La production des espèces réactives de l’oxygène (ERO) est incriminée dans les mécanismes de toxicité des médicaments utilisés en chimiothérapie, et particulièrement dans la toxicité cardiaque des anthracyclines et la toxicité rénale des complexes de platine. Les travaux entrepris dans le cadre de cette thèse relèvent de la problématique de l’amélioration des thérapies anti-cancéreuses existantes au moyen de nouveaux antioxydants, et d’une meilleure connaissance du fonctionnement de ces molécules en relation avec les ERO. Ils ont été réalisés sur divers modèles cellulaires. Dans un premier temps, nous avons testé les effets antioxydants de benzophénones naturelles issues d’Hypericum annulatum. L’un des produits de cette plante, l’hypéricophénonoside (Hd19), a démontré in vitro une forte activité antioxydante et antiradicalaire. Il possède notamment la capacité de capturer les radicaux hydroxyles et superoxydes, qui sont des espèces réactives générées au cours de la chimiothérapie. Les effets cytoprotecteurs de Hd19 et de la silymarine (molécule naturelle de référence) ont été évalués dans les lignées mammaires cancéreuses (MCF7) et non-cancéreuses (hTERT-HME1). Les deux antioxydants protègent les lignées mammaires contre les effets délétères du tert-butylhydroperoxyde (tBHP). De plus, l’hypericophénonoside diminue le niveau du stress oxydant intracellulaire provoqué par l'adriamycine et le cisplatine, sans affecter toutefois la cytotoxicité des ces médicaments dans les cellules cancéreuses. L’activité antioxydante de Hd19 est également associée à l’accroissement du taux du glutathion réduit surtout dans la lignée non-cancéreuse. De plus, Hd19 et la silymarine préviennent la toxicité du cisplatine sur des cellules tubulaires rénales proximales. Cet effet ajoute de l’intérêt à ces molécules puisque la toxicité rénale du cisplatine représente l’un des effets secondaires qui limitent l’utilisation de cette drogue. Ces résultats dans leur ensemble font de l’hypéricophénonoside une substance répondant aux critères des molécules cytoprotectrices utilisables en cancérologie (absence de cytotoxicité propre, protection des cellules non cancéreuses contre le stress oxydant, absence d’altération de l’efficacité des drogues chimiothérapeutiques) Dans un deuxième temps, les effets protecteurs de trois benzophénones synthétiques inédites (5-(hydroxybenzoyl)-2(3H) benzothiazolones) ont été caractérisés. L’une d’elles nommée 6c exerce une activité antioxydante beaucoup plus prononcée que le Trolox, le produit synthétique de référence. Une augmentation prononcée de la viabilité cellulaire et du taux du glutathion réduit dans des cellules non-cancéreuses hTERT-HME1 a été observée. Le composé 6c démontre un fort potentiel protecteur contre le stress oxydant et la mortalité induits par le tBHP. De plus nous avons observé une activité protectrice significative dans les myoblastes cardiaques H9c2, qui pourrait se révéler fort intéressante dans le développement de nouvelles stratégies antioxydantes pour limiter la toxicité cardiaque des anthracyclines / The production of reactive oxygen species (ROS) is involved in the mechanisms associated to the toxicity of chemotherapeutic drugs, albeit not completely understood (especially regarding the cardiac toxicity of anthracyclines and the nephrotoxicity of platinum complexes). This study aims at the improvement of anticancer therapies by novel antioxidants and the evaluation of their pharmacological effects related by ROS using cell models. Firstly, we tested the antioxidant properties of novel natural benzophenones isolated from Hypericum annulatum. One of them – hypericophenonoside (Hd19) displayed a high in vitro antioxidant and antiradical activity. It scavenges the hydroxyl and the superoxide anion radicals, which could be formed during chemotherapy. The cytoprotective effects of Hd19 and silymarine, our natural reference compound, were tested on breast cell lines – ie the cancerous MCF7 and the non-cancerous hTERT-HME1. Both antioxidants protected the mammary cells against the toxic effects of tert-butylhydroperoxide (tBHP). Moreover, the hypericophenonoside decreases the intracellular oxidative stress induced by cisplatin and adriamycin, without affecting viability, apoptosis, necrosis and cell cycle progression modulated by these chemotherapeutic agents. The antioxidant activity could be associated with an increase of reduced glutathione levels, especially in non-cancerous cell line. A very promising fact was Hd19 and silymarine protection on the proximal renal tubular cells against cisplatin toxicity, its chief dose-limiting side effect. Secondly, the protective potential of three novel synthetic benzophenones was characterized. One of them named 6c exerted a higher antioxidant activity than Trolox, our synthetic reference compound. An important increase in cell viability and GSH level was observed in non-cancerous cell line hTERT-HME1. 6c showed high protective potential against oxidative stress and cell mortality induced by tBHP. Moreover, we observed a significant protection in cardiomyoblastic H9c2 cells, which may be of great interest in the frame of novel antioxidant strategies for the limitation of anthracycline cardiac toxicity

Les chimiothérapies orales sont de plus en plus prescrites en oncologie. Le passage de la voie intraveineuse à per os se traduit par de multiples changements dans le soin. La complexité de ces traitements est transférée du médecin vers le malade, interrogeant la problématique de l’observance. Nous souhaitons proposer une estimation globale du phénomène d’observance aux chimiothérapies orales, puis en isoler les principaux déterminants, interroger les changements représentationnels sur la maladie/traitements, des patients du groupe per os, en comparaison du groupe IV. 59 patients ont participé à cette étude. Nous avons choisi une double méthodologie. Les outils utilisés sont: la BMQ (représentations des traitements), B-IPQ (perception du cancer), HAD (affects anxiodépressifs). Nous avons construit une échelle générique d’observance adaptée au cancer. Les entretiens semi-directifs composent le volet qualitatif. 90% des patients présentent une observance médicamenteuse d’au moins 85%. L’observance aux modalités spécifiques de prise est durement impactée. Les antécédents psychiatriques sont les principales variables affectant l’observance. Les affects anxiodépressifs actuels impactent négativement l’observance. La voie per os est jugée comme impactant moins le quotidien que la voie IntraVeineuse. La voie orale est associée à un sentiment de contrôle accru sur le cancer. La chimiothérapie orale est surtout abordée sous l’angle de sa toxicité. Le lien entre dépression passée, actuelle et observance démontre l’importance de leur identification et prise en charge. L’inobservance pourrait être considérée comme un symptôme de dépression en oncologie. / Oral chemotherapies are increasingly prescribed in oncology. Many changes in health care have occurred. The complexity of these treatments is moved from the doctor to the patient. To make an inventory of adherence to oral chemotherapy, and then describe its main determinants. Studying changes in the representations of cancer and treatment. 59 patients participated in this stud. For the quantitative methodology, we used the following tools: BMQ (representations of treatment), B-IPQ (perception of cancer), HAD (anxiety and depression). We built a generic scale to measure adherence. It was adapted to cancer. For qualitative methodology, we conducted semi-structured interviews. 90% of patients have a medication compliance of at least 85%. Compliance with the specific modalities of treatment is severely affected. Psychiatric history are the main variable affecting adherence. There is a negative correlation between current anxiety and depressive affect and compliance. The oral route is perceived as less impacting daily life compared to the IntraVeinous route. The oral route is associated with an increased sense of control over the disease. Oral chemotherapy is mainly addressed in terms of its toxicity. Changes in perception of the disease are infrequent (eg lower perceived severity).The relationship between history of depression, current depressive affects and compliance demonstrates the importance of their identification and their management. Failure to comply may be considered a symptom of depression in oncology. These data justify the role of the psychologist to support adherence and its possible links with an overall psychological distress.

Le psoriasis est une dermatose érythémato-squameuse d’évolution chronique. Les patients atteints par la pathologie ont à leur disposition de nombreux traitements qui permettent de contrôler la maladie sans toutefois la guérir. Néanmoins, plusieurs de ces traitements présentent des propriétés toxicologiques et des effets indésirables à court ou long terme. Il devient donc impératif de découvrir de nouvelles molécules thérapeutiques afin d’améliorer considérablement la qualité de vie des patients psoriasiques. Or, l’ingénierie tissulaire permet d’approfondir les connaissances en dermatologie et d’investiguer sur de nouveaux agents thérapeutiques topiques, que ce soit dans le domaine cosméceutique ou pharmaceutique. La culture cellulaire tridimensionnelle (3D) est un modèle pertinent afin d’étudier l’architecture d’un tissu sain ou pathologique. La méthode d’auto-assemblage développée au Laboratoire d’Organogénèse Expérimentale (LOEX) permet l’obtention, entre autre, de substituts cutanés bilamellaires autologues sains ou psoriasiques. L’objectif général de ce projet a été de démontrer, via criblage pharmacologique, le potentiel antipsoriasique d’une gamme de molécules dérivées de la biomasse végétale de la forêt boréale en vue d’une possible utilisation dans le traitement du psoriasis. Des tests de toxicité effectués avec 39 molécules à différentes concentrations ont permis d’identifier 9 molécules inhibitrices de la croissance kératinocytaire et ce, à de faibles concentrations. Parmi ces 9 molécules, toutes testées sur des substituts cutanés 3D sains et psoriasiques, 4 ont démontré des propriétés thérapeutiques prometteuses au niveau de la normalisation de la prolifération et de la différenciation kératinocytaire; il y a une diminution significative de l’épaisseur de l’épiderme vivant des substituts psoriasiques traités avec ces 4 molécules comparativement au contrôle. De plus, ces quatre molécules régulent positivement l’expression de plusieurs protéines impliquées dans la différenciation cellulaire (involucrine, filaggrine, loricrine) ou la prolifération cellulaire (Ki-67). Ainsi, ces molécules novatrices de structure polyphénolique pourraient éventuellement être utilisées en tant que traitement efficace du psoriasis. / Psoriasis is a chronic skin disease characterized by erythematous plaques with loosely adherent silvery-white scales. Psoriatic patients have at their disposal several treatments that control the disease however, no cure has been found yet., Current treatments for psoriasis are associated with toxicological problems and short- and long-term adverse effects. Hence, it is imperative to discover new therapeutic molecules in order to significantly improve the quality of life of psoriatic patients. Tissue engineering of skin is used to deepen our knowledge in dermatology and to investigate on new topical therapeutics for the cosmeceutical or pharmaceutical fields. Three-dimensional (3D) cell culture recapitulates normal and pathological tissue architectures that provide physiologically relevant models to study normal development or diseases of the tissue. The self-assembly method developed at LOEX allows to produce healthy or psoriatic bilamellar skin substitutes. The aim of this project was to demonstrate, using pharmacological screening, the antipsoriatic potential of a range of compounds derived from the plant biomass of the boreal forest. Toxicity assays were used to screen 39 molecules at different concentrations, and a choice of 9 molecules inhibiting the keratinocyte growth at low concentrations was made to pursue this project. Among these 9 molecules, all tested on healthy and psoriatic 3D skin substitutes, 4 of them have shown promising therapeutic properties for the normalization of keratinocyte proliferation and differentiation; these 4 molecules upregulate the expression of several proteins involved in cellular differentiation (involucrin, filaggrin, loricrin) or cellular proliferation (Ki-67). Histological analyses of psoriatic skin substitutes treated with these 4 molecules showed a significant decrease of the epidermis thickness. Thereby, these innovative molecules with a polyphenolic structure could possibly be used as an effective treatment of psoriasis.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2009-2010 / Aucun essai clinique hasardisé permettant de confirmer l'efficacité des traitements pharmacologiques employés en clinique pour le delirium n'a été réalisé en cancer avancé. L'objectif principal de l'étude consistait à évaluer la faisabilité d'un essai clinique hasardisé à simple insu sur les traitements pharmacologiques du delirium chez cette population. L'objectif secondaire consistait à évaluer l'efficacité thérapeutique des interventions étudiées (halopéridol, méthylphénidate, risperidone, placebo). Les résultats obtenus démontrent que la faisabilité des essais cliniques est hautement problématique en cancer avancé, notamment à cause du faible recrutement. Aucune mesure préliminaire d'efficacité des interventions n'a pu être obtenue. L'efficacité de l'halopéridol et des psychostimulants (méthylphénidate) a dû être évaluée en analysant une banque de données et en effectuant une revue de la littérature, respectivement. Selon ces analyses, des doses initiales d'au moins 2 mg d'halopéridol réduiraient la durée du delirium et le méthylphénidate améliorerait les fonctions cognitives des patients en phase avancée de cancer.

L'antigène tumoral CA125 est surexprimé dans 80% des cas de cancer de l'ovaire et ses fonctions sont encore inconnues. En se basant sur l'analogie avec MUC1, qui confère une résistance à l'apoptose induite par les agents génotoxiques, nous avons émis l'hypothèse que CA125 pourrait moduler la réponse à la chimiothérapie des cellules de cancer de l'ovaire. Le but de ce projet est de déterminer l'implication de CA125 dans la sensibilité aux agents cytotoxiques des cellules de cancer épithélial de l'ovaire. Le modèle utilisé consiste en des clones stables dérivés de la lignée de cancer de l'ovaire NIH:OVCAR-3 exprimant un minianticorps, ou scFv, dirigé contre CA125. Ce scFv possède un signal de rétention au RE, ce qui permet de séquestrer CA125 au RE et d'empêcher sa localisation naturelle à la surface cellulaire (clones CA125-knockdown 1:9 #9 et 1:9 #7). Le clone contrôle exprimant un scFv qui ne lie pas CA125 est nommé scFv contrôle. La sensibilité des cellules aux agents cytotoxiques a été mesurée par une mesure de la viabilité cellulaire par essai XTT et les drogues testées sont de différents types: drogues liant l'ADN (cisplatin, cyclophosphamide, doxorubicine), drogues inhibiteurs de la dynamique des microtubules (taxol, vinorelbine) et drogue inhibant la topoisomérase II(etoposide). Les résultats obtenus montrent que les clones CA125-knockdown (1:9 #9 et 1:9 #7) sont de trois à cinq fois plus sensibles aux drogues qui affectent l'ADN (cisplatin, doxorubicine, cyclophosphamide, etoposide) par rapport aux cellules contrôles (scFv contrôle et lignée parentale OVCAR-3). Par contre, aucune différence de sensibilité n'a été observée pour ce qui est des drogues inhibant la dynamique des microtubules. Des analyses des niveaux endogènes des molécules de la cascade apoptotique et de l'activité basale de la caspase-3 n'ont démontré aucune différence significative chez les clones CA125-knockdown par rapport aux cellules contrôles. Lors du traitement des cellules au cisplatin, une augmentation de l'activation des caspases-3 et -9 de même qu'une augmentation de l'activité de la caspase-3 ont été démontrées, ce qui confirme que les cellules meurent par apoptose. Les cellules CA125-knockdown 1:9 #9 et 1:9 #7 montrent des niveaux endogènes de P-AKT plus élevés et une diminution de la localisation nucléaire du facteur de transcription FOXO3a, ce qui suggèrent une modulation de la réponse au stress et de la réparation de l'ADN. De plus, l'expression forcée des domaines unique, transmembranaire et cytoplasmique de CA125 (MUC16-CTD) dans la lignée SKOV-3 confère une résistance de ces cellules aux drogues génotoxiques. Ces résultats suggèrent que CA125 régule la sensibilité aux agents génotoxiques et que le domaine C-terminal est suffisant pour effectuer cette modulation. L'augmentation de la sensibilité aux agents génotoxiques pourrait être causée par la modification de voies en amont de la caspase-9 chez les cellules CA125-knockdown ou par une diminution de la localisation nucléaire de FOXO3a qui affecterait la réparation de l'ADN. Ces données amènent l'hypothèse que le statut tumoral de CA125 pourrait influencer la réponse à la chimiothérapie des patientes atteintes d'un cancer épithélial de l'ovaire.

La carcinose péritonéale (CP) correspond le plus souvent à l'envahissement métastatique de la cavité péritonéale survenant dans 85 à 90% des cas de l'ovaire et 5 à 20% des cancers colorectaux. La pauvreté de des signes cliniques explique que le diagnostic se fasse à un stade souvent avancé. Jusque récemment, le traitement d'une CP était exclusivement palliatif avec une chirurgie de nécessité incomplète et une chimiothérapie systémique, et une survie médiocre. La cause du décès est dans la majorité des cas la carcinose elle-même. Les avancées en matière de chirurgie péritonéale extensive et de chimiothérapie intrapéritonéale combinée ou non à une hyperthermie ont fait naître de nombreux espoirs de curabilité. La chirurgie de cytoreduction complète représente le facteur pronostic essentiel, quelque soit l'origine tumorale primitive. L'association d'une chirurgie et d'une chimiothérapie intraperitonéale a été développée dans le cancer de l'ovaire avec des taux de survie impressionnants. L'hyperthermie induit une destruction sélective des cellules en hypoxie, dans des zones tumorales en acidose, tout en préservant le tissu sain environnant. Pour les patients atteints de CP, une technique nommée CHIP a été developpée permettant de délivrer une chimiothérapie intrapéritonéale en condition d'hyperthermie. Une augmentation importante de la survie de patients atteints de CP colorectal ou de maladie rare du péritoine a été mise en évidence. Des essais cliniques sont en cours afin de vérifier le bénéfice attendu de l'HIPEC dans différentes pathologies. Premièrement, compte tenu de large développement de la laparoscopie, l'adressage de patients avec une carcinose localisée est fréquent. Nous avons développé, sur modèle animal, une technique de péritonectomie laparoscopique avec CHIP à l'oxaliplatine. Les paramètres pharmacocinétiques (PK) en terme d'absorption de la drogue et de pénétration intra-tissulaire ont été analysés avec mise en évidence du rôle favorable de l'hyperpression intraabdominale. Ces travaux ont été publié dans Gynecologic Oncology, dans Annals of Surgical Oncology (2 articles) et inclus dans un chapitre de livre international (Humana Press) concernant la pharmacologie et la PK des sels de platine. Ensuite, nous avons établi un nouveau modèle de pharmacocinétique des populations que nous avons appliqué à la comparaison de deux modes d'administration de la chimiothérapie lors des CHIP à l'oxaliplatine, sur 24 patients. Ce travail a été publié dans Cancer Chemotherapy and Pharmacology. Enfin, différentes études cliniques et pharmacodynamiques (PD) ont été réalisée afin d'évaluer et de prédire la toxicité spécifique des CHIP réalisées au Cisplatine et à l'Oxaliplatine. Trois travaux successifs ont été réalisés pour évaluer la toxicité rénale liée au Cisplatine. Dans une étude pilote de PK, non publiée, de désescalade de dose, nous avons montré que le risque d'insuffisance rénale n'est pas expliqué par la PK (présentation au Congrès de Pharmaco-Oncologistes). Cela a été confirmé dans une étude rétrospective bicentrique avec mise en évidence de facteurs de risque. Ce travail est soumis à publication dans European Journal of Surgical Oncology. Enfin une étude de phase I d'escalade de dose a été réalisée permettant de déterminer la dose optimale de Cisplatine en CHIP et est soumise à publication dans Journal of Clinical Oncology. Compte tenu de la toxicité rénale du cisplatine, une étude prospective de phase II a évalué la morbidité de l'oxaliplatine en CHIP dans le cancer de l'ovaire. Cet essai a été clos de façon anticipée compte tenu du taux d'hémopéritoine et publié dans European Journal of Surgical Oncology. Afin d'analyser et prédire ce risque, une étude PK-PD a été conduite sur 75 patients traités par CHIP à l'oxaliplatine avec une corrélation PK entre l'absorption et la survenue de thrombopénie et d'hémoperitoine. Ce travail est publié dans Cancer Chemotherapy and Pharmacology / Peritoneal carcinomatosis (PC) is usually caused by widespread cancer metastatic cells within the peritoneal cavity and occurred in 85% of ovarian cancer patients and 5-20% of colorectal carcinoma patients. Because of the poverty of symptoms, patients are diagnosed with an advanced stage. PC will be the leading death cause of these patients. Recently, the treatment was limited to standard palliative surgery and intravenous chemotherapy with very poor results in term of survival. The development of new surgical techniques combined with intraperitoneal chemotherapy associated or not with hyperthermia provided new hope of a potential cure for patients with PC. Indeed, complete cytoreductive surgery represents the most important prognostic factor for patients with PC whatever the primary cancer locations. Combined treatment using complete cytoreductive surgery and intraperitoneal chemotherapy has been developed leading to unprecedented survival. Hyperthermia induces a selective destruction of tumor cells in hypoxic and acidic parts of tumors, but leaves normal tissues intact. In addition heat is acting for synergy with the cytotoxic agent. A new technique to deliver intraoperative intraperitoneal chemotherapy associated with hyperthermia, called HIPEC, was developed for patient with PC. It significantly increases survival in patients with colic cancer PC, peritoneal mesothelioma and pseudomyxoma peritonei. Several ongoing trails have been designed to establish the real role of HIPEC for different pathology. First, because of the major development and the widespread use of minimal invasive surgery, recruitment of patients has been profoundly changed with localized PC. We have demonstrated in an experimental study the feasibility and reliability of laparoscopic peritonectomy followed by oxaliplatin based intraperitoneal chemotherapy and its pharmacokinetics consequences regarding the peritoneal drug absorption, the increased tissue diffusion, and the role of intraperitoneal pressure. Several articles were published in Gynecologic Oncology and in Annals of Surgical Oncology and in an international book chapter (Humana Press) concerning pharmacology and pharmacokinetics of platinum salts. Then, to establish a new population pharmacokinetic model and to compare two procedures of drug's delivery during HIPEC, data from 24 patients treated with oxaliplatin based HIPEC were collected and analyzed. This work was published in Cancer Chemotherapy and Pharmacology. Finally, different clinical and pharmacodynamic studies were performed to evaluate the toxicity for patients who underwent complete cytoreductive surgery associated to Cisplatin or Oxaliplatin based HIPEC. Three different works were performed to evaluate the renal toxicity of cisplatin based HIPEC. An unpublished PK study regarding acute renal failure in a dose-deescalation study was presented at a Pharmaco-oncologists Meeting. The results were confirmed in a bicentric retrospective study highlighting some risk factors (Submitted to the European Journal of Surgical Oncology). Finally, a phase I study dose escalation of hyperthermic intraperitoneal cisplatin was conducted with the establishment of the recommended dose of cisplatin for HIPEC (Submitted to the Journal of Clinical Oncology). Because of renal toxicity related to cisplatin based HIPEC, a phase II prospective study was conducted to evaluate the morbidity of oxaliplatin based HIPEC. As a result of this high morbidity rate (hemoperitoneum), this trial was prematurely closed and published in the European Journal of Surgical Oncology. Finally, to evaluate the relationship between oxaliplatin exposure and observed toxicity, a population pharmacokinetics was conducted in 75 patients treated with CRS and oxaliplatin based HIPEC. A PK contribution, relative to the absorption phenomenon, on the severity of the thrombocytopenia and hemoperitoneum was shown. This work was published in Cancer Chemotherapy and Pharmacology

Les objectifs de cette étude étaient de décrire l'usage des médicaments contre l'asthme et d'identifier les facteurs associés à l'usage approprié de ces derniers chez des personnes asthmatiques âgées de 12 à 45 ans. Les données sur l'usage des médicaments et sur les diverses variables indépendantes ont été recueillies par questionnaire téléphonique. Des critères permettant de définir l'usage approprié des médicaments contre l'asthme ont été développés. Au total, 43 des 349 (12,3%) personnes interrogées avaient un usage approprié de leurs médicaments contre l'asthme. Cinq facteurs sont associés à l'usage approprié des médicaments contre l'asthme : avoir de bonnes connaissances sur ses médicaments, se percevoir en bonne santé, ne pas utiliser de chambre d'espacement, avoir rencontré un médecin spécialiste et avoir manqué de médicaments à cause d'un problème d'argent. Les recommandations de la conférence canadienne de consensus sur l'asthme ne sont pas adéquatement appliquées. Des interventions visant à améliorer les connaissances sur les médicaments et les soins aux personnes asthmatiques seraient nécessaires.

En Amérique du Nord, le cancer de l’ovaire est parmi les cancers gynécologiques les plus mortels. Seulement au Canada, en 2004, on estime que le taux de mortalité causé par ce type de cancer est de 66%. Plusieurs équipes de recherche partout à travers le monde mettent beaucoup d’efforts afin de comprendre la physiopathologie de cette maladie. Cependant, un des obstacles majeurs à l’avancement des connaissances dans ce domaine est le nombre restreint de bons modèles cellulaires et animaux. Afin de pouvoir fournir de nouveaux modèles de cellules cancéreuses au monde de la recherche, deux nouvelles lignées cellulaires de cancer ovarien (OVC-116-A et COV-2) ont été établies et caractérisées. Celles-ci ont été caractérisées au niveau de leurs paramètres de croissance (courbe de croissance, clonogénécité, croissance en sphéroïde) et ces analyses ont montré que les deux modèles cellulaires se comportent de façon sensiblement similaire en culture. De plus, le statut de plusieurs marqueurs cellulaires tels les récepteurs de la famille EGFR, les cadhérines classiques ainsi que des récepteurs hormonaux a été évalué pour chaque lignée cellulaire. La tumorigénicité in vivo a aussi été étudiée par des injections sous-cutanées de cellules cancéreuses dans des souris SCID et des souris NUDE et par des injections intrapéritonéales dans des souris SCID. Les deux nouvelles lignées cellulaires croissent dans les animaux. De façon spécifique, la lignée OVC-116-A a montré une croissance très rapide in vivo (environ 14 jours sous-cutanés pour former une tumeur de 1 centimètre de diamètre et 28 jours intrapéritonéal) alors que la lignée COV-2 a montré le phénotype contraire, soit une croissance lente in vivo, lorsqu’injectée dans les animaux. D’autres analyses moléculaires comme des analyses de mutations des gènes TP53, BRCA1, BRCA2 et KRAS ainsi que des caryotypes ont été faits sur chacune des lignées. La lignée OVC-116-A présente une mutation dans l’exon 7 du gène TP53 et une mutation dans le codon 13 du gène de KRAS. Cette lignée cellulaire présente aussi un caryotype simple caractérisé principalement par une trisomie 10 et une translocation entre le chromosome 6 et le chromosome 15. La lignée cellulaire COV-2, quant à elle, montre aussi une mutation dans l’exon 8 du gène TP53 mais aucune mutation dans le gène KRAS. Le caryotype de cette lignée est de type complexe présentant plusieurs trisomies, des tétrasomies et des translocations multiples sur des chromosomes. Finalement, la sensibilité des nouvelles lignées cellulaires aux agents chimiothérapeutiques les plus utilisés durant traitement du cancer ovarien (Cisplatin et Taxol) a été évaluée. Suite à ces résultats, la lignée COV-2 semble être un bon modèle pour étudier la chimiorésistance, car cette lignée semble être résistante à ces drogues. Des études de la viabilité en sphéroïde et à la résistance à l’anoïkose ont démontré que la lignée OVC-116-A est un bon modèle de résistance à l’anoïkose. Par des essais qualitatifs, il a été montré que lorsque cette lignée cellulaire croît en sphéroïde, elle ne montre que très peu de signes de mortalité cellulaire. De plus, par des essais semi-quantitatifs, il a été suggéré que OVC-116-A a la capacité de pouvoir proliférer lorsque celle-ci est maintenue en suspension. Aussi, par une technique quantitative comme un ELISA de type sandwich, il a été possible de montré aucune induction de l’anoïkose que lorsque OVC-116-A croît en sphéroïde. Des immunobuvardages de type Western ont confirmé ces résultats en observant que la pro-caspase 9 et la pro-caspase 3 n’étaient pas activées et que la protéine PARP, substrat de la caspase 3 n’était pas clivée. De plus, les résultats ont montré une surexpression de la protéine Bcl-2 dans les sphéroïdes OVC- 116-A. Cette constatation a permis d’émettre l’hypothèse que la protéine Bcl-2 pourrait jouer un rôle déterminant dans la survie en suspension des cellules de cancer ovarien. Nos résultats suggèrent donc que les nouvelles lignées cellulaires OVC-116-A et COV-2 représentent de bons modèles cellulaires pour étudier la résistance à l’anoïkose des cellules de cancer ovarien et la résistance aux drogues chimiothérapeutiques.

Le mélanome est la forme la plus rare et la plus grave des cancers de la peau. Il présente un fort pouvoir métastatique et à l'heure d'aujourd’hui, il n'y a pas de traitement efficace contre le mélanome disséminé. Le travail présenté dans ce mémoire s'inscrit dans la continuité d'une stratégie de d'adressage spécifique de pro-drogues vers le mélanome initiée au sein de notre laboratoire. Notre concept repose sur la conjugaison d'ICF01012, vecteur à fort tropisme pour les mélanines, avec un principe actif modèle (IUdR) sous forme de pro-drogues à espaceurs clivables de type disulfure d'éthyle carbonate ou pnitrobenzylcarbonate pour une double spécificité (i.e. distribution tumorale et libération spécifique de la tumeur). Un premier travail de fonctionnalisation d'ICF01012 a abouti à la synthèse de sept nouveaux vecteurs qui ont été radio-marqués à l'iode 125 afin d'évaluer leur comportement in vivo chez des souris C57Bl/6J porteuses de mélanome B16F0 par scintigraphie plane gamma et biodistribution ex vivo. Le vecteur radio-iodé présentant le profil pharmacocinétique le plus favorable (fixation tumorale forte, spécifique et durable) a été ensuite sélectionné en vue d'une première validation de notre concept de prodrogues vectorisées. Les entités "IUdR-espaceurs clivables" et leurs analogues non clivables à base d'espaceurs de type mercaptoéthylcarbonate ou benzylcarbonate ont également été synthétisés. L'étude de leur comportement au contact de 2S,3S-dithiothreitol et d'hydrosulfite de sodium (mimant l'action du glutathion et de conditions hypoxiques, respectivement) a montré que la libération de l'IUdR est quasitotale et qu'elle est bien induite par la présence du pont disulfure et du groupement nitré. Sur la base de ces résultats, deux pro-drogues ainsi que leurs analogues non clivables ont été synthétisés par association de la partie vectrice avec l'IUdR et les espaceurs clivables ou non clivables. Les études de biodistribution in vivo de l'IUdR et de la pro-drogue à espaceur disulfure radio-marquées à l'iode 125 ont démontré une absence de vectorisation, imputable à une métabolisation très rapide de la pro-drogue par la suite d'un clivage extrêmement rapide de l'espaceur disulfure in vivo provoquant la libération instantanée de l'IUdR dès les premières minutes qui suivent l'injection de la pro-drogue. Néanmoins, des voies de synthèse et des méthodes de suivi de clivages chimiques transposables ont été mises au point et peuvent être utilisées dans les futures études s'inscrivant dans le cadre d'une chimiothérapie vectorisée du mélanome. / Melanoma is the rarest and the most serious form of skin cancer. It has a high metastatic potential and in today's time, there is no effective treatment against disseminated melanoma. The present work is a continuation of a melanoma targeted prodrug therapy approach initiated in our laboratory. Our concept is based on the combination of ICF01012, vector that displays a high tropism for melanin, with IUdR, a drug model, as cleavable prodrugs containing a disulfide ethyl carbonate or a pnitrobenzylcarbonatespacer type for a dual specificity (i.e. tumoral distribution and specific delivery to the tumor). Functionalization of ICF01012 led to the synthesis of seven new vectors that were 125Iradiolabeled in order to evaluate their behavior in vivo (planar gamma scintigraphy and ex vivo biodistribution) in B16F0 melanoma-bearing mice. The radioiodinated vector having the most favorable pharmacokinetic profile (high, specific and long lasting tumoural uptake) was then selected for a first validation of our targeted prodrugs concept. Entities "IUdR-cleavable spacers" and their analogs with noncleavable spacers (mercaptoéthylcarbonate or benzylcarbonate kind) were also synthesized. The study of their behavior in contact with 2S,3S-dithiothreitol and sodium hydrosulfite (mimicking glutathione and hypoxic conditions actions, respectively) showed that the release of IUdR is almost complete and it is induced by the presence of the disulfide bridge and the nitro group. Based on these results, two prodrugs and their non-cleavable analogs were synthesized by combining the vector part with IUdR and cleavable or non-cleavable spacers. The in vivo biodistribution studies of 125I-radiolabeled IUdR and disulfide spacer based-prodrug showed no vectorization due to a very rapid metabolism of the prodrug following extremely rapid cleavage of the disulfide spacer in vivo causing instantaneous IUdR release in the firstminutes after prodrug injection. However, transposable synthetic routes and cleavage studies have been developed and can be used in future studies within the framework of melanoma targeted prodrug therapy

Ce travail de thèse s’intègre dans la stratégie développée et brevetée par l’UMR 990 INSERM/UdA, qui consiste à exploiter l’affinité d’un vecteur ammonium quaternaire chargé positivement pour les protéoglycanes, afin d’acheminer des agents de diagnostic et/ou de thérapie, pour la prise en charge du chondrosarcome. Du fait de son abondante matrice extracellulaire de nature chondrogénique, de sa faible vascularisation et de son environnement hypoxique, le chondrosarcome est une tumeur chimio- et radio-résistante. Le seul traitement efficace à ce jour reste la chirurgie qui possède un taux de survie à 10 ans de seulement 21% en cas de rechute et dans les formes les plus graves. Dans ce contexte, une prodrogue cytotoxique activable en hypoxie dérivée du cyclophosphamide, de type nitroimidazole (8-QA) et possédant un ammonium quaternaire, a été développée et évaluée in vitro et in vivo, comparativement à son équivalent non « quaternisé » (8) et à un équivalent « quaternisé » mais non activable en hypoxie (10-QA). In vitro, les études par résonance plasmonique de surface (SPR) ont montré que les deux prodrogues « quaternisées », 8-QA et 10-QA possédaient une affinité plus importante pour l’agrécane que la prodrogue 8 ne possédant pas le vecteur ammonium quaternaire. Par la suite, nous avons développé un modèle de culture en 3 dimensions (sphéroïdes) des cellules de chondrosarcome humain HEMC-SS qui reproduit le microenvironnement hypoxique et riche en protéoglycanes retrouvé dans les tumeurs du cartilage in vivo. Les molécules activables en hypoxie 8-QA et 8 ont une activité cytotoxique supérieure en situation d’hypoxie qu’en normoxie, avec une résistance aux traitements augmentée pour le modèle de sphéroïde comparativement aux cellules cultivées en 2-D. In vivo, sur un modèle de xénogreffe de cellules de chondrosarcome humain HEMC-SS implantées sur des souris SCID, modèle préalablement caractérisé en terme d’hypoxie (imagerie photoacoustique, échographie de contraste, Doppler) et de protéoglycanes, la molécule 8-QA entraine (i) une inhibition significative de la croissance tumorale de 62,1%, alors que la molécule 8 et la molécule 10-QA n’ont aucune activité in vivo ; (ii) une diminution des effets indésirables, améliorant ainsi l’index thérapeutique. La caractérisation de l’activité antitumorale sur les tumeurs prélevées a mis en évidence une diminution de l’activité mitotique, une augmentation de l’apoptose (p53S15) et une diminution de la prolifération (PCNA) pour les échantillons traités avec la molécule 8-QA. De plus les études d’immunohistochimie ont montré que cette molécule entraine une augmentation des dommages à l’ADN (marquage γH2Ax) retrouvés majoritairement dans les régions hypoxiques (marquage au pimonidazole). La dernière partie de ce travail de thèse a consisté à optimiser, chez des souris NUDE, de nouveaux modèles in vivo de chondrosarcome humain exprimant à la fois un environnement hypoxique et une matrice extracellulaire riche en protéoglycanes pour affiner la caractérisation de l’activité anticancéreuse de la molécule 8-QA. Pour cela nous avons développé un modèle de xénogreffe de sphéroïdes HEMC-SS implantés en situation sous cutanée et un modèle orthotopique de cellules de chondrosarcome humain HEMC-SS implantées en position paratibiale. Après caractérisation, les premiers résultats d’efficacité antitumorale sur ces deux modèles ont confirmé une activité prometteuse de la molécule 8-QA. En conclusion, ces travaux de thèse auront permis de démontrer que l’exploitation des caractéristiques phénotypiques du chondrosarcome par une approche bi-spécifique est une stratégie prometteuse pour la prise en charge thérapeutique de cette pathologie, certes rare mais redoutable. Il a également contribué à montrer l’importance de l’interaction des cellules tumorales avec leur environnement pour la réponse aux traitements de chimiothérapie. / This work takes place in the strategy developed and patented by our lab UMR 990 INSERM/UdA, that exploits the affinity of positively charged quaternary ammonium to proteoglycans, in order to address diagnostic and/or therapeutic agents for chondrosarcoma management. Due to its abundant chondrogenic extracellular matrix, its poor vascularization and its hypoxic microenvironment, chondrosarcoma is chemo- and radio-resistant. The only effective treatment remains surgical resection that could be at the origin of a 10-years survival rate of 21% in case of local relapse of high-grade tumors. In this context, a quaternary ammonium-conjugated hypoxia-activable prodrug, 8-QA, has been developed and studied in vitro and in vivo respectively to its non-quaternary ammonium conjugated derivative, 8, and to a quaternary ammonium-conjugated non-hypoxia activable 10-QA. In vitro, surface plasmon resonance (SPR) studies evidenced that the two quaternary ammonium-conjugated derivatives, 8-QA and 10-QA, highlighted a higher affinity for aggrecan than non-quaternary ammonium conjugated prodrug 8. We have then developed a 3-D culture model (spheroid) of human chondrosarcoma HEMC-SS cell line that was demonstrated to reproduce the hypoxia and proteoglycan-rich microenvironment similar to in vivo cartilaginous neoplasms. Hypoxia-activated prodrugs, 8 and 8-QA, exhibited a higher cytotoxic activity in hypoxia as compared to normoxia, associated to an increased resistance for 3-D culture respectively to 2-D cells. In vivo, on human HEMC-SS xenograft model implanted on SCID mice and previously characterized in term of hypoxia (photoacoustic and contrast echographic imaging, Doppler), 8-QA derivative induced (i) a significant inhibition of tumor growth of 62,1% while 8 and 10- QA derivatives did not exhibit any antitumor activity; (ii) a decrease of side effects, both improving the therapeutic index. Mechanistic analysis on tumors sampled evidenced a decrease of mitotic activity and proliferation (PCNA), an increase of apoptosis (p53S15) for 8-QA treated tissues. Interestingly, immunohistochemistry studies highlighted that 8-QA caused DNA damages (evidenced by γH2Ax marker) which are mainly localized in hypoxic areas (pimonidazole staining). Finally, we optimized, on NUDE mice, new in vivo human chondrosarcoma models highly expressing simultaneously a hypoxic and proteoglycan-rich microenvironment in order to refine the characterization of 8-QA antitumor activity. For this, we developed a xenograft model of HEMC-SS spheroid implanted subcutaneously and an orthotopic model of HEMC- SS cells inoculated in paratibial location. After characterization, first results of antitumor efficacy on these two models confirmed the promising activity of 8-QA derivative. To conclude, this work demonstrates the proof of concept that exploiting the phenotypic features of chondrosarcoma by a bi-selective approach, is a promising innovative strategy for the therapeutic management of this pathology, relatively rare but redoubtable. This work also demonstrates the role of tumor cell interactions with their environment for tumor growth and response to chemotherapy treatments.