La double hélice d’ADN est une structure stable qui assure à la fois la sauvegarde et la transmission de l’information génétique. Pour accéder à cette information, une vaste famille d’enzymes multifonctionnelles appelées hélicases réalise la séparation des bases complémentaires de l’ADN. Certaines de ces hélicases sont associées chez l’homme à des syndromes de prédisposition au cancer. C’est le cas du syndrome de Bloom (BS), une maladie génétique à transmission récessive qui se traduit par une augmentation de l’instabilité génétique mais où aucun phénomène d’haplo-insuffisance ou de dominance négative n’est constaté chez les porteurs hétérozygotes. On reconnait pourtant que la protéine du syndrome de Bloom (BLM) adopte une structure multimérique in vitro mais sans que l’expression chez certains hétérozygotes d’une enzyme inactive ne soit considérée comme un facteur à risque. Pour expliquer ce paradoxe, nous avons étudié la structure de l’enzyme BLM et constater qu’elle fonctionne sous la forme d’un monomère, un résultat nouveau qui justifie mieux pourquoi ces formes inactives n’influence pas le degré de prédisposition au cancer. D’autre part, la toxicité cadmium est susceptible d’avoir un lien direct avec l’inactivation de l’hélicase BLM car les cellules exposées au cadmium présentent des analogies avec celles des patients atteints du syndrome de Bloom. Effectivement, nous avons observé qu’in vitro, de faibles concentrations de cadmium réduisent les activités de cette hélicase en induisant son oligomérisation. Ces travaux apportent des informations nouvelles sur le mécanisme moléculaire de l’hélicase BLM et soulignent son importance dans le maintien de l’intégrité du génome. / The DNA double helix is a stable structure that ensures both the protection and transmission of genetic information. To access this information, a large family of multifunctional enzymes called helicases performs the separation of complementary bases of DNA. Some of these helicases in humans are associated with cancer predisposition syndromes. This is the case of Bloom syndrome (BS), a recessive genetic disease that results in an increase in genetic instability but where no phenomenon of haploinsufficiency or dominant negative is found in carriers heterozygotes. Yet we recognize that the Bloom syndrome protein (BLM) adopts a multimeric structure in vitro, but the expression among some heterozygotes of an inactive enzyme is not considered as a risk factor. To explain this paradox, we studied the structure of the BLM and find that it works as a monomer, a new result which justifies why most inactive forms does not influence the degree of cancer predisposition. On the other hand, cadmium toxicity is potentially linked to the inactivation of the BLM helicase as cells exposed to cadmium present analogies with those of patients with Bloom syndrome. Indeed, we observed in vitro, that low concentrations of cadmium reduce helicase activity by promoting its oligomerization. These studies provide new information on the molecular mechanism of the BLM helicase and emphasize its importance in maintaining genome integrity.

L'objectif principal de chaque forme de vie à transmettent fidèlement aux descendants ainsi que les renseignements génétiques auto - survie. Agents endogènes et environnementales en attaque ce processus. Pour résister à ces menaces et protéger le génome intégré, les cellules ont développé des systèmes permettant de détecter leur présence et l'adn de signalisation des dommages - intérêts, la médiation leur réparation. Notre étude porte sur un patient nés de parents consanguins présentant une insuffisance médullaire précoce, les anomalies de développement (microcéphalie et longueur des télomères caractéristiques dimorphes) EBV-B fibroblastes et lignées cellulaires ont été peu sensible à la MMC, mais a montré une forte sensibilité à la phléomycine et IR, plaidant pour un défaut de réparation de l'adn dans ce patient. Cela a également été confirmé par la persistance de foyers 53BP1 après ça. L'ensemble des études et exome genome - wide association a révélé un séquençage exon 13 mutations homozygotes est hérité de l'adn codant pour la ERCC6l2 putatif du poids RAD26l hélicase. La forme de ERCC6l2 décrits dans les bases de données n'a pas compléter le phénotype cellulaire in vitro. Une analyse a révélé une alternative possible in silico isoforme de ERCC6l2 850aa contenant un complément 6 - exons codant la réalité qui était assuré par le clonage moléculaire. On appelle cette autre isoforme hebo. La sensibilité des cellules à hebo maintenant complété la phléomycine, validant ainsi les identifié la mutation. Les deux ercc6l2 courte et hebo est exprimée de façon ubiquiste, mais seulement hebo est localisée dans le noyau. Des expériences ont démontré que les micro - irradiation hebo est recruté pour des lésions de l'adn. Ni le ercc6l2 court, ni ce formulaire auquel était annexé un signal - localiser d'adn SV40 sna dommages dans ces expériences. Nous avons exploré davantage que le recrutement de hebo dépend de nbs 1. / The main objective of every life form is to faithfully transmit genetic information to offspring as well as self-survival. Various endogenous and environmental agents constantly assault this process. To resist these threats and to protect the genome integrality, cells have evolved systems capable of detecting DNA damages, signaling their presence and mediating their repair. Our study focuses on a patient born from consanguineous parents presenting with early bone marrow failure (BMF), developmental anomalies (microcephaly and dimorphic features) but normal telomere length. Fibroblasts and EBV-B cell lines were slightly sensitive to MMC but showed a marked sensitivity to phleomycin and IR, arguing for a DNA repair defect in this patient. This was also confirmed by the persistence of 53BP1 foci following IR. Genome wide association studies and whole exome sequencing revealed an inherited homozygous nonsense mutation in exon 13 of ERCC6L2 coding for the putative DNA helicase Rad26L. Unexpectedly, the wt. form of ERCC6L2 described in the databases did not complement the cellular phenotype in vitro. An in silico analysis revealed a possible alternative isoform of ERCC6L2 containing additional 6 C-terminus exons encoding 850aa, the reality of which was ascertained by molecular cloning. We named this alternative isoform Hebo. The Hebo now complemented the cellular sensitivity to phleomycin, thus validating the identified mutation. Both ERCC6L2-short and Hebo are ubiquitously expressed, but only Hebo is localized into the nucleus. Micro irradiation experiments demonstrated that Hebo is recruited to DNA lesions. Neither the ERCC6L2-short, nor this form to which was appended an SV40 nls signal did localize to DNA damages in these experiments. We further explored that the recruitment of Hebo is dependent on NBS1 manner.

Une meilleure connaissance des déterminants viraux et cellulaires impliqués dans la régulation de l’expression lentivirale est essentielle pour (i) maitriser l’expression d’un transgène dans le cadre d’un transfert de gène et (ii) mieux comprendre l’absence/la perte de l’expression du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) observé en cas de latence virale après infection. Dans ce contexte, les facteurs cellulaires impliqués dans la reconnaissance et la réparation des cassures de l'ADN, activés dès les étapes précoces du cycle viral, pourraient participer au contrôle de l’expression rétrovirale. Dans la première partie de cette étude, nous avons généré une collection de vecteurs lentiviraux codant le transgène green fluorescent protein (gfp) avec des design variés : promoteur du VIH-1 [long terminal repeat (LTRs)] ou d’origine hétérologue [e.g., promoteur viral CMV (cytomegalovirus), ou humain PGK (phosphoglycerate kinase)], intégrase native ou mutée, LTRs natifs ou self inactivating (SIN). En particulier, nous avons caractérisé l’impact de l’insertion de différentes séquences hétérologues au sein des SIN-LTRs sur l’expression du transgène gfp au cours du temps dans un contexte compétent ou déficient pour l’intégration. Nous avons mis en évidence un phénomène de modulation du niveau d’expression du transgène (d’un facteur 0,3 à 1,8; comparé aux vecteurs sans insertion) qui est dépendant de la séquence insérée et de son orientation. L’expression transgénique résulterait donc d’une balance coûts/bénéfices associés à l’insertion d’éléments aux extrémités des vecteurs qui pourrait déterminer le niveau d’expression du transgène à partir de vecteurs modifiés. Dans la seconde partie, nous avons réalisé une analyse systématique et comparative de l’expression lentivirale au sein des cellules humaines de carcinome de côlon HCT 116 déplétées pour le complexe Ku. Ce complexe, qui est essentiel à la survie chez l’homme et est impliqué dans les processus de réparation de l’ADN, a été identifié comme une cible anti-VIH potentielle. Nous avons mis en évidence que la déplétion en Ku induit une diminution de l’expression précoce du VIH-1 de façon spécifique du LTR et indépendante de Tat. Même si l’action de Ku nécessite l’intégration du VIH-1, sa déplétion ne modifie pas l’efficacité d’intégration virale mais agit plutôt au niveau transcriptionnel. Da façon importante, la réactivation de l’expression du transgène après traitement par l’activateur de NF-κB (Nuclear Factor κB), le TNFα (tumor necrosis factor α) ou un inhibiteur des déacétylases d’histones, la trichostatine A est favorisée par la déplétion en Ku. A l’inverse, en présence d’un niveau normal en Ku, les cellules exprimant le VIH-1 seraient contre-sélectionnées dans le temps. Ainsi, la déplétion en Ku pourrait promouvoir l’établissement d’un état (reactivable) de latence transcriptionelle associé à une moindre contre-sélection des cellules transduites. Les résultats issus de ce travail de thèse démontrent que l’expression lentivirale varie en fonction de nombreux paramètres, dont (i) le design des vecteurs, (ii) le type cellulaire transduit et son fond génétique, et (iii) le temps écoulé depuis la transduction, reflétant ainsi des interactions différentielles entre le vecteur et son hôte. / An improved knowledge of the viral and cellular determinants implicated in the regulation of the lentiviral gene expression is crucial (i) for a better control of transgene expression in strategies designed for gene transfer and (ii) for uncovering the mechanisms of viral latency observed after infection with the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and accounting for the absence/loss of HIV-1 expression. Cellular factors involved in the mechanism of detecting/repairing DNA lesions are largely activated during the initial steps of viral cycle and, thus, may participate in the control of lentiviral expression. In the first part of this study, we generated a set of lentiviral vectors encoding for the transgene green fluorescent protein (gfp) with various design: the original promoter [long terminal repeat (LTRs)] or of heterologuous origins (e.g., the viral cytomegalovirus, CMV or the human phosphoglycerate kinase, PGK), wild-type or mutated integrase and wild-type or self inactivating (SIN) LTRs. By taking advantage of these constructs, we characterized the impact of the insertion of distinct heterologuous sequences within SIN-LTRs on the expression of gfp over the time in conditions of proficiency or deficiency for the integration. We put in evidence a phenomenon of modulation of the level of the transgene expression due to the insertion (by a factor of 0.3 to 1.8, as compared to vectors without insert) that was dependant from the nature and/or the orientation of the insert. We speculate that a balance between the costs and the benefits associated to insertion at the extremities of lentiviral vectors may dictates the level expression of transgene from this engineered construct.In the second part, we performed a systematic and comparative analysis of the lentiviral expression on human HCT 116 colon carcinoma cells depleted from the complex Ku. This complex, which is essential for the survival in humans and has a described role in DNA repair process, has been previously identified as a potential target against HIV-1. Here, we showed that Ku depletion induced a decrease of the HIV-1 early expression in a fashion that was specific for LTR and independent from Tat. Although Ku action needed HIV-1 integration to host genome, its depletion did not modify the viral integration efficiency but rather acted at transcriptional level. Importantly, the reactivation of transgene expression by administering either the NF-κB (Nuclear Factor κB) activator, tumor necrosis factor α (TNFα) or the histone deacetylase inhibitor named trichostatin A was favored in a condition of Ku depletion. On the contrary, in presence of normal level of Ku, cells expressing HIV-1 displayed a high level of counter-selection over the time. Thus, our observations pleased to favor the hypothesis that Ku depletion promotes the establishment of a state of (reactivable) transcriptional latency associated to a lesser counter-selection of transduced cells. Altogether, the results obtained during this thesis demonstrate that lentiviral expression vary depending on (i) specific vector design, (ii) the transduced cell line and its genetic backbone, and (iii) the time elapse from transduction, as a consequence of modified interactions between the vector and its host.

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont à l’origine de l’ensemble des cellules hématopoïétiques, mais les mécanismes responsables de leurs réponses au stress ne sont que partiellement compris. J’ai étudié le rôle du facteur de transcription Helios dans les CSH, dans lesquelles il est fortement exprimé. J’ai trouvé que les CSH de souris nulles pour Helios (He-/-) possèdent un plus fort potentiel de reconstitution que les CSH WT dans des expériences de transplantations en série. De manière frappante, les souris âgées de 2 ans possèdent 8 fois plus de CSH fonctionnelles par rapport aux souris vieilles WT. De plus, le pool de CSH de long terme de souris He-/- vieilles ressemblent aux CSH WT jeunes en termes de phénotype et de fréquences. Les CSH He-/- vieilles présentent une dérégulation de gènes impliqués dans le vieillissement. De plus,les CSH He-/- jeunes sous-expriment des gènes codant des protéines impliquées dans la réparationde l’ADN ainsi que dans la voie p53. Quand les CSH He-/- et WT sont traitées avec différents agents radiomimétiques qui induisent des cassures simple et double brins à l’ADN, tels que la néocarzinostatine, la camptothécine ou l’étoposide, l’entrée en apoptose, en sénescence et l’arrêt de la prolifération des CSH He-/- sont altérées. Ce phénotype est accompagné d’une faible induction des gènes cibles de p53 et d’une altération du dégagement des foyers gammaH2AX. De plus, j’ai montré que Helios agit en synergie avec p53 pour réguler les réponses aux dommages à l’ADN des CSH. Mes résultats suggèrent qu’en synergie avec p53, Helios contrôle le vieillissement des CSH en prévenant l’accumulation des dommages de l’ADN des CSH. / Hematopoietic stem cells (HSCs) give rise to all blood cell lineages but the mechanisms responsible of HSCs responses to stress remain partially understood. I studied the role of the transcription factor Helios in HSCs, where Helios is highly and specifically expressed. I found that HSCs from young Helios null mice (He-/-) reconstitute the hematopoietic system of irradiated recipient mice similarly to HSCs from WT mice in primary transplantations, but out-perform WT cells in secondary and tertiary transplantations. Strikingly, HSCs from 2-year-old He-/- mice had 8-fold higher reconstitution potential than old WT HSCs in primary transplantations. Moreover, the pool of long-term HSCs in old He-/- mice resembles that of young WT animals in both phenotype and frequency. HSCs from old He-/- mice present a down regulation of genes involved in aging. Further, young He-/- HSCs express reduced mRNA levels of genes encoding DNA repair proteins as well as those associated with thep53 pathway. When He-/- and WT HSCs were subjected to DNA damage by different agents like neocarzinostatin, camptothecin, or etoposide, DNA damage-induced apoptosis, senescence and cell cycle arrest were significantly impaired in He-/- HSCs. This phenotype was accompanied by a poor induction of p53 target genes and impaired clearance of gammaH2AX foci. Furthermore, I found that Helios synergies with p53 to regulate the DNA damage responses of HSCs. My results suggest that,in synergy with p53, Helios controls HSC aging by preventing the accumulation of DNA damage in these cells.

Rayons ionisants, dessiccation, ou encore métabolites secondaires exogènes sont autant de facteurs qui peuvent engendrer des dommages à l’ADN chez les bactéries du sol, notamment en provoquant la formation de cassures double-brin (DSB), préjudice majeur pour une cellule. Chez les procaryotes, l’évolution a sélectionné deux principaux mécanismes de réparation des DSB, à savoir la recombinaison homologue (RH) et le non-homologous end joining (NHEJ). La RH est un mécanisme quasi-ubiquiste dans le monde bactérien qui repose sur l’utilisation d’une copie intacte de la molécule endommagée comme matrice pour la réparation de la DSB. Contrairement à la RH, le NHEJ n’est présent que chez 20 à 25% des bactéries et est considéré comme un mécanisme mutagène puisque la réparation de la DSB se fait sans matrice homologue et peut entrainer l’ajout ou la délétion de nucléotides au site de cassure. Chez la bactérie modèle Mycobacterium, seuls deux acteurs sont nécessaires pour la réparation par NHEJ. Ainsi, un dimère de protéine Ku se fixe sur la cassure puis recrute la protéine multifonctionnelle LigD, qui catalyse le traitement puis la ligation des extrémités grâce à ses domaines polymérase, nucléase et ligase. Les mécanismes de réparation des DSB chez les Streptomyces étaient peu connus à l’initiation de ce travail. Cette bactérie présente des caractéristiques génomiques remarquables avec notamment un chromosome linéaire de grande taille (6 à 12 Mb). En ce qui concerne la RH, nous avons focalisé nos recherches sur les étapes tardives (post-synaptiques) et étudié le rôle du complexe RuvABC et de RecG impliqués chez Escherichia coli dans la migration de la croix de Holliday et de sa résolution. La construction de mutants simples et multiples a montré que bien que les gènes codant ces protéines soient très conservés chez les Streptomyces, leur déficience ne se traduit chez Streptomyces ambofaciens que par une faible baisse de la recombinaison suite à un événement de conjugaison. Aucune baisse de l’efficacité de recombinaison intrachromosomique n’a en revanche été observée. Ces résultats suggèrent que des acteurs alternatifs majeurs sont encore à découvrir chez les Streptomyces. Le décryptage du mécanisme de NHEJ chez S. ambofaciens constitue une première dans ce genre bactérien. Une étude génomique exhaustive a permis de révéler la très grande diversité du nombre d’acteurs potentiels de ce mécanisme (Ku, LigDom, PolDom, NucDom) et de l’organisation des gènes qui les codent.. L’analyse fonctionnelle a révélé que l’ensemble des acteurs étaient impliqués dans la réponse à l’exposition à un faisceau d’électrons accélérés, connus pour induire, entre autre, la formation de DSB. La génération de DSB, par coupure endonucléasique I-SceI, a par ailleurs permis de mettre en évidence au niveau moléculaire des réparations de type NHEJ (délétions ou insertions de quelques nucléotides, intégration de fragments d’ADN). Les cassures dans les régions terminales du chromosome sont accompagnées de grandes délétions (jusqu’à 2,1 Mb) et de réarrangements de grande ampleur incluant circularisations du chromosome et amplifications d’ADN. Les conséquences de la réparation de DSB chez S. ambofaciens sont en tous points similaires aux réarrangements observés spontanément ou par comparaison des génomes des espèces types. Ainsi, il est possible de lier la plasticité du génome à la réparation de DSB. En outre, l’intégration de matériel génétique exogène serait favorisée au cours de la réparation NHEJ ce qui donnerait à ce système de réparation une place importante dans le processus de transfert horizontal, mécanisme d’évolution majeur chez les bactéries / Ionizing radiation, desiccation or exogenous secondary metabolites are all factors that can cause DNA damage in soil bacteria, especially by triggering double strand breaks (DSB), the most detrimental harm for the cell. In prokaryotes, evolution selected two main DSB repair pathways, namely homologous recombination (HR) and non-homologous end joining (NHEJ). HR is almost ubiquitous in bacteria and relies on an intact copy of the damaged DNA molecule as a template for DSB repair. In contrast to HR, NHEJ is only present in 20 to 25% of bacteria and is considered as a mutagenic pathway since DSB repair is performed without the need of any template and can lead to nucleotide addition or deletion at DSB site. In the bacterial model Mycobacterium, two partners are sufficient for a functional NHEJ pathway. Thus, Ku protein dimer recognizes and binds the DSB and then recruits the multifunctional LigD protein for extremities treatment and ligation thanks to its polymerase, nuclease and ligase domains. At the beginning of this work, few informations on DSB repair in Streptomyces were available. This bacteria exhibits remarkable genomic features including a large linear chromosome (6 to 12 Mb). Regarding HR, we focused on the late stage (post-synaptic step) in studying the role of RuvABC complex and RecG, involved in branch migration and Holliday junction resolution in E. coli. Construction of single and multiple mutants showed that although the genes encoding these proteins are highly conserved in Streptomyces, their deficiency in Streptomyces ambofaciens only results in a mild decrease of recombination after conjugation events. Besides, no decrease of intrachromosomal recombination efficiency could be observed. These results suggest that major alternative factors are still to be discovered in Streptomyces. This work was also the first occasion to decipher a NHEJ pathway in Streptomyces. An exhaustive genomic study revealed a great diversity in the number of factors potentially implicated in this pathway (Ku, LigDom, PolDom, NucDom) and in the organization of their encoding genes. Functional analyses revealed that all the factors, whatever they are conserved or not between species, were involved in the response to electron beam exposure, known to induce, amongst other things, DSB formation. Generation of DSB by I-SceI endonuclease cleavage was also used to evidence at a molecular level NHEJ type DSB repair (deletions or insertions of several nucleotides, integration of DNA fragments). Targeted breaks in the terminal regions of the chromosome were accompanied by large deletions (up to 2.1 Mb) and major rearrangements including chromosome circularizations and DNA amplifications. Consequences of DSB repair in S. ambofaciens are in all points similar to chromosome rearrangements observed spontaneously or by comparing genomes of different species. Thus, it is possible to link the genome plasticity to DSB repair. In addition, the integration of exogenous genetic material would be favoured during NHEJ repair which would give this repair system a major role in the horizontal transfer process, known to be a main evolution mechanism in bacteria

MITF (MIcrophthalmia-associated Transcription Factor) contrôle de multiples aspects de la physiopathologie du lignage mélanocytaire. Par des techniques de génomique haut débit (ChIP-seq, RNA-seq), nous avons montré que MITF active un ensemble de gènes impliqués dans la réplication et la réparation de l’ADN ainsi que la mitose pour stimuler la prolifération des cellules de mélanome, et réprime des gènes contrôlant leur caractère invasif. Pour étudier le mécanisme d’action de MITF, son interactome a été déterminé par spectrométrie de masse mettant en évidence de nombreux partenaires à activité co-activateur ou co-répresseur (bcaténine, complexes de remodelage de la chromatine BRG1 et NURF) ainsi que des facteurs intervenant dans le cycle de l’ubiquitination et de déubuquitination (HERC2 et USP11). Une caractérisation fonctionnelle de HERC2 et USP11 suggère qu’ils agissent comme des cofacteurs transcriptionnels de MITF essentiels pour la prolifération des cellules de mélanome. / MITF (MIcrophthalmia-associated Transcription Factor) controls multiple aspects of the physiopathology of the melanocyte lineage. Using high throughput genomics techniques (ChIP-seq, RNA-seq), we show that MITF activates a set of genes involved in DNA replication and repair as well as mitosis to promote melanoma cell proliferation, while repressing genes involved in promoting their invasion. To better understand how MITF acts both as a transcriptional activator and repressor, we characterized the MITF interactome by tandem immuno-affinity purification and mass-spectrometry. A complex set of partners with coactivatoror co-repressor properties were identified (b-catenin, the BRG1 and NURF chromatin remodeling complexes) as well as novel factors with ubiquitin E3 ligase (HERC2) and ubiquitin-specific protease (USP11) activities. Functional characterization of HERC2 and USP11 suggests that they act as transcriptional cofactors for MITF essential for melanoma cell proliferation.

Le récepteur nucléaire HNF4α est un facteur de transcription qui contrôle l’expression des gènes au niveau de l’épithélium de l’intestin et du côlon. Récemment associé au cancer colorectal, HNF4α pourrait réguler des processus importants pour la survie des cellules cancéreuses. Son rôle dans le cancer colorectal est toutefois controversé, ce qui compromet son utilisation en tant que cible thérapeutique. Par contre, les fonctions de HNF4α au côlon sont accomplies par deux différentes classes d’isoformes (P1 et P2) qui ont été très peu caractérisées jusqu’à présent. Pour clarifier le rôle de HNF4α, nous avons donc évalué les fonctions spécifiques de ses isoformes P1 et P2 dans le cancer colorectal. Nous avons observé que l’expression des isoformes P1 de HNF4α est localisée dans la région supérieure différenciée des cryptes du côlon alors que celle des isoformes P2 dans la région inférieure proliférative. Au cours du cancer colorectal, l’expression des isoformes P1 est inhibée au niveau de leur ARNm par l’activation de la β-caténine alors que l’expression des isoformes P2 est maintenue. Pour vérifier si ces isoformes ont des fonctions spécifiques dans le cancer colorectal, nous avons déterminé par ChIP-seq et RNA-seq leur gènes cibles spécifiques chez les Caco2/15. Les résultats suggèrent que les isoformes de HNF4α régulent des réseaux de gènes distincts permettant aux isoformes P1 d’influencer le métabolisme énergétique et aux isoformes P2 les mécanismes moléculaires associés au développement du cancer colorectal. De plus, plusieurs des partenaires protéiques des isoformes P2 identifiés par GFP-Trap et BioID chez les cellules cancéreuses sont associés aux mécanismes de réparation des dommages à l’ADN suggérant un nouveau rôle pour HNF4α. Notre étude suggère donc que les isoformes P1 et P2 de HNF4α régulent des réseaux de gènes différents dans le cancer colorectal. L’inhibition des isoformes P1 par la β-caténine pourrait permettre d’adapter le métabolisme aux besoins des cellules cancéreuses alors que le maintien de l’expression des isoformes P2, favoriser l’activité des voies oncogéniques et contribuer à la réponse aux dommages à l’ADN.

En phase somatique, plusieurs mécanismes de réparations de l’ADNinterviennent pour réparer les cassures double brin (CDB) de l’ADN. Enphase méiotique, les CDB de l’ADN engendrées de façon programmées parSpo11 sont réparées par la recombinaison homologue (RH) dont les acteursprincipaux sont Rad51 et Dmc1 aidés de Brca2. Chez Arabidopsis, en absencede Brca2, le déroulement méiotique est perturbé, les chromosomes nes’associent pas en bivalents, ils apparaissent emmêlés. Ainsi, en absencede Brca2, la recombinaison homologue pourrait ne plus être fonctionnelleet les anomalies chromosomiques observées pourraient être le résultat deréparations aberrantes des CDB de l’ADN effectuée par d’autres mécanismesde réparation de l’ADN. Nous avons montrés, chez Arabidopsis, que le Nonhomologous End Joining (NHEJ) et/ou le Single Strand Annealing (SSA),mécanismes de réparation des CDB de l’ADN en phase somatique,n’intervenaient pas en phase méiotique dans la formation des anomaliesobservées en absence de Brca2. Toujours dans l’hypothèse où ces figuresméiotiques soient le résultat de liaisons covalentes, nous avons regardési les ADN-ligases ne pourraient pas être impliquées. Ainsi, nous avons pumontrer que la Ligase 6, ADN-ligase spécifique des plantes, n’avait pas derôle dans les anomalies chromosomiques observées en méiose en absence deBrca2. D’ailleurs la Ligase 6 ne semble pas non plus intervenir dans lesfigures chromosomiques observées chez les mutants rad51 et mnd1. Le rôlede la Ligase 6 n’ayant pas été déterminé lorsque nous avons démarré cetravail, nous avons voulu identifier son le rôle en étudiant le mutantcorrespondant. Le mutant ligase 6 ne présente pas de sensibilité auxstress génotoxiques utilisés ce qui indique que la Ligase 6 ne semble pasintervenir dans la réparation de l’ADN. La mutation dans le gène LIGASE Iest létal à l’état homozygote, de plus nous avons pu observer uneségrégation anormale chez l’hétérozygote mutant pour le gène LIGASE I. Lalétalité du mutant ligase I a été contournée par l’utilisation d’unsystème ARNi pour éteindre l’expression du gène LIGASE I uniquement enméiose. Cependant, l’implication de la Ligase I, dans les anomaliesméiotiques observées en absence de Brca2 n’a pas pu être déterminée.Enfin, nous avons confirmé que, chez Arabidopsis, Xrcc4 avait un rôle dansle NHEJ via son interaction avec la Ligase IV et via la sensibilité dumutant xrcc4 à différents stress génotoxiques. En revanche, Xrcc4-like nesemble pas interagir avec les acteurs du complexe de ligation du NHEJ etle mutant ne présente pas de sensibilité aux stress génotoxique, indiquantque cette protéine n’est pas impliquée dans le NHEJ et plus généralementdans les mécanismes de réparation de l’ADN. / In somatic cells, several mechanisms are involved in the repair of DNAdouble strand breaks (DSB). In meiotic cells, programmed DSBs are causedby Spo11 and repaired by homologous recombination (HR), whose main playersare Rad51 and Dmc1 aided by Brca2. In Arabidopsis, in the absence ofBrca2, meiosis is disturbed, chromosomes do not organize into bivalents,they appear stuck and entangled together. Thus, in the absence of Brca2,HR may be no functional and the chromosomal anomalies we observecouldresult from the aberrant repair of the DNA DSBs due to other mechanisms ofDNA repair. We have shown in Arabidopsis that the homologous end joining(NHEJ) and/or Single Strand Annealing (SSA), mechanisms of DNA DSB repairthat are active in the somatic phase, were not involved in the formationof the meiotic anomalies observed in the absence of Brca2 in meioticcells. Still assuming that these figures are the result of meioticcovalent bond, we checked whether DNA ligases could be involved. Thus, wehave shown that 6 Ligase, DNA ligase specific plants, had no role in thechromosomal abnormalities observed in meiosis in the absence of Brca2.Besides the Ligase 6 does not seem to interfere with the meiotic figuresobserved in rad51 and mnd1 mutants. We wanted to identify the Ligase 6role in studying its mutant. Ligase 6 mutant did not show sensitivity togenotoxic stress. The Ligase 6 does not seem to be involved in DNA repair.The lethality of the ligase I mutant was bypassed with a RNAi constructaimed at extinguishing the gene expression of LIGASE I atmeiosis only.However, the involvement of Ligase I in the meiotic anomalies observed inthe absence of Brca2 could not be determined. Finally, we confirmed that,in Arabidopsis, Xrcc4 has a role in NHEJ through its interaction withligase IV and the sensitivity of the xrcc4 mutant to different genotoxicstress. In contrast, Xrcc4-like does not appear to interact with playersin the NHEJ ligation complex and the mutant shows no sensitivity togenotoxic stress. These result indicated that this protein is not involvedin NHEJ and, more generally in the mechanisms of DNA repair.

Dans le glioblastome (GBM), nous avons recherché et comparé les facteurs de radiorésistance parmi 8 lignées cellulaires et 11 xénogreffes (5 issues de patients, et 6 issues de lignées cellulaires traitées par radiothérapie hypofractionnée 6x5Gy) en utilisant la technologie RPPA (Reverse Phase Protein Analysis). Nous avons exploré 89 marqueurs protéiques appartenant à 10 voies différents: réparation de l’ADN, cycle cellulaire, apoptose, adhésion/cytosquelette, stress et voies PI3K, tyrosine kinase, MAPK/ERK, SAPK/JNK et NFκB. Aucun marqueur de radiorésistance n’était commun entre les expériences in vitro (FAK, HSP90, HSF1, HSPA2, vimentine et integrin β4) et in vivo (EGFR, CHK1 et VCP). Nous avons ensuite, dans ces mêmes modèles de GBM étudié la potentielle radiosensibilisation par une classe innovante d’inhibiteurs de la réparation de l’ADN, Dbait. Les molécules Dbait sont de courts fragments d'ADN double brin mimant une cassure de l'ADN. Ces molécules agissent comme des leurres vis-à-vis des enzymes de signalisation des dommages à l'ADN notamment PARP et DNA-PK qui sont hyperactivés, ce qui empêche la détection des dommages réels induits par les traitements et inhibe la réparation. Les molécules Dbait se sont montrées capables de radiosensibilier 6/11 modèles de xénogreffes de GBM. Les marqueurs prédictifs de la résistance à Dbait étaient Phospho-H2AX/H2AX, Phospho-NBS1/NBS1 et cleaved-PARP/PARP. Nous avons également mené une étude préclinique étudiant le potentiel radiosensibilisant de Dbait/DT01 (DT01 = forme clinique de Dbait) dans un modèle de mélanome. Les souris xénogreffées sur flanc étaient traitées par un protocole de RT « palliatif » (10x3Gy) ou « curatif » (20x3Gy) en combinaison à des injections de Dbait/DT01. Les souris traitées par la combinaison Dbait/DT01 et RT avaient une inhibition significative de la croissance tumorale et une survie prolongée. Du fait de l’ensemble des résultats précliniques positifs sans toxicité ajoutée, les molécules Dbait/DT01 ont été testées lors d’un essai clinique de phase I en association à la RT dans le cadre des métastases cutanées de mélanome avec des résultats très encourageants. / We aimed to identify predictive biomarkers of GBM radioresistance in 8 GBM cell lines, 6 corresponding cell lines derived xenografts (CDX) and 5 patient derived xenografts (PDX) treated with hypofractionated radiotherapy (6x5Gy), using an RPPA (Reverse Phase Protein Array) approach. We explored 89 potential protein markersinvolved in DNA repair, PI3K pathway, apoptosis, tyrosine kinase signaling, stress signaling, cell cycle, MAPK/ERK signaling, SAPK/JNK signaling, NFκB signaling and adhesion/cytoskeleton. In vitro identified biomarkers (FAK, HSP90, HSF1, HSPA2, vimentin and integrin β4) were not found in vivo. The markers specific of in vivo resistance were Phospho-EGFR/EGFR, Phospho-Chk1/Chk1 and VCP. Then, in these GBM models, we assessed the potential radiosensitization of an innovative DNA repair inhibitor, Dbait. Dbait consists of 32 bp deoxyribonucleotides that mimics DNA lesions. They act as a bait for DNA damage signaling enzymes, the polyadenyl-ribose polymerase (PARP), and the DNA-dependent kinase (DNA-PK), inducing a “false” DNA damage signal and ultimately inhibiting DNA repair. 6/11 GBM models had been radiosensitized by Dbait.Phospho-H2AX/H2AX, Phospho-NBS1/NBS1 and cleaved-PARP/PARP were predictive markers of Dbait resistance. We assessed the efficacy and safety of combining radiotherapy with Dbait/DT01 (DT01 = clinical form of Dbait) in a preclinical model of human melanoma. Nude mice subcutaneously engrafted with human melanomas (SK28) were or were not treated with Dbait/DT01, “palliative” (10x3Gy) or “radical” (20x3Gy) RT, or a combination of Dbait/DT01 and RT. Mice treated with Dbait/DT01 and RT combination had significantly better tumor growth control and longer survival compared to RT alone with the “palliative” protocol or the “radical” protocol. The results of this preclinical study led to the conduction of a phase 1 study in the palliative management of melanoma in-transit metastases (DRIIM trial) with very encouraging results.

Le gène hybride BCR-ABL1, responsable de la leucémie myéloïde chronique (LMC), code une protéine à activité tyrosine kinase constitutive. Lors d’une étude transcriptomique menée au laboratoire sur des patients résistants secondaires à l’imatinib, les deux gènes codant les protéines des rétrotransposons LINE-1 ont été trouvés sous exprimés d’environ 20 fois lorsque les patients rechutent. Le rôle des transposons n’a jamais été clairement défini, ils assurent certainement une fonction importante puisqu’ils sont conservés au cours de l’évolution et présents chez tous les organismes. Le but de ce travail a été d’étudier l’implication de LINE-1 dans la LMC. La sous-expression de LINE-1 est-elle une conséquence de la présence de BCR-ABL1 ou une cause de son apparition ? Différents groupes ont montré que les rétrotransposons LINE-1 possédent la capacité de réparation des cassures double-brin de l’ADN. Nous avons fait l’hypothèse qu’une diminution de l’expression des gènes codés par les rétrotransposons LINE-1 entraînerait l’instabilité génétique observée dans la LMC. Une étude réalisée chez des patients atteints de LMC et des sujets contrôles a montré une correlation inverse entre l’expression de LINE-1 et celle de l’oncogène BCR-ABL1. Parallèlement, une étude sur des lignées cellulaires leucémiques humaines BCR-ABL positives et négatives a été réalisée. Nous avons recherché le lien qui existe entre l’expression de LINE 1, de BCR-ABL1 et la réparation des cassures double-brin de l’ADN. Nous avons montré d’une part qu’une inhibition de l’expression de BCR-ABL1 induit une augmentation de l’expression des transposons LINE-1 D’autre part, une diminution de l’expression de LINE-1 entraîne une apparition du transcrit BCR-ABL1 dans les cellules BCR-ABL negatives. / BCR-ABL1 fusion gene, responsible of the chronic myeloid leukemia (CML) encodes a constitutively activated tyrosine kinase protein. Expression of both LINE-1 retrotransposon ORFs were found decreased at the time of imatinib resistance in a comparative transcriptional study focused on secondary resistant patients. The role of retrotransposons is unclear. They are conserved through evolution. This project focuses on the involvement of LINE-1 in CML. Is LINE-1 under expression a result of BCR-ABL1 expression or is it at the origin of BCR ABL1? Different groups have shown that LINE-1 retrotransposons were able to repair DNA double strands breaks. We suggest that LINE-1 under expression could be responsible of genetic instability observed in CML. We show in a study on CML patients and healthy subjects that LINE-1 expression is inverse correlated to BCR-ABL1 expression. Moreover, study on BCR-ABL+ and BCR-ABL- human leukemic cell lines was carried on. First, we show that decrease of BCR-ABL1 expression induces increase of LINE-1 expression. Then that decrease of LINE-1 expression generates BCR-ABL1 transcript in BCR-ABL negatives cell lines.