Despite improvements in therapy, the prognosis for non-small cell lung cancer (NSCLC) patients remains poor, and cure is only possible in localized tumors after surgical resection. A new generation of targeted cancer drugs has led to the expectation that lung cancer therapy can be significantly improved, but these drugs are today only an option in a small subset of NSCLC patients, and their effect is temporary. Therefore, the aim of this thesis was to characterize NSCLC in order to find new treatment targets and to evaluate biomarkers that further optimize therapy selection. In Paper I, the expression of the potential treatment targets claudin 6 and claudin 18.2 were evaluated based on immunohistochemical- and gene expression analysis. High ectopic protein and gene expression were demonstrated for both claudins in small subgroups of NSCLC. Clinical trials using humanized monoclonal antibodies against both proteins are ongoing in other cancer forms and may be extended to NSCLC. In Paper II, the prognostic impact of the inflammatory mediator cyclooxygenase 2 (COX-2) was evaluated. No prognostic significance was found in a meta-analysis incorporating gene expression data of 1337 NSCLC patients. Likewise, COX-2 protein expression in tumor cells was not associated with survival in two independent NSCLC cohorts. However, in one of the analyzed cohorts, higher COX-2 expression in the tumor stroma was associated with longer survival and may therefore be a subject for further investigation. In Paper III, tumor and stromal COX-2 protein expression was examined in patients treated with the COX-2 inhibitor celecoxib in order to evaluate if COX-2 expression is a predictive biomarker for benefit of celecoxib therapy. Celecoxib did not prolong overall survival neither in the whole cohort nor in patients stratified according to COX-2 expression in tumor or stromal cells. Noteworthy, a tendency towards longer survival was again demonstrated in patients with high COX-2 stromal expression. In Paper IV, the diagnostic methods for identification of ALK rearrangements were assessed in a large representative Swedish NSCLC population. Fluorescence in situ hybridization (FISH), as the diagnostic standard, was compared to two immunohistochemical assays. ALK gene expression levels were incorporated to supplement the molecular data. The frequency of ALK rearrangements was lower than previously reported. The different methods to detect the ALK fusion demonstrated overlapping results. However, the overlap was poor, so the methods cannot be regarded as interchangeable and should thereby be interpreted with caution when used in clinical diagnostics. In summary, this thesis applied an integrative translational approach to characterize potential new treatment targets and to evaluate the detection of existing predictive biomarkers in NSCLC.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医科学) / 甲第22647号 / 医科博第110号 / 新制||医科||7(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医科学専攻 / (主査)教授 佐藤 俊哉, 教授 川上 浩司, 教授 福原 俊一 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Le cancer du sein demeure un problème de santé publique majeure dans le monde. Afin d'améliorer les chances de survie et la qualité de vie des femmes, il est nécessaire d’effectuer le diagnostic à un stade précoce et d’appliquer le traitement. Dans ce contexte, un des objectifs de cette thèse est de développer des puces à protéines pour le diagnostic et le pronostic du cancer du sein. Parmi les nombreux marqueurs biologiques potentiels, des recherches récentes ont montré que des anticorps anti-heat shock proteins (anti-HSPs) sont associés à la genèse tumorale. Ces anticorps seraient donc de bons biomarqueurs diagnostiques et pronostiques pour le cancer du sein. Par conséquent, nous avons élaboré une puce à antigènes afin de détecter les anticorps anti-HSP dans le sérum de 50 patients atteints de cancer du sein et de 26 témoins sains. Nos résultats indiquent clairement que la la détection multiplex d’une combinaison d'anticorps anti-HSP permet de discriminer les patients atteints de cancer du sein des témoins sains avec une sensibilité de 86% et une spécificité de 100%. Ensuite, nous avons élaboré une puce à anticorps pour doser la concentration de l'activateur du plasminogène de type urokinase (uPA) et de son inhibiteur principal (PAI-1) dans 16 extraits cytosoliques de tissus tumoraux. uPA et PAI-1 sont décrits comme étant de bons biomarqueurs pronostiques et prédictifs du cancer du sein. De faibles taux de uPA (≤3 ng / mg de protéine) et PAI-1 (≤14 ng / mg de protéine) sont associés à un faible risque de récidive et pas de bénéfice d’une chimiothérapie pour les patients atteints de cancer du sein. Les résultats obtenus à partir de puces à anticorps étaient surface dépendante par rapport aux résultats obtenus sous forme ELISA. En outre, l'utilisation de nos puces à anticorps nécessite 25 fois moins de volume d'échantillon par rapport à un dosage ELISA, résolvant ainsi les principales limites de la méthode ELISA. Enfin, nous avons déterminé et optimisé les paramètres influençant les performances des puces à protéines, comme par exemple la chimie de surface, la durée expérimentale, la concentration des solutions, etc. Nous avons également étudié les conditions de stockage à la fois pour des surfaces chimiquement fonctionnalisées et pour les puces à protéines. Les résultats ont montré que les puces à protéines conservent leur activité biologique jusqu’à trois mois de stockage. / Breast cancer becomes the most common cancer among women. In order to improve women's chances of survival and life quality, to be diagnosed at an early stage and to receive correct treatment are the most promising ways. In this context, we aim at developing an antigen microarray for screening serological biomarkers to diagnose breast cancer patients as early as possible. Among numerous potential biomarkers, recent researches showed that antibodies against heat shock proteins (HSPs) are associated with tumor genesis and would be good diagnostic and prognostic biomarkers for breast cancer. Therefore, we used customized antigen microarray to screen anti-HSP antibodies in 50 breast cancer patients and 26 healthy controls. Our results indicated clearly that combining multiplex detection of anti-HSPs antibodies could discriminate breast cancer patients from healthy controls with sensitivity 86% and specificity 100%. Then, we elaborated an antibody microarray to detect the concentration of urokinase type plasminogen activator (uPA) in 16 cytosolic extracts of breast tummor tissue. uPA is good prognostic and predictive biomarker for breast cancer, low levels of uPA (≤3 ng/mg of protein) is associated with low risk of recurrence and no benefit of chemotherapy for breast cancer patients, and vice versa. Our results showed that the results obtained from our antibody microarray were surface dependent compared with the results obtained from ELISA. Furthermore, the use of our antibody microarray requires 25 times less sample volume compared with ELISA kit, thus solving the main limitations of ELISA. Finally, we determined and optimized the parameters which affected the performances of protein microarray, e.g. microarray surface chemistry, experimental duration, the concentration of solutions, etc. Furthermore, we studied the storage conditions for both chemically functionalized microarray surface as well as printed protein microarray. Results showed that our protein microarrays retain efficient biological activity for at least 3 month of storage.

Introduction: les progrès thérapeutiques pour la prise en charge du carcinome urothélial de la vessie, ou tumeur de vessie infiltrant le muscle (TVIM), sont faibles depuis deux décennies, notamment sur le plan de la chimiothérapie, tant dans les formes localisées que métastatiques. L'identification de nouveaux biomarqueurs pouvant améliorer la prise en charge et le pronostic des patients apparait indispensable, notamment pour prédire la réponse aux traitements systémiques. Notre travail a cherché : (i) à identifier des facteurs biologiques prédictifs de rechute après les chimiothérapies adjuvantes (CA) utilisées actuellement, (ii) à déterminer si les altérations moléculaires, cibles de nouvelles thérapies, identifiées dans la tumeur vésicale sont conservées dans les métastases.Objectifs:(i) Rechercher une association entre la rechute après CA et l'expression de six biomarqueurs, ERCC1, Emmprin, Survivin, MDR1, p53 et topoisomérase IIα, dans la tumeur vésicale et/ou une métastase ganglionnaire(ii) Etudier l'hétérogénéité des mutations de FGFR3 dans les TVIM localement avancéesMatériels et Méthodes: Une cohorte rétrospective de 226 patients traités par cystectomie et CA, et une collection tumorale d'échantillons représentatifs de la tumeur primitive et d'une métastase ganglionnaire ont été constituées. L'expression des six biomarqueurs a été déterminée en immunohistochimie sur ces échantillons. Le statut mutationnel de FGFR3 a été déterminé en SNaPshot sur 84 paires tumeur primitive/métastase ganglionnaire.Résultats: Les survies observées dans la cohorte étaient proches de celles rapportées dans la littérature pour des patients de mêmes stades. La collection tumorale étudiée semble donc représentative des TVIM traitées en France. Aucun des six biomarqueurs n'était retrouvé comme prédictif de rechute après traitement. Une mutation de FGFR3 était retrouvée dans 4 (4,7%) des 84 échantillons appariés sans aucune discordance entre tumeur primitive et métastase ganglionnaire.Conclusions: L'expression de ces six biomarqueurs étudiés en immunohistochimie n'est pas associée à un risque de rechute après CA. Le statut mutationnel de FGFR3 est conservé au cours de la dissémination métastatique, et ses mutations activatrices sont présentes dans près de 5% des TVIM localement avancées. Leur conservation dans le processus métastatique renforce l'intérêt de l'évaluation de nouvelles thérapies ciblant le récepteur FGFR3 muté. Enfin, il est possible de rechercher cette mutation sur la tumeur vésicale ou une métastase avec la même pertinence. / Introduction: In muscle invasive urothelial carcinoma of the bladder (MI UCB), few progresses have been made in the last two decades, particularly in chemotherapy, both in localized and metastatic setting. The identification of new biomarkers that can improve the management and prognosis of patients appears essential. Such biomarkers will be clinically relevant if they can predict the response to systemic treatments. In this thesis, we studied biomarkers in two ways: (i) to identify predictive factors of relapse after cisplatin-based adjuvant chemotherapy (AC), (ii) to confirm that the molecular alterations targeted by new therapies and identified in bladder tumor are present in metastases.Objectives:(i) To examine the relationship between relapse after AC and expression of six biomarkers, ERCC1, Emmprin, Survivin, MDR1 p53 and topoisomerase IIα, in bladder tumor and / or lymph node metastases.(ii) To study the heterogeneity of FGFR3 mutations in locally advanced MI UCBMaterials and Methods: A retrospective cohort of 226 patients treated with cystectomy and AC, and tumor collection of representative samples of the primary tumor and lymph node metastases were constituted. The expression of six biomarkers was determined by immunohistochemistry on these samples and determined by morphometry. FGFR3 mutation status was determined by SNaPshot in 84 paired primary tumors and positive lymph nodes.Results: Survivals observed in the cohort were similar to those reported in the literature for patients of same stages, with tumor collection being representative of the MI UCB treated in France. None of the six biomarkers was found as an independent predictive factor of relapse after AC. FGFR3 mutation was found in 4 (4.7%) of the 84 paired samples with complete concordance between primary tumor and lymph node metastases.Conclusions: The expression of the six studied biomarkers by immunohistochemistry is not associated with risk of relapse following AC. FGFR3 mutation status is maintained during metastases process, and FGFR3 activating mutations are present in about 5% of locally advanced MI UCB. FGFR3 mutation remains a promising therapeutic target in a low subset of patients, and the evaluation of new therapies targeting the mutated FGFR3 receptor are needed. Finally, search for these mutations either in bladder tumor or in metastasis is relevant.

Le cancer est un problème de santé publique majeur et représente l'une des principales causes de décès dans le monde. Il représente ainsi un lourd fardeau humain et économique pour la société. Au cours de ces dernières années, l'innovation technologique avec notamment le séquençage d'acide désoxyribonucléique (ADN) a modifié la vision et la pratique de la cancérologie en proposant de sélectionner le traitement médical le plus approprié aux caractéristiques génotypiques de chacun. Dans certains types de cancer, la chimiothérapie est parfois prescrite abusivement avec de possibles effets délétères importants à long terme. La prescription de la chimiothérapie ne doit donc pas se faire de manière systématique et l'identification de biomarqueurs prédictifs de la réponse au traitement devient donc une étape cruciale. En effet un grand nombre de biomarqueurs voire des combinaisons de biomarqueurs doivent être testés afin d'identifier les patients susceptibles de bénéficier de la chimiothérapie. A cet effet, des analyses statistiques spécifiques à l'analyse de la mutation TP53 dans le cancer du poumon non à petites cellules ont été mises en place dans la première partie de cette thèse. Enfin, la seconde partie de cette thèse porte sur l'évaluation médico-économique de ces tests, primordiale pour le financement de ces innovations et donc pour avoir un impact direct sur les patients atteints de cancer. Nos résultats ont démontrés que bien que ces tests peuvent être coût-efficaces et recommandés dans plusieurs pays, leurs utilisations en France restent limitées en raison de l'absence de remboursement / Cancer is a leading cause of death around the world and thus a major worldwide public health problem and a heavy human and economic burden. In recent years, the practice of cancer medicine has evolved with technological innovation such as deoxyribonucleic acid (DNA) sequencing which allows the selection of the most suited treatment for each genotypic characteristic. With chemotherapy, a treatment with potentially significant long-term adverse effects, being overprescribed in some types of cancer, the identification of a predictive biomarker of response to treatment became a crucial step. Indeed a large number of biomarkers or combinations of biomarkers have to be tested to identify patients likely to benefit from chemotherapy and thus to avoid the systematic prescription of chemotherapy. Accordingly, the first part of this thesis focused on the specific statistical analysis of TP53 mutations in non-small cell lung cancer. The second part of this thesis’ aim was to study the medico-economic evaluation of these tests, since these evaluation are essential for these test’s financing. Results showed that although the tests may be cost-effective and recommended in several countries, their uses in France were limited due to the lack of reimbursement

Cancer is the second leading cause of death in the Czech Republic. Breast cancer and colorectal cancer have relatively high mortality rate. One of the areas of current clinical research in oncology is the study of prognostic biomarkers, which aims to optimize the decision-making process for a patient. Immune response and processes in the tumor microenvironment have been shown to influence to a large extent the biological nature of the tumor in terms of its aggressiveness and ability to metastasize in the host's body. There are certain tumors that could induce a strong immune response, while others do not. The ability to induce an anti-tumor cell response and to attract specific lymphocyte subpopulations directly into tumor tissue has been shown to be very closely related to the prognosis of cancer patients. There is evidence and correlation of the presence of so-called tumor infiltrating lymphocytes in tumor tissue and overall patient survival. Stratification of cancer patients based on immuno-predictors both in the plasma and directly in the tumor microenvironment makes it possible to identify suitable candidates for rediscovered modern anti-tumor immunotherapy, which can already be considered a standard therapeutic modality. In our projects, we focused on the identification of biomarkers that...

Die Behandlung von Krebserkrankungen wurde in den letzten Jahren von zwei großen Trends beeinflusst. Statt zytotoxischer Therapien, wurden zielgerichtete monoklonale Antikörper entwickelt. Zudem verstärkten sich die Bemühungen in der Entwicklung prädiktiver Biomarker, die die Stratifizierung von Patienten vor der Behandlung ermöglichen. Obwohl hunderte von zielgerichteten Krebsmedikamenten entwickelt wurden, erreichten nur wenige davon eine Zulassung. Grund hierfür ist die noch hohe Ausfallrate bei der „Übersetzung“ von vielversprechenden präklinischen Daten, die mit Krebs-Zelllinien und Xenograft-Modellen von Krebs-Zelllinien erlangt wurden, in positive klinische Phase II- und Phase III-Daten. Das Ziel der Forschung ist es, neue zielgerichtete Therapien und gleichzeitig prädiktive Marker, mit Hilfe von verbesserten präklinischen Tumormodellen zu entwickeln. Ein Panel von 133 Xenograftmodellen aller vier UICC-Stadien wurde etabliert. Zur Überprüfung dieses Modells wurde die Wirksamkeit von Cetuximab, Bevacizumab und Oxaliplatin getestet. Für dieses Experiment benutzten wir 67 Xenograft-Modelle, die aus chemonaiven CRC-Patienten entwickelt wurden. Die Behandlung mit einer Cetuximab-Monotherapie ergab eine objektive Ansprechrate von 27%. Dank dieser hohen Ansprechrate, konnten wir das verfügbare Tumorgewebe zur Vorhersage der Reaktion auf die Anti-EGFR-Antikörper in den Xenograft-Modellen verwenden. Wir untersuchten die Genauigkeit von Mutations-Markern (KRAS, BRAF und PIK3CA) kombiniert mit RNA-Expressionsdaten von Amphiregulin und Epiregulin. Weiterhin wurden neue prädiktive Marker-Kombinationen, basierend auf einer mRNA- und microRNA- Expressionsanalyse, ermittelt. Aufgrund der erfolgreichen Nachbildung der klinischen Situation in unserem Panel von Xenograft-Modellen, zeigt dieser Modellansatz vielversprechendes Potenzial für eine zukünftige Anwendung in der Erprobung neuartiger Krebsmedikamente und der Entwicklung von prädiktiven Biomarkern. / Over the last ten years two major trends have influenced drug development. Instead of cytotoxic therapies a variety of targeted monoclonal antibodies have been developed. In parallel, higher attention has been paid to the identification and validation of predictive markers, which allow the stratification of patients prior to the treatment. Hundreds of targeted cancer drugs have been developed, but only a few have been approved. Despite these two trends, there is still a high rate of failure in translating promising preclinical data obtained with cancer cell lines and xenograft models derived from cancer cell lines into positive clinical phase II and phase III data. The goal of the scientific community is to develop novel targeted therapies and predictive biomarkers using better preclinical tumour models. To bridge the gap between preclinical and clinical development a panel of 133 patients-derived CRC xenografts of all four UICC stages was established. An efficacy of cetuximab, bevacizumab and oxaliplatin was tested in the subset of 67 models. In the treatment experiment with cetuximab monotherapy an objective response rate of 27% was obtained. This high response rate allowed the use of the tumour tissues for evaluating molecular markers for predicting response to the anti-EGFR antibody in the xenograft models. The accuracy of three mutation markers including KRAS, BRAF and PIK3CA was investigated in combination with RNA expression levels of two EGFR ligands – amphiregulin and epiregulin. Novel predictive markers panels based on gene expression profiling of mRNA and microRNA were also tested and compared with the established biomarkers. Successful reconstruction of the clinical situation in the panel of xenograft models proves their potential for future use in testing of novel anti-cancer drugs. Moreover, their broad molecular characterization allows the simultaneous development of predictive biomarkers along with the testing of novel cancer drugs.

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Les cancers MSI (Microsatellite Instable) sont caractérisés par un niveau élevé d'instabilité des séquences répétées de l'ADN, les microsatellites, suite à l'inactivation du système MMR (Mismatch Repair). L'étude de la carcinogenèse MSI a révélé des mutations somatiques (délétion/insertion) de nombreux gènes sur des microsatellites codants, qui décalent le cadre de lecture et engendrent la production de protéines tronquées dont la fonction est le plus souvent perdue. Ces altérations affectent des gènes suppresseurs de tumeurs ou apparentés agissant au niveau de voies de signalisation en rapport avec l'oncogenèse, et sont sélectionnées lorsqu'elles promeuvent le développement tumoral. Ces travaux font état de la découverte de la première mutation d'une chaperonne dans une pathologie tumorale, affectant l'oncogène codant pour HSP110 (Heat Shock Protein) sur un microsatellite non-codant intronique situé dans un site accepteur d'épissage. Cette mutation, conduisant à un saut d'exon, est inéluctable et bi-allélique dans l'ADN tumoral, et entraîne la perte des activités oncogéniques d'HSP110 dans les cellules cancéreuses (effet pro-apoptotique, chimio-sensibilisant, antiprolifératif et de ralentissement de la croissance tumorale). Ces résultats remettent en question les mécanismes de l'oncogenèse MSI et le caractère oncogénique de l'instabilité microsatellitaire. Au niveau physiopathologique et clinique, ils pointent HSP110 comme cible pronostique (facteur prédictif de réponse à la chimiothérapie) et thérapeutique. Je propose une approche de traitement pour les patients avec une tumeur MSI, visant à exacerber le caractère délétère de cette mutation dans les cellules tumorales. / MSI cancers (MicroSatellite Instability) are characterized by widespread instability of DNA repeated sequences, known as microsatellites, due to MMR system (Mismatch Repair) deficiency. Since the detection of this tumor phenotype, most of the oncogenic events reported in these tumors are somatic mutations (1-2 bp insertions or deletions) that affect coding DNA repeats, resulting in frameshifts and inactivation of the corresponding proteins. They accumulate in tumor cells due to positive selection during the MSI-driven tumorigenic process when they promote tumor development by inactivating genes with tumor suppressor-related functions. This work reports the first somatic mutation of a chaperone protein in a cancer so far, i.e. HSP110 (Heat Shock Protein) in MSI colorectal cancer. This mutational event consists in the somatic deletion of the intronic microsatellite, located in the splice acceptor site of HSP110. We demonstrate that it is almost systematic and bi-allelic in these cancers, leading to inactivation of the oncogenic functions of the HSP110 chaperone (pro-apoptotic and anti-proliferative impact leading to chemosensitization of tumor cells and tumor growth decrease). Our findings support an unexpected and paradoxical anticancer impact of the microsatellite instability-driven pathway in mismatch repair-deficient colon cancer. From a pathophysiological and clinical point of view, they highlight HSP110 as a putative relevant prognostic marker (improvement of patients’ response to chemotherapy) and therapeutic target. According to these findings, I propose a therapeutic strategy targeting HSP110 and its mutant for personalized medicine of MSI colon cancer patients.

Avec la révolution récente de la génomique et la médecine stratifiée, le développement de signatures moléculaires devient de plus en plus important pour prédire le pronostic (biomarqueurs pronostiques) ou l’effet d’un traitement (biomarqueurs prédictifs) de chaque patient. Cependant, la grande quantité d’information disponible rend la découverte de faux positifs de plus en plus fréquente dans la recherche biomédicale. La présence de données de grande dimension (nombre de biomarqueurs ≫ taille d’échantillon) soulève de nombreux défis statistiques tels que la non-identifiabilité des modèles, l’instabilité des biomarqueurs sélectionnés ou encore la multiplicité des tests.L’objectif de cette thèse a été de proposer et d’évaluer des méthodes statistiques pour l’identification de ces biomarqueurs et l’élaboration d’une prédiction individuelle des probabilités de survie pour des nouveaux patients à partir d’un modèle de régression de Cox. Pour l’identification de biomarqueurs en présence de données de grande dimension, la régression pénalisée lasso est très largement utilisée. Dans le cas de biomarqueurs pronostiques, une extension empirique de cette pénalisation a été proposée permettant d’être plus restrictif sur le choix du paramètre λ dans le but de sélectionner moins de faux positifs. Pour les biomarqueurs prédictifs, l’intérêt s’est porté sur les interactions entre le traitement et les biomarqueurs dans le contexte d’un essai clinique randomisé. Douze approches permettant de les identifier ont été évaluées telles que le lasso (standard, adaptatif, groupé ou encore ridge+lasso), le boosting, la réduction de dimension des effets propres et un modèle implémentant les effets pronostiques par bras. Enfin, à partir d’un modèle de prédiction pénalisé, différentes stratégies ont été évaluées pour obtenir une prédiction individuelle pour un nouveau patient accompagnée d’un intervalle de confiance, tout en évitant un éventuel surapprentissage du modèle. La performance des approches ont été évaluées au travers d’études de simulation proposant des scénarios nuls et alternatifs. Ces méthodes ont également été illustrées sur différents jeux de données, contenant des données d’expression de gènes dans le cancer du sein. / With the recent revolution in genomics and in stratified medicine, the development of molecular signatures is becoming more and more important for predicting the prognosis (prognostic biomarkers) and the treatment effect (predictive biomarkers) of each patient. However, the large quantity of information has rendered false positives more and more frequent in biomedical research. The high-dimensional space (i.e. number of biomarkers ≫ sample size) leads to several statistical challenges such as the identifiability of the models, the instability of the selected coefficients or the multiple testing issue.The aim of this thesis was to propose and evaluate statistical methods for the identification of these biomarkers and the individual predicted survival probability for new patients, in the context of the Cox regression model. For variable selection in a high-dimensional setting, the lasso penalty is commonly used. In the prognostic setting, an empirical extension of the lasso penalty has been proposed to be more stringent on the estimation of the tuning parameter λ in order to select less false positives. In the predictive setting, focus has been given to the biomarker-by-treatment interactions in the setting of a randomized clinical trial. Twelve approaches have been proposed for selecting these interactions such as lasso (standard, adaptive, grouped or ridge+lasso), boosting, dimension reduction of the main effects and a model incorporating arm-specific biomarker effects. Finally, several strategies were studied to obtain an individual survival prediction with a corresponding confidence interval for a future patient from a penalized regression model, while limiting the potential overfit.The performance of the approaches was evaluated through simulation studies combining null and alternative scenarios. The methods were also illustrated in several data sets containing gene expression data in breast cancer.