Dans le glioblastome (GBM), nous avons recherché et comparé les facteurs de radiorésistance parmi 8 lignées cellulaires et 11 xénogreffes (5 issues de patients, et 6 issues de lignées cellulaires traitées par radiothérapie hypofractionnée 6x5Gy) en utilisant la technologie RPPA (Reverse Phase Protein Analysis). Nous avons exploré 89 marqueurs protéiques appartenant à 10 voies différents: réparation de l’ADN, cycle cellulaire, apoptose, adhésion/cytosquelette, stress et voies PI3K, tyrosine kinase, MAPK/ERK, SAPK/JNK et NFκB. Aucun marqueur de radiorésistance n’était commun entre les expériences in vitro (FAK, HSP90, HSF1, HSPA2, vimentine et integrin β4) et in vivo (EGFR, CHK1 et VCP). Nous avons ensuite, dans ces mêmes modèles de GBM étudié la potentielle radiosensibilisation par une classe innovante d’inhibiteurs de la réparation de l’ADN, Dbait. Les molécules Dbait sont de courts fragments d'ADN double brin mimant une cassure de l'ADN. Ces molécules agissent comme des leurres vis-à-vis des enzymes de signalisation des dommages à l'ADN notamment PARP et DNA-PK qui sont hyperactivés, ce qui empêche la détection des dommages réels induits par les traitements et inhibe la réparation. Les molécules Dbait se sont montrées capables de radiosensibilier 6/11 modèles de xénogreffes de GBM. Les marqueurs prédictifs de la résistance à Dbait étaient Phospho-H2AX/H2AX, Phospho-NBS1/NBS1 et cleaved-PARP/PARP. Nous avons également mené une étude préclinique étudiant le potentiel radiosensibilisant de Dbait/DT01 (DT01 = forme clinique de Dbait) dans un modèle de mélanome. Les souris xénogreffées sur flanc étaient traitées par un protocole de RT « palliatif » (10x3Gy) ou « curatif » (20x3Gy) en combinaison à des injections de Dbait/DT01. Les souris traitées par la combinaison Dbait/DT01 et RT avaient une inhibition significative de la croissance tumorale et une survie prolongée. Du fait de l’ensemble des résultats précliniques positifs sans toxicité ajoutée, les molécules Dbait/DT01 ont été testées lors d’un essai clinique de phase I en association à la RT dans le cadre des métastases cutanées de mélanome avec des résultats très encourageants. / We aimed to identify predictive biomarkers of GBM radioresistance in 8 GBM cell lines, 6 corresponding cell lines derived xenografts (CDX) and 5 patient derived xenografts (PDX) treated with hypofractionated radiotherapy (6x5Gy), using an RPPA (Reverse Phase Protein Array) approach. We explored 89 potential protein markersinvolved in DNA repair, PI3K pathway, apoptosis, tyrosine kinase signaling, stress signaling, cell cycle, MAPK/ERK signaling, SAPK/JNK signaling, NFκB signaling and adhesion/cytoskeleton. In vitro identified biomarkers (FAK, HSP90, HSF1, HSPA2, vimentin and integrin β4) were not found in vivo. The markers specific of in vivo resistance were Phospho-EGFR/EGFR, Phospho-Chk1/Chk1 and VCP. Then, in these GBM models, we assessed the potential radiosensitization of an innovative DNA repair inhibitor, Dbait. Dbait consists of 32 bp deoxyribonucleotides that mimics DNA lesions. They act as a bait for DNA damage signaling enzymes, the polyadenyl-ribose polymerase (PARP), and the DNA-dependent kinase (DNA-PK), inducing a “false” DNA damage signal and ultimately inhibiting DNA repair. 6/11 GBM models had been radiosensitized by Dbait.Phospho-H2AX/H2AX, Phospho-NBS1/NBS1 and cleaved-PARP/PARP were predictive markers of Dbait resistance. We assessed the efficacy and safety of combining radiotherapy with Dbait/DT01 (DT01 = clinical form of Dbait) in a preclinical model of human melanoma. Nude mice subcutaneously engrafted with human melanomas (SK28) were or were not treated with Dbait/DT01, “palliative” (10x3Gy) or “radical” (20x3Gy) RT, or a combination of Dbait/DT01 and RT. Mice treated with Dbait/DT01 and RT combination had significantly better tumor growth control and longer survival compared to RT alone with the “palliative” protocol or the “radical” protocol. The results of this preclinical study led to the conduction of a phase 1 study in the palliative management of melanoma in-transit metastases (DRIIM trial) with very encouraging results.

La protéine kinase dépendante de l’ADN (DNA-PK) est une sérine-thréonine kinase qui est un élément essentiel dans la voie de réparation de l’ADN endommagé par recombinaison non-homologue (non-homologous end-joining; NHEJ). DNA-PK est également impliquée dans de nombreux processus cellulaires autre que la réparation de l'ADN. Plusieurs travaux ont montré que les protéines impliquées dans la réparation des dommages de l'ADN tels que BRCA-1, MRN-11, PARP-1 et également de DNA-PK jouent un rôle important dans la métastase du cancer. Dans ce travail, nous nous sommes concentrées sur le rôle de DNA-PK dans les métastases du mélanome. Dans un premier temps, en utilisant les molécules Dbait 32Hc comme un moyen d'activer DNA-PK dans le noyau et le cytoplasme, nous avons identifié plusieurs nouvelles cibles cytoplasmiques de DNA-PK, dont la vimentine. Nous avons montré que DNA-PK phosphoryle la vimentine sur Ser459 et que cette forme phosphorylée est la plupart du temps située au niveau des protrusion cellulaires des cellules migratrices. Nous avons ensuite démontré que la vimentine-Ser459-P induite par le traitement de Dbait32Hc participe à l'inhibition de l'adhésion et la migration cellulaire. Ainsi, cette approche a conduit à l'identification de nouvelles cibles cytoplasmiques de DNA-PK et a révélé un lien entre la signalisation des dommages de l'ADN et le cytosquelette. Ensuite, nous avons montré que DNA-PK joue un rôle important dans la migration et invasion cellules en régulant la sécrétion des facteurs associés à la métastase. Nous avons montré que l'absence ou l’inhibition de DNA-PK conduit à une régulation négative des facteurs pro-métastatique sécrétés et à la régulation positive de facteurs anti-métastatiques sécrétés tels que les inhibiteurs des métalloprotéinases matricielles. Nous avons confirmé le rôle de DNA-PK in vivo dans l'implantation de la tumeur primaire et dans la formation des métastases. Ainsi, nos études ont évalué le rôle de DNA-PK sur le contrôle du microenvironnement de la tumeur par le contrôle de la sécrétion de facteurs importants pour la métastase. En résumé, nos résultats mettent en évidence l'importance de la DNA-PK comme cible de traitement anti-métastatique. / The DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) is a serine/threonine protein kinase, which is a critical component of the DNA-damage repair pathways through non-homologous end-joining (NHEJ). Besides DNA repair, it is also involved in numerous cellular pathways. Emerging results show that proteins involved in DNA damage repair such as BRCA-1, MRN-11, PARP-1 and also DNA-PK could play a role in cancer metastasis. In the current study, we demonstrated the role of DNA-PK in melanoma metastasis. Firstly using Dbait 32Hc molecules as a tool for specifically activating DNA-PK in a nucleus and cytoplasm, we identified several new cytoplasmic targets of DNA-PK including vimentin. We established that DNA-PK phosphorylates vimentin on Ser459 and that this phosphorylation was mostly located at cell protrusions of melanoma migratory cells. Following this, we confirmed that vimentin-Ser459-P induced by Dbait 32Hc treatment participates to the inhibition of cell adhesion and migration. Thus, this approach led to the identification of downstream cytoplasmic targets of DNA-PK and revealed a connection between DNA damage signaling and the cytoskeleton. Secondly, we show that DNA-PK plays an important role in cell migration and melanoma cell invasion through the regulation of secretion of metastasis-associated factors. Absence or inhibition of DNA-PK leads to down-regulation of pro-metastatic secreted factors and up-regulation of anti-metastatic secreted factors such as inhibitors of matrix metalloproteinases. We confirmed in vivo, that DNA-PK is required for efficient primary tumor implantation and metastases formation. Thus, our studies demonstrate for the first time that DNA-PK acts on tumor microenvironment by controlling secretion of important factors for cell migration and invasion. In summary, our findings highlight the importance of DNA-PK as a target of anti-metastatic treatment.

Les défauts dans les voies de réparation de l’ADN sont aujourd’hui largement exploités pour le traitement du cancer. En effet, la capacité des tumeurs à réparer les lésions induites par les traitements génotoxiques (chimio- et radiothérapie) leur confère une résistance intrinsèque ou acquise à ces traitements. Développer des inhibiteurs de réparation de l’ADN permettrait de contrecarrer cette résistance et de sensibiliser les tumeurs à ces thérapies conventionnelles. Les inhibiteurs de la Poly(ADP-ribose) polymérase (PARPi), premiers candidats de cette famille d’inhibiteurs de réparation de l’ADN, ont montré des résultats encourageants mais sont néanmoins restreints à une sous-population de tumeurs avec une déficience dans la voie de réparation par recombinaison homologue (DRH). De plus, des résistances à ces PARPi ont été constatées suite à la réactivation de la voie RH ou de voies alternatives. Il est donc urgent de développer des agents plus efficaces qui permettraient de limiter la problématique de résistance. Dans le laboratoire, nous avons identifié une nouvelle classe d’inhibiteurs de réparation de l’ADN, les Dbait, consistant en une petite molécule d’ADN double-brin qui miment une cassure double-brin (CDB). AsiDNA, une molécule de la famille Dbait, agit en séquestrant et hyper activant la protéine PARP et ses partenaires, ainsi que la protéine DNA-PK qui modifie la chromatine, inhibant ainsi le recrutement au niveau du site du dommage de plusieurs protéines de réparation des voies RH ou NHEJ. Dans ce manuscrit, nous avons étudié la question des mécanismes de sensibilité à AsiDNA, et nous avons identifié l’instabilité génétique, générée essentiellement par des défauts dans les voies de réparation des CDBs, comme caractéristique majeure pour être sensible à AsiDNA dans différents modèles de cellules et de xénogreffes. De façon intéressante, l’instabilité génétique ne corrélait pas avec la sensibilité aux PARPi, qui présentaient également un profil d’action différent d’AsiDNA. En se basant sur ces différences, et sur le mode d’action d’AsiDNA agissant en tant qu’inhibiteur de la voie RH, la combinaison de ces deux molécules permettrait de s’affranchir de la restriction génétique (DRH) essentielle pour l’efficacité des PARPi. Pour valider cette hypothèse, nous avons montré par des analyses moléculaires que l’olaparib, un PARPi, et AsiDNA préviennent le recrutement au niveau des sites des dommages de XRCC1 et de RAD51/53BP1, respectivement. La combinaison de ces deux inhibiteurs permettait l’accumulation des dommages non réparés résultant en une augmentation de la mort de cellules tumorales de différentes origines, et un retard significatif de la croissance des xénogreffes. Cependant, les cellules non tumorales ne présentaient ni une augmentation des dommages ni de la mort cellulaire. Ces résultats soulignent l’intérêt thérapeutique de la combinaison d’AsiDNA avec les PARPi qui permettrait de s’affranchir de la dépendance au statut DRH et d’élargir leur champ d’application. Dans cette thèse, nous avons également traité la question de la résistance acquise à AsiDNA. En effet, contrairement à l’imatinib et au 6-thioguanine, nous n’avons pas isolé de clones résistants à AsiDNA après des expériences de mutagénèse ou après des traitements répétés sur différents modèles cellulaires. Un tel comportement défie notre acceptation commune de la théorie Darwinienne pour expliquer la résistance des cellules tumorales aux traitements. / Defects in the DNA repair pathways are now widely exploited for the treatment of cancer. Indeed, the ability of tumors to repair the damage induced by genotoxic treatments (chemotherapy and radiotherapy) gives them an intrinsic or acquired resistance to these treatments. Developing DNA repair inhibitors would help to counteract this resistance and sensitize tumors to these conventional therapies. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors (PARPi), first candidates for this family of DNA repair inhibitors, have shown encouraging results but are nevertheless restricted to a tumor subpopulation with Deficiencies in the Homologous Recombination repair pathway (HRD). In addition, resistances to these PARPi were observed following the reactivation of the HR pathway or alternative pathways. It is therefore urgent to develop more effective agents to limit the resistance problem. In the laboratory, we have identified a new class of DNA repair inhibitors, Dbait, consisting of a small double-stranded DNA molecule that mimics a double-strand break (DSB). AsiDNA, a molecule of the Dbait family, acts by hijacking and hyper activating the PARP protein and its partners, as well as DNA-PK protein that modifies chromatin, thereby inhibiting recruitment at the damage site of several DNA repair proteins. In this manuscript, we studied the issue of mechanisms of sensitivity to AsiDNA, and we identified the genetic instability, generated mainly by defects in the DSBs’ repair, as major feature to be sensitive to AsiDNA in different models of tumor cells and xenografts. Interestingly, genetic instability does not correlate with sensitivity to PARPi, which also had a different action profile than AsiDNA. Based on these differences, and on the mode of action of AsiDNA acting as an inhibitor of the HR pathway, the combination of these two molecules would allow bypassing the genetic restriction (HRD) essential for PARPi efficiency. To validate this hypothesis, we have shown by molecular analyzes that olaparib, a PARPi, and AsiDNA prevent the recruitment at damage sites of the repair proteins XRCC1 and RAD51 / 53BP1, respectively. The combination of these two inhibitors allowed the accumulation of unrepaired damage resulting in an increase of tumor cells’ death, and a significant delay in the growth of xenografts. However, non-tumor cells were not sensitive to this combined treatment. These results highlight the therapeutic interest of combining AsiDNA with PARPi to recapitulate synthetic lethality in all tumors independently of their HR status. In this thesis, we also addressed the issue of acquired resistance to AsiDNA. Indeed, contrary to imatinib and 6-thioguanine, we didn’t recover resistant clones to AsiDNA after mutagenesis or after repeated cycles of treatment on different cell models. Such behavior challenges our common acceptation of a Darwin evolution theory to explain tumor cells resistance to treatment.