytoplasm, and that the shorter form of P-RNA (Nc1) translocates into the (soluble) mitochondrial matrix. When tracing P-RNA in different mitochondrial sub-fractions of a native gel, the presence of Nc1 and mitochondrial RNase P activity are associated. A proteomics characterization of a P-RNA complex isolated by native gel electrophoresis reveals that it contains at least 87 proteins, 73 of which are of known mitochondrial localization. Like in yeast, the complex contains proteins potentially involved in other DNA/RNA processing activities, but also in translation, in metabolism, and in protein folding. Only three proteins are of unknown function.

Bien que le Virus Respiratoire Syncytial, responsable de la bronchiolite du nourrisson, soit aujourd’hui un problème de santé publique majeur, il n’existe encore aucun vaccin ou antiviral curatif contre ce pathogène. Le manque de données sur les étapes clés du cycle viral et sur les interactions virus-cellule freine le développement de nouvelles molécules antivirales.Nous avons étudié l’interactome de deux protéines virales : la polymérase L et le facteur de transcription M2-1. Dans ce but, nous avons mis au point un crible s’appuyant à la fois sur des critères d’interactomique et sur des critères fonctionnels.La première étape consistait à identifier des partenaires potentiels de M2-1 et L par des co-immunoprécipitations couplées à une approche de protéomique quantitative. Pour plus de pertinence, ce crible a été réalisé sur cellules infectées, grâce des virus recombinants produits par génétique inverse. Ceci nous a permis d’identifier 45 et 137 partenaires potentiels de L et M2-1 respectivement. Une étude systématique de l’impact de l’inhibition de 15 partenaires potentiels de M2-1 sur la multiplication virale a mis en avant trois candidats : ILF2, PABPN1 et PABPC1.Nous nous sommes par la suite concentrés sur PABPC1. L’inhibition de l’expression de PABPC1 altère la multiplication virale, mais nous n’avons pas pu mettre en évidence un effet spécifique sur la transcription ou la traduction virale. Son interaction avec M2-1 a été confirmée, et le domaine MLLE de PABPC1 a été identifié comme le site de liaison à M2-1. L’interaction entre M2-1 et PABPC1 a été observée à la fois dans le cytoplasme et dans les IBAGs, des sous-structures concentrant les ARNm viraux au sein des corps d’inclusion viraux. Nous avons formulé l’hypothèse que M2-1, liée à PABPC1, accompagne les ARNm viraux après leur sortie des corps d’inclusion. Ceci suggère un rôle de M2-1 dans le devenir des ARNm viraux en aval de leur transcription. / Although the Respiratory Syncytial Virus, responsible of bronchiolitis in infants, represents a major public health problem, there are currently no vaccine or curative antiviral directed against it. The lack of information on key steps of its viral cycle and on virus-cell interactions hinders the development of new antiviral molecules.We chose to study the interactome of two viral proteins: the polymerase L and the transcription factor M2-1. To do so, we developed a screen based on interactomic and functional criteria.The first step consisted in identifying potential binding partners of M2-1 and L by co-immunoprecipitations coupled to quantitative proteomics. For better relevance, this screen was realised on infected cells, thanks to recombinant viruses produced by reverse genetics. 45 and 137 potential binding partners of M2-1 and L respectively were thus identified. A systematic study of the inhibition of 15 potential partners of M2-1 and its impact on viral multiplication enabled the selection of three candidates: ILF2, PABPN1 and PABPC1.We chose to concentrate on PABPC1. The inhibition of PABPC1’s expression reduces viral multiplication, but no specific effect on viral transcription or translation was brought to light. Its interaction with M2-1 was confirmed, and the MLLE domain of PABPC1 was identified as the M2-1 binding site. The interaction between M2-1 and PABPC1 was observed both in the cytoplasm and in IBAGs, substructures of viral inclusion bodies where viral mRNA accumulate. We formulated the hypothesis that M2-1, with PABPC1, stays with viral mRNA after leaving inclusion bodies and during their translation. This suggests a role for M2-1 in the fate of viral mRNA downstream of transcription.