Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La RNase P est impliquée dans la maturation des ARNt en libérant l’extrémité 5’ leader des précurseurs d’ARNt. Jusqu’à récemment, il était admis que cette enzyme soit universellement conservée en tant que complexe ribonucléoprotéique. La rupture avec le modèle établi est venue avec l’identification d’une RNase P uniquement protéique dans les mitochondries humaines et chez les plantes. Ces protéines, nommées PRORP (PROteinaceous RNase P), présentent trois paralogues chez Arabidopsis, qui sont localisés soit dans les organelles (PRORP1), soit dans le noyau (PRORP2 et 3). Des tests d’activité in vitro montrent que les protéines PRORP possèdent seules une activité RNase P. L’étude de lignées ADN-T indique que la fonction des protéines PRORP est essentielle et la fonction de PRORP2 et 3 est redondante. L’analyse des lignées de dérégulation montre que les protéines PRORP possèdent une diversité de substrat et que la RNase MRP, une autre ribonucléoprotéine, n’est pas impliquée dans la maturation des ARNt. Ainsi les protéines PRORP seraient bien les seules enzymes impliquées dans la maturation de l’extrémité 5’ des ARNt chez Arabidopsis. / RNase P is involved in the maturation of tRNA precursors by cleaving their 5’ leader sequences. Until recently this enzyme was considered to be universally occurring as a ribonucleoprotein complex. The breakthrough from the existing model came with the identification of protein-only RNase P in human mitochondria as well as in plants. These proteins that we called PRORP (PROteinaceous RNase P) have three paralogs in Arabidopsis, which are localised in organelles (PRORP1) and nuclei (PRORP2 and 3). We have shown that PRORP proteins have RNase P activity in vitro as single proteins. In vivo the functions of PRORP proteins are essential and the function of PROPR2 and 3 are redundant. PRORP down-regulation mutants, show that PRORP proteins have a variety of other substrates and RNase MRP, another ribonucleoprotein, is not involved in the tRNA maturation. Results show that PRORP proteins would be the only enzymes responsible for RNase P activity in Arabidopsis.

Au cours de ces 10 dernières années une nouvelle classe de petits ARN non-codants nommés "tRNA-derived fragments" (tRFs) a été caractérisée. Tandis que le rôle canonique des tRNA est bien connu, les raisons pour lesquels des fragments de tRNA s'accumulent dans la cellule restent inconnues. Actuellement, peu d'informations sont disponibles sur leurs biogenèses et leurs rôles biologiques, mais les preuves montrant leur importance dans la régulation de l'expression des gènes augmente régulièrement. Cependant, peu de données sont disponibles chez les plantes. A l'aide d’expérience de "deep-sequencing" et de northern blot nous avons confirmé l'existence d'une grande population en tRFs d'origine variée. A la suite de ces observations, trois questions sont établies. Tout d'abord, quelles sont les enzymes responsables de la biogenèse des tRFs. Ensuite, où les tRFs sont générés. Enfin, est-ce que les tRFs sont des sous-produits de la dégradation des tRNA ou ont-ils une fonction biologique? / During the last decade, a new class of small non-coding RNAs called tRNA-derived fragments (tRFs) has emerged. Whilst the canonic role of tRNA is well-known, the reason(s) why stable tRFs remains in the cell is unknown. Indeed, the number of tRFs has rapidly increased in various evolutionary divergent organisms. To date, only few data on their biogenesis and on their biological roles is known but their importance in the regulation of gene expression and in cell life is expanding. In plants, the existence of tRFs has also been reported but only few data are available. Using deep-sequencing on various small RNA libraries from Arabidopsis thaliana and Northern blots experiments, we confirmed the existence of a large but specific population of tRFs. Following these observations, three questions are addressed. First, what are the enzymes responsible for tRFs biogenesis, second where are tRFs generated and third, are tRFs merely degredation by-products or do they have biological functions?

Mon projet a porté sur la caractérisation du mécanisme moléculaire des enzymes d'arenavirus (une 3'-5' exoribonucléase et une endonuclease) impliquées dans l'inhibition de la réponse innée IFN de type I et dans le vole de coiffe respectivement, et le développement d'une stratégie thérapeutique basée sur leur structures. Premièrement, j'ai résolu deux structures cristallographiques à haute résolution du domaine exoribonucléases du virus Mopeia (NP-exo MOPV) -un homologue du virus Lassa pathogène- en complexe avec deux ions différents. Ensuite, j'ai effectué une caractérisation fonctionnelle de l’activité exoribonucléase 3'-5' codée par ce domaine. Une corrélation entre la structure et la fonction de NP-exo MOPV démontre que; L’activité exoribonucléase 3'-5' est conservée chez les arenavirus pathogènes ainsi que chez les non-pathogènes. J'ai démontré pour la première fois que l'exoribonucléase est capable d'exciser un ARN misapparié, suggérant ainsi une potentielle activité de correction d'erreur par cette enzyme. Avec la structure de NP-exo MOPV, j'ai développé une stratégie in silico pour identifier des inhibiteurs potentiels spécifiques contre son activité et un inhibiteur a était identifié.En parallèle, nous avons résolu deux structures cristallographiques du domaine de l'endonuclease du virus de la LCMV en complexe avec deux ions catalytiques et deux composés appartenant a la famille des diketo. En résumé, ce travail éclaircit le rôle des exoribonucléases de la famille d'Arenaviridae allant de l’évasion de l'immunité innée à son implication directe dans la réplication. Il ouvre également la voie au développement des inhibiteurs contre ces nucléases. / My PhD work focused on the characterization of the molecular mechanism of two arenavirus enzymes - a 3'-5' exoribonuclease and an endonuclease - implicated in type I IFN suppression and mRNA cap-snatching respectively and the design of a structure based-drug strategy against them. First I solved two high resolution crystal structures of the exoribonuclease domain of Mopeia virus (NP-exo MOPV) -a non pathogenic homologue of the highly pathogenic Lassa virus- in complex with different metal ions. Next I performed an in depth functional characterization of the 3'-5' exoribonuclease activity encoded by this domain. By correlating the structure and function of NP-exo MOPV, I showed that; the 3'-5' exoribonuclease activity is conserved in pathogenic as well as in non-pathogenic arenaviruses. Also, I showed for the first time that this enzyme is able to excise a mismatched RNA suggesting that, arenaviruses might posses a mechanism to limit error incorporation by the RdR polymerase during replication. Using the crystal structure of NP-exo MOPV I designed a structure-based strategy to identify potential inhibitors specific for the 3'-5' exoribonuclease activity and have identified a potential inhibitor.Alongside, we solved two crystal structures of the endonuclease domain of LCMV in complex with two catalytic ions and two compounds belonging to the diketo family.In conclusion, this work has a deep implication extending the role of the Arenaviridae exoribonuclease from innate immunity evasion to direct implication in replication. It also paves the way for the development of inhibitors against these arenavirus nucleases.

Les sites apuriniques/apyrimidinique (AP) représentent une forme de dommage à l’ADN hautement mutagène et ce type de dommage peut survenir spontanément ou être induit par une variété d’agents. Afin de préserver la stabilité génomique, deux familles d’endonucléases de type AP, endo-IV et exo-III, sont nécessaires pour contrecarrer les effets mutagènes des sites AP. Malgré l’identification de membres des deux familles dans plusieurs organismes unicellulaire tels que E.coli et S. cerevisiae, aucun membre de la famille endo-IV n’a été identifié chez les organismes multicellulaires à l’exception de C. elegans et de C. briggsae. Nous avons donc décidé d’investiguer l’importance biologique de APN-1 chez C. elegans par l’utilisation d’une approche de knockdown du gène. Dans notre étude, nous avons montré que le knockdown du gène apn-1 chez C. elegans, en utilisant des ARN d’interférence (ARNi), cause une accumulation de mutations spontanées et induites par des drogues résultant en un délai de l’éclosion des œufs ainsi que par une diminution de la survie et de la longévité des vers adultes. De plus, nous avons montré que cette accumulation de mutations mène à un délai dans la progression du cycle cellulaire durant l’embryogénèse, représentant possiblement une explication du délai dans l’éclosion des œufs. Nous avons montré qu’il y avait une augmentation du niveau de mutations dans la gorge des vers, sans toutefois pouvoir confirmer la distribution de APN-1 qui possède une étiquette GFP. Les animaux transgéniques APN-1-GFP n’exprimaient pas suffisamment de la protéine de fusion pour permettre une visualisation à l’aide d’un microscope à fluorescence, mais la protéine a été détectée par immunobuvardage de type western. Les animaux transgéniques APN-1-GFP étaient instables et avaient des phénotypes concordants avec les défauts génétiques. En conclusion, il semble que C. elegans aie évolué afin de retenir un niveau de base de APN-1 jouant ainsi un rôle versatile afin de maintenir l’intégrité génétique d’autant plus que cet organisme semble manquer plusieurs enzymes de la voie de réparation par excision de base. / Apurinic/apyrimidinic (AP) sites are a form of highly mutagenic DNA damage that arise either spontaneously or by a variety of DNA damaging agents. To preserve genomic stability two AP endonuclease families, endo-IV and exo-III, evolved to counteract the mutagenic effect of AP sites. While members of both families were identified in multiple unicellular organisms, notably E. coli and S. cerevisiae, no members of the endo-IV family were identified in multicellular ones, with the exception of C. elegans and its close relatives, particularly C. briggsae. We set out to investigate the biological importance of APN-1 in C. elegans using gene knockdown approach. In our study, we showed that the knockdown of C. elegans apn-1 gene, using RNAi causes the accumulation of spontaneous and drug induced mutations, resulting in a delay in egg hatching, decreased survival and longevity. Furthermore, we have showed that the accumulated mutations lead to delays in cell cycle progression during early embryogenesis, thus providing a possible explanation for the observed delay in hatching. Although we showed increased mutations in the gut of the worm, we were unable to confirm APN-1 distribution tagged with GFP. The transgenic APN-1-GFP animal did not express enough of this fusion protein to be visualized by fluorescent microscopy, although it was detected by Western blot analysis. The transgenic animals over-expressing APN-1-GFP were unstable and showed phenotypes consistent with genetic defects. In conclusion, it would seem that C. elegans has evolved to retain a balanced level of APN-1, which plays a versatile role in maintaining genetic integrity, since this organism lacks a full complement of the enzymes in the base-excision repair pathway.

Les sites apuriniques/apyrimidinique (AP) représentent une forme de dommage à l’ADN hautement mutagène et ce type de dommage peut survenir spontanément ou être induit par une variété d’agents. Afin de préserver la stabilité génomique, deux familles d’endonucléases de type AP, endo-IV et exo-III, sont nécessaires pour contrecarrer les effets mutagènes des sites AP. Malgré l’identification de membres des deux familles dans plusieurs organismes unicellulaire tels que E.coli et S. cerevisiae, aucun membre de la famille endo-IV n’a été identifié chez les organismes multicellulaires à l’exception de C. elegans et de C. briggsae. Nous avons donc décidé d’investiguer l’importance biologique de APN-1 chez C. elegans par l’utilisation d’une approche de knockdown du gène. Dans notre étude, nous avons montré que le knockdown du gène apn-1 chez C. elegans, en utilisant des ARN d’interférence (ARNi), cause une accumulation de mutations spontanées et induites par des drogues résultant en un délai de l’éclosion des œufs ainsi que par une diminution de la survie et de la longévité des vers adultes. De plus, nous avons montré que cette accumulation de mutations mène à un délai dans la progression du cycle cellulaire durant l’embryogénèse, représentant possiblement une explication du délai dans l’éclosion des œufs. Nous avons montré qu’il y avait une augmentation du niveau de mutations dans la gorge des vers, sans toutefois pouvoir confirmer la distribution de APN-1 qui possède une étiquette GFP. Les animaux transgéniques APN-1-GFP n’exprimaient pas suffisamment de la protéine de fusion pour permettre une visualisation à l’aide d’un microscope à fluorescence, mais la protéine a été détectée par immunobuvardage de type western. Les animaux transgéniques APN-1-GFP étaient instables et avaient des phénotypes concordants avec les défauts génétiques. En conclusion, il semble que C. elegans aie évolué afin de retenir un niveau de base de APN-1 jouant ainsi un rôle versatile afin de maintenir l’intégrité génétique d’autant plus que cet organisme semble manquer plusieurs enzymes de la voie de réparation par excision de base. / Apurinic/apyrimidinic (AP) sites are a form of highly mutagenic DNA damage that arise either spontaneously or by a variety of DNA damaging agents. To preserve genomic stability two AP endonuclease families, endo-IV and exo-III, evolved to counteract the mutagenic effect of AP sites. While members of both families were identified in multiple unicellular organisms, notably E. coli and S. cerevisiae, no members of the endo-IV family were identified in multicellular ones, with the exception of C. elegans and its close relatives, particularly C. briggsae. We set out to investigate the biological importance of APN-1 in C. elegans using gene knockdown approach. In our study, we showed that the knockdown of C. elegans apn-1 gene, using RNAi causes the accumulation of spontaneous and drug induced mutations, resulting in a delay in egg hatching, decreased survival and longevity. Furthermore, we have showed that the accumulated mutations lead to delays in cell cycle progression during early embryogenesis, thus providing a possible explanation for the observed delay in hatching. Although we showed increased mutations in the gut of the worm, we were unable to confirm APN-1 distribution tagged with GFP. The transgenic APN-1-GFP animal did not express enough of this fusion protein to be visualized by fluorescent microscopy, although it was detected by Western blot analysis. The transgenic animals over-expressing APN-1-GFP were unstable and showed phenotypes consistent with genetic defects. In conclusion, it would seem that C. elegans has evolved to retain a balanced level of APN-1, which plays a versatile role in maintaining genetic integrity, since this organism lacks a full complement of the enzymes in the base-excision repair pathway.