L'identification et la neutralisation des cibles moléculaires impliquées dans les mécanismes de radiorésistance des glioblastomes, approche développée au laboratoire, vise à diminuer le risque de récidive à l'intérieur du volume irradié et donc à allonger la survie des patients. Les travaux antérieurs du laboratoire ont démontré le rôle potentiel de l'interleukine-6 (IL-6) dans les mécanismes anti-apoptotiques impliqués dans la radiorésistance. Nous avons tout d'abord contribué à la validation de l'Interleukine-6 en tant que cible potentielle en rapportant l'association entre une amplification avec surexpression du gène IL-6 et un mauvais pronostic dans une série de 36 glioblastomes. La médiane de survie chute de 22 à 6 mois entre le groupe IL-6 non amplifié et amplifié. Bien que nous n'ayons pas établi de corrélation entre la radiorésistance intrinsèque et le niveau d'expression et de production d'IL-6 in vitro, les données de la littérature nous ont incité à explorer le potentiel thérapeutique d'un blocage des voies PI3K/Akt et JAK/STAT3 situées en aval de l'IL-6. L'inhibition de la voie Akt, dont l'activation a été corrélée à la radiorésistance intrinsèque, permet de radiosensibiliser les glioblastomes in vitro alors que celle de la voie STAT3 s'est révélée sans impact sur la sensibilité à l'irradiation. En accord avec ces résultats, la 2ème approche, consistant en l'utilisation d'anticorps dirigés contre l'IL-6 ou les sous unités qui composent son récepteur conduit à une inactivation de la voie STAT3 sans impact sur la radiorésistance. Au vu des données apportées par ce travail il semble que l'IL-6, malgré son statut de facteur de pronostique, et la voie STAT3 ne soient pas impliqués dans la radiorésistance intrinsèque. Notre hypothèse, en accord avec la littérature, est que l'activation aberrante de la voie STAT3 dans les gliomes, via la production d'IL-6, serait impliquée dans les modifications du micro-environnement telles que l'immunosuppression et l'angiogénèse. Pour tenter d'expliquer la différence de survie entre les deux groupes de patients de la série de 31 glioblastomes, une analyse comparative est en cours d'une part sur les profils génomiques et transcriptomiques par micro-arrays, et d'autre part sur l'état d'activation des voies de signalisation anti-apoptotiques Akt et STAT3 par immunohostochimie. Les données obtenues seront interprétées conjointement avec le niveau d'amplification/expression de l'IL-6 et la survie des patients. Les résultats présentés ici constituent un argumentaire pour l'utilisation d'inhibiteurs d'Akt en combinaison avec l'irradiation dans de futurs essais cliniques.

Les Glioblastomes (GBM) sont des tumeurs cérébrales de trés sombre pronostic malgré leur traitement associant résection chirurgicale et chimio/radiothérapie. Ils contiennent notamment une sous-population de cellules souches/initiatrices de GBM (GIC) impliquée dans la radio/chimiorésistance et la récidive de ces tumeurs en étant capable de générer la majorité des cellules tumorales plus différenciées. Des études ont montré que les cellules tumorales pourraient avoir la capacité de se dédifférencier et d'acquérir un phénotype plus proche des GIC en réponse à des stress. Notre hypothèse est qu'une telle plasticité pourrait avoir lieu en réponse aux radiations ionisantes (RI) et participer à la récidive rapide de ces tumeurs après thérapie. En effet, j'ai montré que l'exposition de cultures primaires de cellules de GBM établies à partir de résection de patients à une dose infra-toxique et cliniquement relevante de RI potentialise à long terme la réacquisition de caractéristiques associées au phénotype des GIC (auto-renouvellement, expression de marqueurs souches et tumorigénicité). J'ai identifié au cours de ce processus (1) une surexpression de la protéine anti-apoptotique Survivine; dont l'inhibition pharmacologique bloque la plasticité radio-induite, (2) une reprogrammation métabolique précoce et (3) une enzyme impliquée dans l'acidification du pH extracellulaire, qui semble favoriser le processus de dédifférenciation radio-induite. A terme, le ciblage des mécanismes impliqués dans de ce processus adaptif aux RI pourrait contribuer à développer des stratégies thérapeutiques innovantes pour radiosensibiliser ces tumeurs. / Glioblastomas (GBM) are some highly lethal brain tumors despite a treatment associating surgical resection and radio-chemotherapy. Amongst these tumors, a subpopulation of radio/chemoresistant GBM stem-like/initiating cells (GIC) appears to be involved in the systematic GBM recurrence through the generation of more differenciated tumoral cells. Recent studies showed that tumor cells may have the ability to dedifferentiate and acquire a GIC phenotype in response to microenvironment stresses. We hypothesized that GBM cells could be subjected to a similar dedifferentiation process after ionizing radiations (IR), then supporting the GBM rapid recurrence after radiotherapy. Indeed, I showed that the exposure of several primo-cultures of differentiated GBM cells isolated from patient resections to a subtoxic and clinically relevant IR dose potentiated the long-term reacquisition of GIC properties (self-renewal ability, expression of stemness markers and tumorigenicity). I also identified during this process (1) an up-regulation of the anti-apoptotic protein Survivin whose pharmacological down-regulation led to a blockade of the IR-induced plasticity, (2) the presence of a metabolic shift occurring quickly after IR and (3) an enzymatic target, which appears to be involved in extracellular acidification under IR and could also potentiate the long term dedifferentiation induced by IR. At term, targeting the mechanisms associated with IR-induced plasticity in order to inhibit the IR-induced adaptive processes will likely contribute to develop some innovating pharmacological strategies for an improved radio-sensitization of these brain tumors.

Les glioblastomes (GB) sont des tumeurs cérébrales extrêmement agressives, très hypoxiques qui récidivent dans les champs d'irradiation malgré un traitement bien conduit qui associe radio et chimiothérapie. L'hypoxie tumorale et les facteurs de transcription inductibles par l'hypoxie (HIF-1alpha et HIF-2alpha) sont des facteurs importants de résistance aux thérapeutiques anti-cancéreuses, en particulier dans les glioblastomes. Récemment, un nouveau partenaire de HIF-2alpha a été identifié. Il s'agit de la protéine Int6 également connue sous le nom d'eIF3e, sous-unité " e " du facteur d'initiation de la traduction eIF3. De façon intéressante, des études ont montré que les niveaux d'expression d'eIF3e étaient associés à l'état d'avancement tumoral, dans les cancers du sein et du colon. Ces données de la littérature suggèrent que le facteur Int6/eIF3e pourrait être une cible particulièrement intéressante dans les cellules de glioblastome. Au cours de ma thèse et dans l'optique de vérifier cette hypothèse, j'ai démontré sur un plan fonctionnel que l'inhibition d'Int6/eIF3e dans différentes lignées de GB diminue la prolifération en provoquant un arrêt du cycle cellulaire en phase G1 et en augmentant la mort cellulaire, notamment par apoptose et par une augmentation des processus autophagiques. Sur un plan moléculaire j'ai mis en évidence que cette diminution de la survie des cellules de glioblastome en réponse à l'inhibition d'Int6/eIF3e est en partie causée par une réduction de l'expression des HIFs. De plus, l'étude de la biosynthèse protéique et en particulier de la traduction, via l'analyse des ARNm associés aux polysomes combinée à une analyse microarray, a permis de mettre en évidence une modulation de la traduction d'ARNm spécifiques permettant d'expliquer les phénotypes observés. Dans une perspective thérapeutique, j'ai pu démontrer que l'association de l'inhibition d'Int6/eIF3e avec les radiations ionisantes potentialise les effets de l'irradiation sur ces cellules de GB. Enfin sur un plan clinique j'ai mis en évidence une corrélation entre la perte d'expression d'Int6/eIF3e et une augmentation de la survie des patients atteints de GB. En conclusion, mes travaux de thèse ont permis de valider Int6/eIF3e comme une nouvelle cible essentielle pour la survie des cellules de glioblastome en régulant la traduction d'ARNm spécifiques. / Glioblastomas (GB) are very aggressive and malignant brain tumors, with frequent relapses despite an appropriate treatment combining surgery, chemotherapy and radiotherapy. In GB, hypoxia is a characteristic feature and activation of the Hypoxia Inducible Factors (HIF-1a and HIF-2a) has been associated with resistance to anti-cancer therapeutics. Int6, also named eIF3e, is the "e" subunit of the translation initiation factor eIF3, and was identified as novel regulator of HIF-2a. Interestingly, studies led in colon and breast cancers showed that high expression of eIF3e was correlated with a bad prognosis. These data suggest that Int6/eIF3e could become an interesting target in cancer cells and particularly in glioblastoma. During my graduate work and to assess this hypothesis, I first demonstrated at a functional level that Int6/eIF3e inhibition leads to a decreased GB cell proliferation induced by a cell cycle arrest in G1 phase and an increased cell death, especially apoptotic and autophagic processes in various GB cell lines. At the molecular level, I showed that this decreased GB cell survival in response to Int6/eIF3e inhibition was partly due to a reduction in HIFs expression. Moreover, the study of protein synthesis mechanisms, and particularly translation, via polysome-bound mRNA and microarray analyses revealed a modulation in the translation of specific subsets of mRNA, which could potentially explain our phenotypes. From a therapeutic prospect, I demonstrated that combination of Int6/eIF3e inhibition with ionizing radiations potentiates radiation effects on GB cells. Finally, immunohistochemistry studies showed that low expression of Int6/eIF3e is correlated with a longer survival for patients with GB, suggesting a potential relevance for Int6/eIF3e as a prognostic marker. In conclusion, my doctoral work allowed us to identify Int6/eIf3e as a new target essential for glioblastoma cell survival through the regulation of translation of specific mRNA subsets.

Deinococcus radiodurans est l'un des organismes les plus radiorésistants connus à ce jour et de manière plus générale, présente une exceptionnelle tolérance aux agents qui endommagent son ADN. Cette bactérie est capable de reconstituer un génome intact à partir de centaines de fragments d'ADN engendrés par exposition aux radiations ionisantes. Ce phénomène de radiorésistance est la conséquence d'une association de plusieurs mécanismes et facteurs agissants de concert lorsque les cellules sont soumises à ce type de rayonnement. Parmi ces facteurs identifiés, on peut citer la présence de certaines protéines spécifiques des Deinococcaceae. Parmi elles, la protéine PprA joue un rôle important dans la radiorésistance de D. radiodurans. Cette protéine qui est fortement induite après irradiation n'a pas d'homologuechez des organismes autres que les Deinococcaceae. Pour essayer de comprendre le rôle de PprA dans la radiorésistance chez D. radiodurans, j'ai effectué une caractérisation approfondie du mutant de délétion ΔpprA. Ce mutant est très sensible aux rayons γ ainsi qu'à d'autres agents qui créent des dommages sur l'ADN comme l'acide nalidixique et la novobiocine. L'étude morphologique de ce mutant et la localisation de la protéine in vivo après irradiation suggèrent que PprA est impliquée dans un mécanisme de ségrégation des chromosomes lors de la division, après irradiation lorsque l'ADN des cellules a été réparé. L'étude du réseau d'interactants de PprA a révélé que ce cette protéine interagit in vivo avec l'ADN gyrase après irradiation et permet la stimulation de l'activité de décaténation de cette dernière sans influencer son activité de surenroulement négatif de l'ADN in vitro. Les phénotypes observés précédemment ont également suggéré une éventuelle interaction entre PprA et les protéines de la famille SMC. Chez D. radiodurans les protéines de la famille SMC sont SMC, SbcC et RecN. De façon surprenante, la délétion du gène recN dans une souche ΔpprA supprime la sensibilité aux agents endommageant l'ADN observée dans la souche simple mutante ΔpprA. Ces résultats suggèrent une interaction génétique entre les gènes pprA et recN, cependant, la nature précise du lien entre les deux protéines PprA et recN reste à établir. / Deinococcus radiodurans, one of the most radioresistant organisms known to date is able to reconstruct an intact genome from hundreds of DNA fragments generated by γ-rays. More generally, this bacterium is also tolerant to other DNA-damaging agents. This exceptional ability to overcome effects of ionizing radiations is due to a combination of several well regulated mechanisms and factors acting together when cells are exposed the radiations. Among these factors, some specific proteins of the Deinococcaceae family which are induced after irradiation can be observed. The PprA protein is one of these specific proteins and has been shown to have an important role in radioresistance in D. radiodurans. This protein is one of the most induced after γ-rays treatment. None homologous protein have been identify for the PprA protein. Characteristics of the ΔpprA mutant were investigated in order to understand the involvement of PprA in radioresistance. This mutant is very sensitive to γ-rays and other DNA damaging agents as nalidixic acid or novobiocin. Phenotypic analyses of this mutant revealed that PprA protein seems to be implicated in chromosome segregation after irradiation when DNA is repaired in cells. Moreover, the PprA protein has been shown to interact in vivo with DNA gyrase after irradiation and to stimulate in vitro the decatenation activity of DNA gyrase, without affecting its DNA negative supercoiling activity. Phenotypes previously observed also suggest a potential interaction between the PprA protein and the protein SMC family which are SMC, SbcC and RecN in D. radiodurans. Surprisingly, we found that disrupting recN gene in a ΔpprA strain abolish the sensitivity to DNA damaging agents observed in a ΔpprA strain. These results suggest that the two genes, pprA and recN interact but the accurate link between the two proteins PprA and RecN remains to be highlighted.

Les glioblastomes (GB) sont des tumeurs cérébrales invasives, résistantes et qui récidivent systématiquement malgré un traitement associant chirurgie, radio- et chimiothérapie. Ces tumeurs de très mauvais pronostic, se caractérisent par une survie médiane de 15 mois. L'agressivité des GB est notamment due à la présence d'une sous-population de cellules souches (GSC). Les GSC sont caractérisées par leurs capacités d'auto-renouvellement, d'expression de différents marqueurs souches, de multipotence et de tumorigenèse. Elles sont fortement impliquées dans la résistance et la récidive tumorale et leur ciblage pourrait améliorer le traitement des GB. Au vu de la littérature et de résultats obtenus au laboratoire, l'intégrine ß8 est apparue comme une nouvelle cible potentielle de ces GSC. Cette intégrine est décrite comme possédant un rôle majeur dans la survie et l'auto-renouvellement des cellules progénitrices neurales saines et sa surexpression est associée à une diminution de la survie des patients. Nous avons alors émis l'hypothèse que l'intégrine ß8 pourrait être impliquée dans le maintien de l'état souche des GSC. J'ai démontré au cours de ma thèse que cette intégrine est surexprimée dans des primocultures de GSC issues de résections de GB ainsi que dans des coupes de tumeurs de patients. De plus, j'ai mis en évidence que ß8 est associée à l'état souche et à des fonctionnalités propres à ces cellules, notamment leur auto-renouvellement, leur viabilité, leur migration et leur radiorésistance. En inhibant sélectivement ß8 dans nos primocultures de GSC par si/shRNA, j'ai en effet observé in vitro une diminution de la formation de neurosphères et de la migration cellulaire ainsi qu'une augmentation de la différentiation et de la mort cellulaire, cette dernière étant potentialisée après irradiation. Enfin, in vivo, j'ai mis en évidence que l'inhibition de ß8 se traduit par une diminution de la tumorigenèse et une augmentation de la survie des souris. En conclusion, mes résultats de thèse permettent d'identifier l'intégrine ß8 comme une protéine membranaire nécessaire au maintien de l'état souche dans les GSC mais surtout comme une potentielle cible thérapeutique radiosensibilisante dans les GB. / Glioblastomas (GB) are invasive, resistant and recurrent brain tumors (median overall survival of 15 months) despite standard treatment including surgical resection, radio- and chemotherapy. This tumor aggressiveness could partly be explained by the presence into the tumor of Glioblastoma-Stem like Cells (GSC), characterized by their ability to self-renew, their higher expression of specific GSC markers, their multipotent aptitude and their high tumorigenic potential. They are strongly involved in tumor resistance and recurrence and their targeting could improve GB treatment. Regarding current literature but also transcriptomic results obtained in our lab, a specific ß8 integrin emerged as a potential selective target in GSC. We then hypothesized that ß8 integrin could be involved in stemness maintenance of GSC. I first demonstrated, during my doctoral thesis, that ß8 is overexpressed in primocultures of GSC isolated from patients resections and also in human GB samples. Moreover, I showed that this integrin could be associated with stemness and features unique to these cells, including self-renewal ability, viability, migration and radioresistance. Indeed, the selective inhibition of ß8 in GSC by si/shRNA resulted in vitro in a decrease of neurosphere formation and migration, associated with an increase of differentiation patterns and cell death, this one being potentiated after irradiation. Finally, in vivo, I showed that ß8 inhibition decreased tumorigenesis and increased mice survival. In conclusion, my doctoral results allow to identify ß8 integrin as a membrane protein essential for stemness maintenance of GSC but mostly as a new potential radiosensitizing therapeutic target for GB.

Les thérapies par irradiation sont utilisées pour traiter la plupart des cas de cancer. Une limitation majeure est l’induction de dommages dans les tissus sains. Par conséquent, l’amélioration du ciblage tumoral est un défi majeur. L'addition de nanoparticules (NPs) est proposée comme une nouvelle stratégie pour amplifier les effets des radiations dans les tumeurs (radiosensibilisation ). Les nanoparticules de Z élevé (platine, or, gadolinium) se révèlent être de bons candidats. Afin de développer de nouveaux nanoagents et d’améliorer les plans de traitement, il est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes fondamentaux impliqués. Il a été observé que les radiosensibilisateurs augmentent l'effet létal des radiations (ions rapides ou rayons gamma). Ceci est attribué à une cascade d'événements multi-échelle qui comprend l'activation des NPs, leur relaxation, suivi de la production de radicaux responsables de la mort cellulaire (dans les eucaryotes). Il n'est pas encore clair laquelle des étapes, entre l’excitation/relaxation électronique des NPs ou la réponse biologique joue le rôle prédominant. Par conséquent, le défi de ma thèse était de tester les effets de radiosensibilisateurs (NPs d'or, de platine ou à base de gadolinium) sur des cellules autres que des cellules eucaryotes. Pour la première fois, l’effet des NPs a été testé sur la bactérie la plus radiorésistante jamais rapportée, D. radiodurans. Les NPs ont également été testées sur E. coli. Des études à l'échelle moléculaire ont été utilisées pour comprendre les mécanismes élémentaires. En résumé, ce travail montre que les NPs radiosensibilisantes amplifient les effets des rayons γ dans les bactéries radiosensibles et radiorésistantes. Ceci est attribué à la production de grappes de radicaux et à l’induction de dommages nanométriques dans l'ADN mais également dans les protéines de réparation. Finalement la radiosensibilisation est un phénomène «universel» qui peut être induite dans tout organisme vivant. En d'autres termes, les mécanismes élémentaires liés à l’excitation/relaxation de la NP jouent un rôle majeur par rapport à la réponse biologique de la cellule. Enfin, un ensemble de méthodes ont été optimisées pour évaluer la toxicité et observer l’internalisation des NPs dans les bactéries. / Radiation therapies are used to treat most of the cancer cases. One major limitation is the damage induced in the healthy tissues and tumor targeting is a major challenge. The addition of nanoparticles (NPs) is proposed as a novel strategy to amplify the radiations effects in the tumors (radiosensitization). The high-Z nanoparticles (platinum, gold, gadolinium) are found to be good candidates. To develop new nanoagents and improve treatment planning, a deeper knowledge of the fundamental mechanisms is required. It was found that radiosensitizers enhance the lethal effect of radiations (fast ions and gamma rays). This is attributed to a multiscale cascade of events, which includes the NPs activation and relaxation, the production of water radicals up to the biological impact in mammalian cells. It is not clear yet what from the early stage processes or from the (eukaryotic) cell response is the key stage of the radiosensitization. Hence, the challenge of my thesis was to probe the effects of radiosensitizers (gold, platinum and gadolinium based nanoparticles) on cells other than eukaryotic cells. For the first time, their effect was tested on the most radioresistant bacterium ever reported Deinoccocus radiodurans (D. radiodurans). For comparison, the nanoparticles were tested on the radiosensitive bacterium E.coli. Additional studies at molecular scale were used to understand the elementary mechanisms. In summary, this work demonstrates that the radiosensitizing nanoparticles amplify the effects of -rays in radiosensitive and also radioresistant bacteria. This is attributed to the production of radical clusters and to the inducetion of nano-size biodamages in DNA but also in repair proteins. Finally, this work proves that the radiosensitization is a “universal” phenomenon that can take place in all living organisms. In other words, it tells that elementary mechanisms play a major role compared to the biological response of the cell. A set of standardized methods for evaluating the cellular uptake and the toxicity of the potential nanodrug was established throughout this study.

Les chordomes sont des tumeurs rares. Elles représentent 1-4% de toutes les tumeurs osseuses. Ces tumeurs à histogénèse notochordienne sont d'origine mésodermique exprimant des marqueurs épithéliaux. Elles sont dans la majorité des cas de bas grade et d’évolutions insidieuses, mais toujours infiltrantes et destructrices pouvant donner des métastases. Au plan thérapeutique, ce sont des lésions réputées pour leur résistance aux cytotoxiques, aux rayonnements ionisants et aux thérapies ciblées actuelles. Leur prise en charge standard consiste en une chirurgie première suivie d'une radiothérapie complémentaire à haute dose. Le taux de contrôle local est de 70% et 50% à 5 ans et 10 ans respectivement et la survie médiane est de 6 ans. Les futurs challenges consistent à mieux définir le volume cible par l’imagerie multimodalité pour une radiothérapie personnalisée voire adaptative tenant compte des modifications tumorales morphologiques et métaboliques en cours de traitement. L’hypoxie est connue depuis longtemps comme un facteur de radiorésistance aux traitements. En effet, l'hypoxie induit un phénotype agressif avec un haut potentiel métastatique, favorisant la progression tumorale. Ces caractéristiques sont intimement liées à certaines modifications biologiques comme l’angiogenèse tumorale et le dérèglement du métabolisme cellulaire du glucose. Une meilleure connaissance de ces facteurs régulateurs des cibles biologiques constitue un vrai challenge pour le clinicien et les industriels dans le cadre du développement de nouvelles thérapeutiques. Dans ce cadre, mon projet de thèse a été construit en trois étapes : (i) nous avons récemment rapporté, pour la première fois, la présence de composantes cellulaires hypermétaboliques et de composantes cellulaires très hypoxiques quiescentes par l'imagerie TEP/CT, (ii) mettre en évidence sur des prélèvements de chordomes provenant de patients, les facteurs régulateurs de l'hypoxie (HIF-1, HIF-2) du métabolisme (GLUT1 ; MCT1 ; MCT4 ; Basigine, CAIX - CAXII) et de l’autophagie (BNIP3) par des techniques d'immunohistochimie ; (iii) quantification de ces marqueurs par des techniques de Western Blot. La corrélation de ces résultats biologiques aux résultats cliniques obtenus, montre que les patients présentant des lésions arborant un métabolisme glycolytique et un processus de survie autophagique présentent un phénotype agressif et radiorésistant. La présence de ces mécanismes de survie est fortement corrélée avec un contrôle local faible et une survie réduite. La mise en évidence de ces mécanismes et de leurs facteurs régulateurs nous permet d’envisager des traitements ciblés en association avec la chirurgie et la radiothérapie. / Chordomas are rare tumors. They represent 1-4% of all bone tumors. These tumors are notochordal histogenesis and mesodermal origin expressing epithelial markers. They are in most cases low grade and have insidious development with destructive and invasive power. Therapeutically, they are known for their resistance to cytotoxic drugs, ionizing radiation and targeted therapies. "Gold standart" treatment for these lesions is a primary surgery followed by high doses of radiotherapy. The local control rate is 70% and 50% at 5 years and 10 years respectively and median survival is 6 years. Future challenges are to define better the target volume by multimodality imaging for radiation therapy or adaptive personalized taking into account changes in tumor metabolic and morphological processing. Hypoxia has long been known as a radioresistance factor. Indeed, hypoxia induces an aggressive phenotype with a high metastatic potential, promoting tumor progression. These characteristics are closely related to certain biological changes such as tumor angiogenesis and disruption of cellular metabolism of glucose. A better understanding of these regulators factors of biological targets is a real challenge for clinicians and industry in the development of new therapies. In this context, my thesis project was built in three steps: (i) we recently reported, for the first time, the presence of quiescent and hypoxic cellular components and hypermetabolic cellular components by PET / CT, (ii) highlight on samples from patients with chordoma, the hypoxia regulatory factors (HIF-1, HIF-2) metabolism (GLUT1, MCT1, MCT4; Basigine, CAIX - CAXII) and autophagy (BNIP3) by immunohistochemistry, (iii) quantification of these markers by immunoblotting techniques. The correlation of these laboratory findings to clinical results showed that patients with lesions displaying a glycolytic metabolism and survival autophagic process have an aggressive and radioresistant phenotype. The presence of these mechanisms is strongly correlated with poor local control and survival reduced. The highlight of these mechanisms and their regulatory factors allow us to consider targeted therapies in combination with surgery and radiotherapy.

Ce travail s’inscrit dans la caractérisation des cellules radiorésistantes dans les cancers du sein, à l’origine des rechutes après traitement. Si de nombreuses données de la littérature indiquent un lien étroit entre la présence des « Cellules Souches Cancéreuses » (CSC) et la résistance aux traitements anticancéreux, la radiorésistance « intrinsèque » des CSC ainsi que les mécanismes impliqués restent encore mal définis.L’équipe du Dr. Weinberg a développé un modèle cellulaire in vitro permettant la génération de CSC mammaires humaines, « CD24-CD44+ », à la suite d’une transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) induite par une exposition au TGF-β1. Basée sur l’utilisation de cellules mammaires humaines saines qui ont été ensuite immortalisées puis transformées, ce modèle a permis d’approfondir la compréhension de nombreux processus tumoraux tels que la TEM.Ainsi, dans ce contexte, mon projet de thèse a consisté à utiliser ce modèle afin de comparer la radiosensibilité des cellules « CD24-CD44+ » à celle des cellules « CD24+CD44- ». Le choix du modèle repose sur le fait qu’il permet la comparaison de cellules à deux stades différents de la progression tumorale.Après un rappel des connaissances nécessaires à la compréhension de ce travail, le manuscrit présente dans un premier temps la caractérisation du modèle cellulaire utilisée puis la réponse à l’irradiation des cellules du modèle. L’étude de la réponse à l’irradiation a permis de décrire le phénotype de radiorésistance des cellules « CD24-CD44+ » à travers un faible blocage en G2/M, une faible proportion de cellules polyploïdes ainsi qu’une capacité accrue à donner une descendance après irradiation (10 Gy).Ensuite, l’implication des mécanismes de mort apoptotique des cellules « CD24-CD44+ » dans le phénotype de radiorésistance a été montré. Ainsi, la mort cellulaire réduite retrouvée dans les « CD24-CD44+ » est liée à une plus faible activation des voies apoptotiques.Dans un dernier temps, l’identification d’une signature transcriptionnelle de gènes de détoxification lors de la caractérisation des cellules de notre modèle a permis de mettre en évidence la modulation radioinduite de deux de ces gènes, SOD2 et HMOX1, après stress radioinduit dans les cellules « CD24-CD44+ ». / This works aims at characterizing radioresistant cells within human breast cancer development that is responsible for treatment failure and cancer recurrences. Although the literature is flourishing with papers tightly linking the presence of "Cancer Stem Cells" to cancer treatment resistance, the intrinsic radioresistance of those "CSC" and the mechanism involved have yet to be established.Dr. Weinberg and his team have developed an in vitro cell model that produces mammary tumor cells noted « CD24-CD44+ » after an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) induced by TGF-β1. This model is based on healthy human mammary cells that have been immortalized and transformed.Within this context, my Ph.D. project has focused on using this new model in order to compare the radiosensibility of two cell lines: the « CD24-CD44+ » cells and the « CD24+CD44- » one. Underlying this choice is the fact this model allows for a comparison of two cellular populations at distinct stage of the tumor’s development.This work has shed light on apoptotic and detoxification mechanism involved in the radio resistant behavior of the « CD24-CD44+ » cells. After a brief introduction of key concepts required to the understanding of this work, this manuscript will begin by presenting the characterization of the chosen model, then a study of the radiation response that enabled a first description of the « CD24-CD44+ » cell radioresistant phenotype through a mild stop at the G2/M stage of the cell cycle, the presence of polypoid cells and a high progeny generation ability after exposure to radiation.Furthermore, this works shows implications of apoptotic mechanism of « CD24-CD44+ » cells with a radioresistance phenotype. Hence, we were able to show that reduced cell death observed for the « CD24-CD44+ » cells is linked to a lower activation of apoptotic pathways.Finally, the last part will present detoxification mechanism involved in « CD24-CD44+ » radioresistance phenotype, showing an altered transcriptional signature of two detoxication genes SOD2 and HMOX1 after exposure to radiation.

Dans le glioblastome (GBM), nous avons recherché et comparé les facteurs de radiorésistance parmi 8 lignées cellulaires et 11 xénogreffes (5 issues de patients, et 6 issues de lignées cellulaires traitées par radiothérapie hypofractionnée 6x5Gy) en utilisant la technologie RPPA (Reverse Phase Protein Analysis). Nous avons exploré 89 marqueurs protéiques appartenant à 10 voies différents: réparation de l’ADN, cycle cellulaire, apoptose, adhésion/cytosquelette, stress et voies PI3K, tyrosine kinase, MAPK/ERK, SAPK/JNK et NFκB. Aucun marqueur de radiorésistance n’était commun entre les expériences in vitro (FAK, HSP90, HSF1, HSPA2, vimentine et integrin β4) et in vivo (EGFR, CHK1 et VCP). Nous avons ensuite, dans ces mêmes modèles de GBM étudié la potentielle radiosensibilisation par une classe innovante d’inhibiteurs de la réparation de l’ADN, Dbait. Les molécules Dbait sont de courts fragments d'ADN double brin mimant une cassure de l'ADN. Ces molécules agissent comme des leurres vis-à-vis des enzymes de signalisation des dommages à l'ADN notamment PARP et DNA-PK qui sont hyperactivés, ce qui empêche la détection des dommages réels induits par les traitements et inhibe la réparation. Les molécules Dbait se sont montrées capables de radiosensibilier 6/11 modèles de xénogreffes de GBM. Les marqueurs prédictifs de la résistance à Dbait étaient Phospho-H2AX/H2AX, Phospho-NBS1/NBS1 et cleaved-PARP/PARP. Nous avons également mené une étude préclinique étudiant le potentiel radiosensibilisant de Dbait/DT01 (DT01 = forme clinique de Dbait) dans un modèle de mélanome. Les souris xénogreffées sur flanc étaient traitées par un protocole de RT « palliatif » (10x3Gy) ou « curatif » (20x3Gy) en combinaison à des injections de Dbait/DT01. Les souris traitées par la combinaison Dbait/DT01 et RT avaient une inhibition significative de la croissance tumorale et une survie prolongée. Du fait de l’ensemble des résultats précliniques positifs sans toxicité ajoutée, les molécules Dbait/DT01 ont été testées lors d’un essai clinique de phase I en association à la RT dans le cadre des métastases cutanées de mélanome avec des résultats très encourageants. / We aimed to identify predictive biomarkers of GBM radioresistance in 8 GBM cell lines, 6 corresponding cell lines derived xenografts (CDX) and 5 patient derived xenografts (PDX) treated with hypofractionated radiotherapy (6x5Gy), using an RPPA (Reverse Phase Protein Array) approach. We explored 89 potential protein markersinvolved in DNA repair, PI3K pathway, apoptosis, tyrosine kinase signaling, stress signaling, cell cycle, MAPK/ERK signaling, SAPK/JNK signaling, NFκB signaling and adhesion/cytoskeleton. In vitro identified biomarkers (FAK, HSP90, HSF1, HSPA2, vimentin and integrin β4) were not found in vivo. The markers specific of in vivo resistance were Phospho-EGFR/EGFR, Phospho-Chk1/Chk1 and VCP. Then, in these GBM models, we assessed the potential radiosensitization of an innovative DNA repair inhibitor, Dbait. Dbait consists of 32 bp deoxyribonucleotides that mimics DNA lesions. They act as a bait for DNA damage signaling enzymes, the polyadenyl-ribose polymerase (PARP), and the DNA-dependent kinase (DNA-PK), inducing a “false” DNA damage signal and ultimately inhibiting DNA repair. 6/11 GBM models had been radiosensitized by Dbait.Phospho-H2AX/H2AX, Phospho-NBS1/NBS1 and cleaved-PARP/PARP were predictive markers of Dbait resistance. We assessed the efficacy and safety of combining radiotherapy with Dbait/DT01 (DT01 = clinical form of Dbait) in a preclinical model of human melanoma. Nude mice subcutaneously engrafted with human melanomas (SK28) were or were not treated with Dbait/DT01, “palliative” (10x3Gy) or “radical” (20x3Gy) RT, or a combination of Dbait/DT01 and RT. Mice treated with Dbait/DT01 and RT combination had significantly better tumor growth control and longer survival compared to RT alone with the “palliative” protocol or the “radical” protocol. The results of this preclinical study led to the conduction of a phase 1 study in the palliative management of melanoma in-transit metastases (DRIIM trial) with very encouraging results.

Le cancer du sein est le cancer est le plus fréquent chez la femme. Les patientes traitées par chirurgie, radiothérapie et/ou chimiothérapie peuvent souffrir de rechute et de métastases à plus ou moins long terme. Il est à présent admis qu’une sous-population de cellules particulières dénommées cellules souches cancéreuses (CSC) jouent un rôle important dans ces événements. Il est donc crucial d’isoler et de caractériser ces cellules pour comprendre leurs propriétés particulières d’autorenouvellement et de résistance aux traitements, ce qui permettra de les cibler pour obtenir des traitements plus efficaces. C’est dans ce contexte que s’inscrit ma thèse. Au laboratoire, j’ai mis en place un modèle de souris bi-transgéniques (bi-Tg) en croisant les souris C3(1)-Tag qui est un modèle de tumorigenèse mammaire (et prostatique) bien établi, avec les souris Tg s-SHIP-GFP qui ont déjà permis l’isolement de CS normales mammaires (et prostatiques). Dans ces souris, le promoteur de s-SHIP contrôle l’expression de la protéine fluorescente GFP ce qui permet de marquer et d’isoler les cellules. Dans les tumeurs mammaires développées par ces souris biTg, j’ai isolé une population rare de cellules s-SHIP/GFP+ possédant des propriétés de CSC, surtout une capacité à former des sphères en culture non adhérente et à générer des tumeurs par transplantation en série très supérieure à celle des autres cellules de la tumeur. Une analyse transcriptomique globale qui compare les gènes dérégulés dans les cellules GFP+ et GFP- a mise en évidence le rôle d’un composant de la voie Notch dans le maintien de la pluripotence.Nous avons également dérivé plusieurs lignées cellulaires dénommées MAM (pour mammary) à partir des tumeurs mammaires. L’une d’entre, MAM326 est une lignée de cellules épithéliales cancéreuses avec environ 10 % de cellules GFP+ et j’ai démontré que les cellules GFP+ sont plus résistantes à différentes drogues anti-cancéreuses ainsi qu’à l’irradiation. Une analyse transcriptomique a été réalisée pour déterminer la signature moléculaire de cette résistance. Cette analyse a mis en évidence une vingtaine de gènes significativement surexprimés dans les cellules GFP+, et dont la nature et/ou la fonction est pertinente dans le contexte d’une résistance aux traitements antitumoraux. L'un de ces gènes est la synucléine-gamma dont le rôle dans la radiorésistance du cancer du sein a été suggéré mais non démontré expérimentalement. Par la surexpression ectopique et l’inhibition par siRNA, nous avons démontré que la synucléine gamma peut induire la radiorésistance dans plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein. En conclusion, ces résultats démontrent que l’expression de s-SHIP est un marqueur de CSC mammaires chez la souris et son intérêt dans l’étude du cancer du sein. / Breast cancer is the most common cancer in women worldwide. The isolation and characterization of breast cancer stem cells (CSC) are crucial for understanding cancer biology and revealing potential therapeutic targets. One of the major issues in the study of CSC is the lack of reliable markers. A transgenic mouse model (Tg 11.5kb–GFP) was generated using the 11.5kb s-SHIP (stem-SH2-containing 5’-Inositol Phosphatase) promoter that specifically expressed enhanced green fluorescent protein (GFP) in embryonic and various tissue stem cells. In the mammary gland, previous experiments showed that GFP labels puberty cap cells and pregnancy basal alveolar bud cells, and it has been demonstrated that these mammary GFP+ cells are activated tissue stem cells. In order to determine if s-SHIP promoter expression could also mark mammary cancer stem cells, we generated a bi-transgenic mouse model by crossing Tg 11.5kb-GFP mice with Tg C3(1)/Tag mice. Tg C3(1)/Tag mice express SV40 T antigen under the regulatory control of the rat prostatic steroid binding protein C3(1) gene. In female mice, the transgene is expressed primarily in the mammary gland. Mice develop mammary hyperplasia by 3 months of age with subsequent development of mammary adenocarcinoma by 6 months of age.Here we show the presence of a rare population of GFP+ cells, which are also CD24+/CD49f+/CD29+ in mammary tumors of female bi-transgenic mice. As compared to GFP- cells, GFP+ cells exhibit both a higher tumor sphere-forming potential, and a higher tumorigenicity when transplanted into SCID and FVB recipient mice. Moreover, upon subsequent transplantation, the GFP+ cells generated heterogeneous tumors that displayed properties similar to the primary tumor. Transcriptomic analysis of these GFP+ vs GFP- cells revealed several differentially expressed genes including one protein implicated in the Notch pathway. In addition, from the murine mammary tumor, I have derived a cell line containing a s-SHIP/GFP+ subpopulation that shows resistance to chemotherapy and radiation. I have further studied this subpopulation and found that synuclein gamma could confer radiation resistance to breast cancer cells. Altogether, these results demonstrate that s-SHIP promoter expression is a marker of mammary CSC that enables their identification and isolation via a single consistent parameter.