La voie de signalisation WNT/β-caténine est impliquée dans de nombreuses processi cellulaires, du développement à la physiologie. Dans le foie adulte, elle est nécessaire pour établir et maintenir la zonation métabolique, condition préalable pour la fonctionnalité de l’organe, mais elle est aussi cause d’un pourcentage non négligeable (11-32%) de carcinomes hépatocellulaires (CHC), qui surviennent après mutation activatrice du gène codant la β-caténine. Mes travaux se sont inscrits dans la continuité de travaux de l’équipe auxquels j’ai participé , et ont eu pour principaux objectifs : (1) d’explorer le rôle du facteur de transcription Hnf4α dans la physiologie et les cancers du foie, en lien avec la signalisation β-caténine ; (2) de déterminer si une imagerie tumorale par tomographie par émission de positrons (TEP) spécifique de la captation de choline pouvait prédire les CHC mutés pour la β-caténine et si le métabolisme de la choline pouvait présenter une piste thérapeutique des cancers du foie.Pour ces deux projets, j’ai eu accès à des cohortes de patients atteints de cancers du foie, mais j’ai également pu bénéficier du modèle gain-de-fonction de la β-caténine développé au laboratoire, qui consiste en une perte du suppresseur de tumeur Apc, frein majeur de la voie β-caténine conduisant à des cancers du foie. Grâce à un modèle d’invalidation hepato-spécifique et conditionnelle du gène Hnf4α, j’ai pu prouver que la perte de Hnf4α mène à une augmentation de la prolifération, du stockage des lipides dans le foie et à une désorganisation de l’architecture zonale hépatique, en particulier celle de la triade portale. J’ai aussi démontré que dans un contexte de carcinome murin invalidé par Apc, le rôle suppresseur de tumeur d’Hnf4α était mineur.Une approche métabolomique avait montré qu’un signal β-caténine perturbait le métabolisme des phospholipides dérivant de la choline. Grâce à une étude parallèle réalisée chez des patients porteurs de CHC d’une part, et dans nos modèles murins d’autre part, nous avons pu mettre en évidence par TEP une fixation accrue de la F-choline dans les tumeurs activées β-caténine. Ce phénotype est spécifique d’une signalisation β-caténine active puisque cette captation accrue n’était pas présente chez les patients porteurs de carcinome hépatocellulaire non mutés ou chez les souris présentant une cancérogenèse indépendante de la β-caténine (modèle DEN). J’ai ensuite étudié le devenir intracellulaire de la choline. En utilisant de la choline radiomarquée j’ai montré in vitro qu’un signal β-caténine aberrant accroit l’incorporation de choline dans les phospholipides, et accroit également son rôle de donneur de groupements méthyles, participant à la méthylation de l’ADN. Cela pourrait expliquer pourquoi l’ADN est hyperméthylé chez les souris avec la perte d’Apc, puisque l’administration d’un régime sans choline et methionine à ces souris réverse le phénotype d’hyperméthylation. L’ensemble de ces résultats suggère que la choline pourrait jouer un rôle important dans la cancérogenèse liée à la β-caténine. Nous proposons que des TEP F-choline pourraient être utilisés pour diagnostiquer les CHC mutés β-caténine, et à terme des thérapies ciblées sur ce métabolisme pourraient être envisagées. / WNT/β-catenin is a pillar during development and in adult physiology. In particular in the adult liver it is a double-edged sword: it is necessary to establish the metabolic zonation, requirement for having a functional organ, but it is also involved in the onset of 11-32% of hepatocellular carcinoma (HCC). My thesis work has been based on the team previous results and it is focused on two main subjects: (1) the first aim was to decipher the role of Hnf4α both in physiology and in HCC development and its relationship with WNT/β-catenin signalling and (2) the second part explores the possible use of Fluoro-choline (FCh) positron emission tomography (PET) in the diagnosis of β-catenin-activated liver tumours.In this study I used cohorts of patients having HCC, but also inducible and hepatospecific knock-out mice for adenomatous polyposis coli (APC) gene (thereafter called ApcKO mice). Apc is the most important negative regulator of β-catenin, and it hepatic loss leads to aberrant activation of β-catenin, disrupting liver zonation and initiating long-term liver cancers. I generated also inducible hepatospecific Hnf4α knock-out mice and I demonstrated an increased proliferation, lipids accumulation and disorganization in the portal triad architecture, together with a mild distruption of liver zonation. Then, looking at cancer onset, I demonstrated that Hnf4α loss is not able per se to initiate liver cancer, and has no tumour suppressor role in β-catenin activated tumours onset and progression.We performed a metabolic analysis of ApcKO livers, showing that β-catenin is able to deregulate lipids metabolism, in particular that of phospholipids derived from choline. In collaboration with clinicians, I studied human patients who underwent FCh/PET, showing that β-catenin-mutated tumours had an increased uptaken of F-Choline whereas non-mutated β-catenin human HCC had not. Similar results were obtained with mice, either ApcKO β-catenin-activated HCC or β-catenin-independent mice HCC, obtained through a N-diethylinitrosamine (DEN) injection.Choline in cells splits in two main pathways: it is both a methyl-group donor and a precursor for phospholipids production. I tested this through radiolabeled fluxes in in vitro experiments. In β-catenin activated hepatocytes and tumours there are more phospholipids and more methyl groups in DNA derived from choline than in control mice. Moreover in ApcKO DNA is hypermethylated, and it is dependent on choline supply from diet.All these results together show the importance for β-catenin activated tumours to have a supply in choline, and so open a way not only in PET exploitation for having a precise diagnosis, but also in deciphering the importance of choline pathway, to possibly develop a targeted therapy.

Le gène Cdx2 exerce de nombreuses fonctions au cours du développement embryonnaire. Son expression est maintenue spécifiquement dans l’épithélium intestinal adulte. Cdx2 est diminué dans les cancers colorectaux (CCR), favorisant la migration et la dissémination des cellules tumorales. Cette diminution de Cdx2 est réversible, suggérant une dérégulation du gène. Nous avons étudié d’une part les fonctions intestinales de Cdx2 au cours du développement et surtout chez l’adulte, et d’autre part les mécanismes moléculaires associés à la dérégulation de Cdx2 dans les CCR.Une approche d’invalidation conditionnelle de Cdx2 chez la souris a été choisie. Nous montrons que Cdx2 est nécessaire pour l’établissement de l’identité intestinale au cours du développement. De plus, dans l’intestin adulte il contribue au maintien de l’identité des cellules souches et intervient dans la différenciation terminale des cellules épithéliales. Le croisement du modèle murin transgénique pCdx2-9LacZ avec le modèle de cancérogénèse colique spontanée Apc∆14/+ indique que les éléments nécessaires à la diminution d’expression de Cdx2 dans les CCR sont sur le promoteur de 9kb de Cdx2. Par ailleurs, nous montrons une corrélation d’expression entre les protéines HNF4α, régulateur transcriptionnel de Cdx2, et Cdx2 dans des échantillons de tumeurs intestinales humaines et murines. L’invalidation conditionnelle de Hnf4α dans l’intestin est associée à une réduction d’expression de Cdx2 et à une plus grande susceptibilité des animaux à la tumorigenèse colique chimio-induite. HNF4α constitue un facteur important de la dérégulation de Cdx2 dans les CCR et exerce une fonction suppresseur de tumeur dans l’intestin / The Cdx2 gene exerts many functions during embryonic development. Its expression is maintained specifically in the adult intestinal epithelium. Cdx2 expression is reduced in colorectal cancers (CRC); moreover, this reduction promotes migration and the spread of colon tumor cells. The alteration of Cdx2 in CRC is reversible, suggesting a deregulation of the gene. The objectives of my project were to study the functions of Cdx2 during intestinal development and in adults and to study the molecular mechanisms associated with the deregulation of Cdx2 in CRC. An approach of conditional invalidation of Cdx2 in mice has been used. We show that Cdx2 plays a key role in establishing the intestinal identity during development. In addition, at the adult stage Cdx2 is involved in the maintaining of the intestinal stem cells identity and in the control of terminal differentiation of intestinal epithelial cells. Crossing the transgenic mouse model pCdx2-9LacZ with spontaneous colon carcinogenesis model ApcΔ14/+ indicates that the elements necessary for the decrease of Cdx2 expression are located on the Cdx2 promoter of 9kb. Earlier team works have highlighted HNF4α as a transcriptional regulator of Cdx2 expression. In this work, we have demonstrated a correlation between HNF4α and Cdx2 protein expression in samples of human and mouse intestinal tumors. The conditional invalidation of Hnf4α in the intestine is associated with a reduction of Cdx2 expression, and a greater susceptibility for mice to chemo-induced colonic tumorigenesis. HNF4α is an important factor in the deregulation of Cdx2 in CRC and it exerts itself a tumor suppressor function in the gut.

Le récepteur nucléaire HNF4α est un facteur de transcription qui contrôle l’expression des gènes au niveau de l’épithélium de l’intestin et du côlon. Récemment associé au cancer colorectal, HNF4α pourrait réguler des processus importants pour la survie des cellules cancéreuses. Son rôle dans le cancer colorectal est toutefois controversé, ce qui compromet son utilisation en tant que cible thérapeutique. Par contre, les fonctions de HNF4α au côlon sont accomplies par deux différentes classes d’isoformes (P1 et P2) qui ont été très peu caractérisées jusqu’à présent. Pour clarifier le rôle de HNF4α, nous avons donc évalué les fonctions spécifiques de ses isoformes P1 et P2 dans le cancer colorectal. Nous avons observé que l’expression des isoformes P1 de HNF4α est localisée dans la région supérieure différenciée des cryptes du côlon alors que celle des isoformes P2 dans la région inférieure proliférative. Au cours du cancer colorectal, l’expression des isoformes P1 est inhibée au niveau de leur ARNm par l’activation de la β-caténine alors que l’expression des isoformes P2 est maintenue. Pour vérifier si ces isoformes ont des fonctions spécifiques dans le cancer colorectal, nous avons déterminé par ChIP-seq et RNA-seq leur gènes cibles spécifiques chez les Caco2/15. Les résultats suggèrent que les isoformes de HNF4α régulent des réseaux de gènes distincts permettant aux isoformes P1 d’influencer le métabolisme énergétique et aux isoformes P2 les mécanismes moléculaires associés au développement du cancer colorectal. De plus, plusieurs des partenaires protéiques des isoformes P2 identifiés par GFP-Trap et BioID chez les cellules cancéreuses sont associés aux mécanismes de réparation des dommages à l’ADN suggérant un nouveau rôle pour HNF4α. Notre étude suggère donc que les isoformes P1 et P2 de HNF4α régulent des réseaux de gènes différents dans le cancer colorectal. L’inhibition des isoformes P1 par la β-caténine pourrait permettre d’adapter le métabolisme aux besoins des cellules cancéreuses alors que le maintien de l’expression des isoformes P2, favoriser l’activité des voies oncogéniques et contribuer à la réponse aux dommages à l’ADN.

Transdifferentiation induces chromatin reconstructions and epigenetic changes that affect gene expression spectum and cause cell remodeling in general. Direct conversion of mature somatic cell line into another mature cell type occures during the transdifferentiation thereby differences betweeen individual germ layers are eliminated. The aim of the master thesis is transdifferentation of mesenchymal cells - mouse embryonic fibroblast into endodermal cells - hepatocytes in vitro, using combination of transcripion factors Hnf4α and Foxa1. Detection of fibroblasts transformation has been initiated immediately after retroviral transduction and final generation of induced hepatocyte culture was confirmed by morphological and function analysis. The population of mouse induced hepatocytes served as a possible model for human liver disease in case of a pacient whose liver proteins could not be detected immunohistochemically. Genome editing of induced hepatocytes was realized by CRISPR/Cas9 technology which is based on cooperation of guideRNA and Cas9 nuclease followed in addition to generation of DNA-specific double strand breaks. These specific breaks in the Tight junction protein 2 gene were repaired via homologous recombination that induced a missense mutation with amino acid changes in the target...

microRNA (miRNA) är korta icke-kodande RNA sekvenser som har fått ökande uppmärksamhet då de kan binda till mRNA och styra vårt genuttryck. Omkring trettio procent av våra proteinkodande gener styrs av miRNA. miRNA binder till mRNA vilket hindrar dess translation eller leder till nedbrytning av mRNA. Studier visar att miRNA är involverade i olika cancersjukdomar där miRNAs kan ha olika roller. De kan antingen hämma cancern (tumörsupressor) eller agera som en onkogen. Idag pågår mycket forskning kring miRNAs påverkan på cancer och hur eventuellt miRNA kan användas som läkemedel i framtiden. Trots pågående forskning saknar vi avgörande insikter om både strukturer och biofysiska egenskaperna hos miRNA: mRNA-interaktionen som bestämmer deras funktionella resultat. Att förstå detta är viktigt för att förstå miRNA fulla terapeutiska potential. För att bidra med kunskap inom detta område var rapportens första fokus att studera bindningen mellan mRNA HNF4α och miRNA-34a med hjälp av en metod som kallas SHAPE MaP. Genom att studera bindningen är det möjligt att få mer kunskap om dess reaktiva områden och därmed öka förståelsen för den inre strukturen. SHAPE MaP är baserad på en metod som utför massiv parallell sekvensering för att identifiera mutationer introducerade med ett SHAPE-reagens. Efter detta utförs kartläggning av dessa mutationer med hjälp av ett datorprogram för att få fram en struktur. Strukturen är avgörande för att förstå de biofysiska egenskaperna såsom stabilitet, vikningsdynamik och interaktioner med andra biomolekyler. Under arbetets gång flyttades fokus till att optimera SHAPE MaP-experimentet. En serie experiment utfördes för att bestämma den optimala tiden mellan transfektion av miRNA och modifiering av SHAPEreagens med qPCR. Detta tydde på att den optimala tiden är 100 minuter, men ytterligare studier behövs dock för validering. Sammanfattningsvis beskriver denna rapport ett optimeringsexperiment för SHAPE MaP-applikationen. / microRNA (miRNA) are short non-coding RNA sequences that are important as they can bind to mRNA and control our gene expression. miRNAs control around thirty percent of our protein-coding genes. They bind to mRNAs and induce cleavage, transcriptional inhibition, or degradation. Studies show that miRNAs are involved in various cancers, where they can have different roles under different conditions. They can either act as a tumor suppressor or act as an oncogene. Today, there is extensive research into the impact of miRNAs on cancer and how miRNAs can potentially be used as drugs in the future. Nevertheless, we lack crucial insights into their intrinsic structural and biophysical properties and interactions with mRNAs that determine their functional outcomes. Addressing this knowledge gap is essential for unlocking their full therapeutic potential. To contribute knowledge in this area, the first focus of this report was studying the binding between the mRNA HNF4α and miRNA-34a using a method called SHAPE MaP. By studying the binding, it is possible to get more knowledge about their reactive sites, and by knowing this, it is possible to investigate the intrinsic structure. SHAPE MaP is based on a method that performs massively parallel sequencing to detect mutations made by a SHAPE reagent. These mutations are then mapped using a computer program to extract a structure. The structure is crucial for understanding the biophysical properties such as stability, folding dynamics, and interactions with other biomolecules. During the work, however, the focus shifted towards optimizing the SHAPE MaP experiment. A series of experiments were conducted to determine the optimal time between transfection of miRNA and modification of SHAPE reagent with qPCR. This indicated that the optimal time is 100 minutes, but further studies are needed for validation. In conclusion, this report describes an optimization experiment for the SHAPE MaP application.