Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les catalases, les peroxydases et les catalase-peroxydases sont des hémoprotéines, dont l'activité enzymatique essentielle est la régulation de la concentration cellulaire du peroxyde d'hydrogène. Au cours de ce travail de thèse, nous avons mis en évidence et caractérisé, dans ces protéines, des intermédiaires réactionnels issus de l'oxydation de tyrosines et/ou de tryptophanes, alternatifs au composé I, [Fe(IV)=O Por•+]. La prise en compte de la formation de tels radicaux protéiques nous a amené à réexaminer le mécanisme des catalases et des peroxydases, jusque là centré sur l'oxydo-réduction de l'hème. Pour déterminer les structures électroniques et la réactivité des intermédiaires réactionnels, nous avons utilisé une approche multidisciplinaire combinant les spectroscopies de Résonance Paramagnétique Electronique (RPE) multifréquences (9-285 GHz), d'absorption électronique UV-visible par stopped-flow, ainsi que la mutagenèse dirigée et le marquage isotopique. L'étude comparative de huit catalases, provenant de souches bactériennes et de mammifères, nous a permis de démontrer que la température de réaction, le pH et l'excès d'oxydant favorisent la formation de l'intermédiaire [Fe(IV)=O Tyr•], résultant du transfert d'électron intramoléculaire entre la tyrosine et la porphyrine dans les catalases de foie de boeuf, d'érythrocytes humains, de B. abortus et de M. lysodeikticus. Nos études ont montré que l'intermédiaire [Fe(IV)=O Por•+] est prédominant à T ≥ 20°C. Ceci explique pourquoi les études cinétiques de la littérature, pour lesquelles seule l'absorption UV-visible à température ambiante a été utilisée, n'avaient pas permis de mettre en évidence la formation du radical tyrosyle. Nos résultats expliqueraient aussi les différences d'efficacité de dismutation du peroxyde d'hydrogène de ces catalases. En effet, le transfert spontané d'électron entre la tyrosine et la porphyrine, favorisé dans certaines catalases, serait en compétition avec la réaction entre l'intermédiaire [Fe(IV)=O Por•+] et le peroxyde d'hydrogène. Dans le cadre d'études spécifiques sur les catalase-peroxydases (KatGs) et en utilisant la catalase-peroxydase de B. pseudomallei comme cas d'étude, nous avons pu mettre en évidence la formation d'un radical tyrosyle et de deux intermédiaires tryptophanyles, dont l'un est formé sur le Trp330, équivalent au site radicalaire de la cytochrome c peroxydase. Nous avons démontré que l'intermédiaire [Fe(IV)=O Por•+] réagit avec l'ABTS et que le [Fe(IV)=O Trp330 •+] n'est pas l'intermédiaire réactif vis-à-vis de l'isoniazide (antibiotique utilisé dans le traitement de la tuberculose). Notre étude comparative de sept catalaseperoxydases a démontré que le site de formation du radical tryptophanyle est unique pour chaque enzyme, mais peut différer entre deux protéines, ce qui expliquerait en partie leurs différences de réactivité vis-à-vis de l'ABTS et de l'isoniazide. Nous avons montré que dans les catalase-peroxydases, les radicaux protéiques peuvent jouer le rôle de cofacteurs dans l'oxydation des substrats et que le mécanisme de la réaction de dismutation du peroxyde d'hydrogène diffère de celui des catalases monofonctionnelles. Afin de comprendre les propriétés physico-chimiques permettant et favorisant la formation des radicaux protéiques, en tant qu'intermédiaires alternatifs à l'intermédiaire [Fe(IV)=O Por•+], nous avons caractérisé une peroxydase de raifort reconstituée, dans laquelle l'hème à été remplacé par un hème lié par liaison covalente à une tyrosine ou à un tryptophane.

La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative qui se caractérise par la perte progressive des neurones dopaminergiques (DA) de la substance noire, une structure sous-corticale des ganglions de la base. Si la majorité des cas sont sporadiques, l'exposition à des facteurs environnementaux (composés organochlorés, pesticides) ou des mutations associées à une quinzaine de gènes (dardarine, -synucléine,...) sont connues pour être à l'origine de formes de cette maladie. L'-synucléine est également le composant majoritaire des corps de Lewy, inclusions cytoplasmiques présentes dans les neurones DA des patients. Pendant mon doctorat, je me suis attachée à comprendre les mécanismes de neurotoxicité induits par le paraquat (PQ), un générateur de stress oxydatif impliqué dans la MP. Ces recherches ont mis en évidence une implication de la signalisation DA dans la toxicité du PQ dans le système nerveux central par l'activation aberrante d'un récepteur DA de type D1, impliqué dans la mémoire chez la drosophile. L'inactivation de ce récepteur dans les neurones glutamatergiques protège significativement les drosophiles contre les effets délétères du PQ. Je me suis également intéressée aux mécanismes de neurotoxicité de l'-synucléine chez la drosophile et son rapport avec le stress oxydatif. Cette étude m'a mené au développement d'une technique de mise en culture du système nerveux central entier de drosophile permettant l'étude des effets progressifs de l'-synucléine sur la dynamique vésiculaire dans les axones DA par des expériences de FRAP. Ces travaux contribuent à mieux comprendre les rapports entre dopamine et stress oxydatif dans la pathogenèse de la MP

Le tabagisme actif par la mère expose le fœtus en développement à des agents qui peuvent traverser la barrière placentaire et interférer avec les fonctions placentaires. Un large éventail de fonctions immunologiques, pourrait être compromises. Dans cette étude, nous avons évalué l'effet de l'extrait de la fumée de cigarette (CSE) sur les macrophages isolés à partir de placentas humains (pMφs), qui sont les principaux partenaires de l'immunité de fœto-maternelle innée. J’ai pu montrer que le CSE inhibe la formation des cellules géantes multinucléées (MGC). Cette propriété du CSE est spécifique aux macrophages car la fusion des macrophages dérivés des monocytes est inhibée lors de la formation de granulomes in vitro. J’ai également étudié l'absorption de particules et la production de cytokines par pMφs exposés au CSE. Le CSE a inhibé l'absorption des particules de zymosan, mais pas celle du zymosan opsonisé, ce qui suggère qu’il interfère avec les récepteurs phagocytaires et non phagocytaires. Le CSE augmente la libération de TNF et d'IL-33, et une diminue celle de l'IL-10, ce qui montre que l'équilibre entre les cytokines est affecté par le CSE. En outre, l’expression des métalloprotéinases telles que les MMP-1, MMP-10 et MMP-12, connues pour être impliquées dans le remodelage des tissus et la fusion des macrophages est dérégulée. Enfin, j’ai montré que la nicotine, l'un des principaux composés de tabac, n'a pas affecté les propriétés fonctionnelles des pMφs. / Active smoking by the mother exposes the developing fetus to agents that can cross the placental barrier and interfere with placental functions. A wide range of immunological functions, including innate and adaptive immune responses, might be impaired. In this study, we assessed the effect of cigarette smoke extract (CSE) on macrophages isolated from human placentas (pMφs), which are major partners of innate feto-maternal immunity. I showed that CSE significantly inhibited the formation of multinucleated giant cells (MGCs). This property of CSE is specific to macrophages because the fusion of monocyte-derived macrophages is inhibited during the in vitro formation of granulomas. I also investigated particle uptake and cytokine production by pMφs exposed to CSE. CSE inhibited the uptake of zymosan, but not that of opsonized zymosan, suggesting that it interferes with phagocytic receptors, not with the phagocytic machinery of pMφs. CSE increased the release of Tumor Necrosis Factor and interleukin-33, and decreased that of interleukin-10, demonstrating that the balance between inflammatory and anti-inflammatory cytokines is affected by CSE. Furthermore, CSE enhanced the expression of metalloproteinase (MMPs) genes such as MMP-1, MMP-10 and MMP-12, known to be involved in tissue remodeling including macrophage fusion. Finally, I showed that nicotine, one of the major compounds of tobacco, did not affect the functional properties of pMφs.

La NADPH oxydase de phagocyte est un complexe enzymatique impliqué dans la défense immunitaire contre les pathogènes. Elle est constituée du flavocytochrome b558 membranaire (Cyt b558), composé de deux sous-unités (gp91phox et p22phox) et de quatre sous-unités cytosolubles, p47phox, p67phox, p40phox, et Rac. Sa fonction est de produire au niveau de la paroi des pathogènes des ions superoxyde (O2•−) qui sont transformés en d'autres espèces réactives de l'oxygène (ROS) qui attaquent les lipides, les protéines et l’ADN environnants. Après activation du phagocyte, les sous-unités cytosoliques subissent des modifications post-traductionnelles et migrent vers la membrane pour constituer le complexe NADPH oxydase activé. Le rôle délétère des ROS dans les maladies est connu depuis longtemps. Le but de ma thèse a été d’étudier l’influence de molécules exogènes qui induisent une augmentation du stress oxydatif, sur l’activité de la NADPH oxydase.Dans ce travail, nous avons étudié le fonctionnement de la NADPH oxydase dans un système in vitro dans lequel l’enzyme était activée par la présence d'acide arachidonique (AA). J’ai étudié l'influence de deux types de molécules: une classe de lipides et des nanoparticules (NPs). Pour simplifier le système, nous avons remplacé l’ensemble des sous-unités cytosoliques par une protéine unique appelé trimère qui correspond à une fusion des trois protéines cytosoliques p47phox, p67phox et Rac. Nous avons montré que le trimère est fonctionnellement comparable aux sous-unités cytosoliques séparées. La vitesse de production de O2•−, sa dépendances en fonction de la concentration en AA et de la température, et sa sensibilité aux radicaux libres étaient comparables lorsque le trimère ou les sous-unités séparées étaient utilisés.J’ai étudié les conséquences de la présence de cholestérol et de ses formes oxydées sur la production de O2•− par la NADPH oxydase. Nos résultats montrent clairement que le cholestérol et l’oxystérols ne sont pas des activateurs efficaces de la NADPH oxydase. L’addition d’une quantité physiologique de cholestérol déclenche une faible production d’ions superoxyde. L’addition de cholestérol à des concentrations du même ordre de grandeur pendant le processus d'assemblage (en présence de AA), a un rôle inhibiteur sur la production d’O2•−. Le cholestérol ajouté agit sur les composantes, cytosoliques et membranaires, conduisant à un assemblage imparfait. En conclusion, le cholestérol déjà présent dans la membrane des neutrophiles est optimale pour le fonctionnement de la NADPH oxydase.Il était intéressant de vérifier l'influence des nanoparticules de dioxyde de titane (TiO2) et de platine (Pt) sur le comportement de la NADPH oxydase sachant que l'internalisation cellulaire de ces NPs a pour effet d’activer les neutrophiles et les macrophages et contribue à une sur-production de ROS. En l’absence d'activateur mais en présence de NPs de TiO2 ou Pt, aucune production de O2•− n’était détectée indiquant que les NPs de TiO2 et Pt sont incapables d'activer le complexe par eux-mêmes aussi bien dans le système acellulaire que dans les neutrophiles. Cependant, une fois la NADPH oxydase activée (par AA), la vitesse de production des O2•− est augmentée jusqu’à 40% de sa valeur en l’absence de NPs de TiO2, cet effet étant fonction de leur concentration. Par contre, les NPs de Pt n’ont aucun effet sur l’activité de la NADPH oxydase aussi bien in vitro que dans les neutrophiles. En conclusion, l'hyperactivation de la NADPH oxydase et l'augmentation subséquente de la production de ROS induites par les NPs de TiO2 pourraient participer au développement du stress oxydatif tandis que l'absence d'effet Pt-NPs suggère qu'ils ne provoquent pas de sur-inflammation. / NADPH oxidase from phagocytes is a multi-subunit enzyme complex involved in the innate defense of organisms against pathogens. It is composed of the membrane-bound flavocytochrome b558 (Cyt b558), comprising two subunits (gp91phox, and p22phox) and four cytosolic components, p47phox, p67phox, p40phox, and Rac. Its function is to produce in the vicinity of the pathogen, superoxide ions that are transformed subsequently into other reactive oxygen species (ROS) and will damage lipids, proteins and DNA. Upon phagocyte activation, the cytosolic subunits undergo posttranslational modifications and migrate to the membrane bound Cyt b558 to constitute the activated NADPH oxidase complex. The damaging role of ROS in cardiovascular diseases has been known for some decades. The aim of my thesis was to study the influence on NADPH oxidase activity, of molecules coming from food and industrial products and known to be involved in increase of oxidative stress.In this work, we studied the NADPH oxidase functioning in an in vitro system in which the components of the enzyme are mixed and activated by the introduction of an amphiphile the arachidonic acid (AA). During my PhD, I have studied the influence of two types of oxidative stress participants: lipids and nanoparticles (NPs). For simplicity, we have replaced the cytosolic subunits by a single protein called trimera, which is a fused construction of three cytosolic proteins p47phox, p67phox and Rac. We have shown that trimera is functionally comparable with the separated cytosolic subunits. The rates of production of O2•−, the dependences of the activity in function of AA concentration and temperature, the presence of two states in the activation process and the sensitivity of NADPH oxidase to free radicals were comparable when either trimera or separated subunits were used.I investigated the consequences of the addition of cholesterol on NADPH oxidase, on the production of ROS. Our results clearly show that cholesterol and oxysterols are not efficient activators of NADPH oxidase. Concentrations of cholesterol similar to what found in neutrophiles trigger a low superoxide production. Addition of cholesterol during the assembly process (in presence of AA) at similar or higher concentrations, has an inhibitory effect on the production of O2•−. Added cholesterol acts on both cytosolic and membrane components, leading to imperfect assembly and decreasing the affinity of cytosolic subunits to the membrane ones. In conclusion, we showed that the cholesterol already present in the phagocyte membrane is optimal for the function NADPH oxidase.It was of interest to check the influence of titanium dioxide (TiO2) and platinum (Pt) NPs on NADPH oxidase especially that cellular internalization of NPs was shown to activate neutrophils and contribute to O2•− overproduction via NADPH oxidase. In the absence of activators and presence of TiO2 or Pt NPs, no production of O2•− could be detected in in vitro system as well as in neutrophils indicating that TiO2 and Pt NPs were unable to activate by themselves the complex. However once the NADPH oxidase was activated by AA, TiO2 NPs increased the rate of O2•− production by up to 40%, this effect being dependent on their concentration. Differently, Pt NPs had no effect both on in vitro system as well as on neutrophils. In conclusion, the hyper-activation of NADPH oxidase and the subsequent increase in ROS production by TiO2 NPs could participate to oxidative stress development while the absence of Pt-NPs effect suggest that they do not induce inflammation status via this complex.

Les cancers papillaires de la thyroïde (PTC) sont les tumeurs endocrines les plus courantes et représentent 2-3% de tous les cancers humains. Les altérations génétiques les plus pertinentes trouvées dans ces tumeurs sont des mutations dans les gènes BRAF et RAS, et des translocations du gène RET. Ces translocations oncogéniques, connues sous le nom de RET/PTC, résultent de la fusion de RET avec des gènes partenaires non-apparentés. L’exposition aux radiations ionisantes est le facteur de risque le plus important pour la formation de RET/PTC. Durant ces dernières années, notre groupe a mis en évidence un rôle crucial des espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans la formation de RET/PTC dans des cellules thyroïdiennes in vitro et a notamment montré que l'irradiation (IR) induit l’établissement d’un stress oxydatif persistant du aux ROS produites par la NADPH Oxydase DUOX1, laquelle est induite à post-IR. Cela conduit à des dommages à l'ADN. Les enfants présentent un risque significativement plus élevé de développer des cancers radio-induits de la thyroïde exprimant RET/PTC, probablement en raison du taux de prolifération élevé des cellules. Ceci suggère que la dynamique de réplication pourrait être impliquée dans la formation de la translocation RET/PTC1. En effet, il a été montré que l'induction pharmacologique d’un stress réplicatif peut favoriser la formation de RET/PTC in vitro dans les cellules thyroïdiennes. Ainsi, pour déterminer si un stress réplicatif peut contribuer aux effets à long terme de l'irradiation: à savoir une persistance des lésions de l'ADN et la formation de RET/PTC1, nous avons analysé les effets à post-IR dans les cellules NTHY-ori3.1. Nos résultats confirment qu’une irradiation des cellules aux rayons X à la dose de 5 Gy induit deux vagues de stress oxydatif: une première vague forte mais transitoire qui se produit dans les minutes qui suivent l'irradiation et une deuxième vague dont l’ augmentation débute 2 jours après l'irradiation pour persister ensuite. Ces deux pics de stress oxydatif conduisent à deux pics de dommages à l'ADN. L'irradiation des cellules à cette dose n’a aucun effet sur la prolifération et sur la progression du cycle cellulaire. Cependant, plusieurs marqueurs de stress réplicatif sont exprimés trois jours après l'irradiation. Par ailleurs, l'analyse de la dynamique de réplication révèle une diminution de la vitesse de réplication à post-IR qui est contrecarrée par les antioxydants, suggérant qu’un stress oxydatif peut contribuer à un stress réplicatif. Enfin, par ChIP-QPCR, nous observons que les gènes impliqués dans RET/PTC1 présentent plus de cassures double brin que des gènes endogènes, et ce, trois jours après l'irradiation. Ainsi, nous proposons qu’un stress réplicatif induit par un stress oxydatif pourrait être potentiellement impliqué dans l'étiologie des tumeurs RET/PTC-positives. / Papillary thyroid cancers (PTC) are the most common endocrine tumors and account for 2-3% of all human cancers. The most relevant genetic alterations found in these tumors are mutations in the genes BRAF and RAS, and chromosomal translocations in RET, a proto-oncogene activated in 15-20% of PTCs. These oncogenic translocations, known as RET/PTCs, result from the fusion of RET with unrelated partner genes. Ionizing radiation is a major risk factor for RET/PTC formation, however, the molecular mechanisms involved in these radioinduced translocations just begun to be unveiled. In the past few years, our group has reported a critical role for reactive oxygen species (ROS) in the formation of RET/PTC in thyroid cells in vitro and has also shown that irradiation can elicit a persistent oxidative stress caused by the upregulation of the NADPH Oxidase DUOX1 that leads to DNA damage, mediating at least part of the effects of radiation. However, how could ROS lead to the formation of RET/PTC is not fully understood. Children are at significantly higher risk of developing radio-induced thyroid tumors, specially RET/PTC positive, probably due to the intense proliferation rate of their follicular thyroid cells. This epidemiological observation prompts the assumption that replication dynamics may be involved in RET/PTC formation. Indeed, it has been shown that the pharmacological induction of replicative stress can stimulate the in vitro formation of RET/PTC in thyroid cells. Thus, to investigate whether replicative stress might contribute for the long-term effects of irradiation on DNA damage and RET/PTC formation, we analyzed the effects of radiation in NTHY-ori3.1 thyroid cell lineage in terms of oxidative and replicative stress and replication dynamics. Our results confirm that irradiation triggers two waves of oxidative stress: first, a strong but transient oxidative burst takes place minutes after irradiation and next, a persistently increased oxidative stress that starts only 2 days after irradiation. These two peaks of oxidative stress lead to two peaks of DNA damage. Irradiation caused little or no effect on proliferation nor on cell cycle progression. However, several protein markers of replicative stress, such as pATR, pATM, pChk1 and pRPA are induced three days after irradiation. Moreover, replication dynamics analysis revealed a diminished replication speed that has been reversed by antioxidants, suggesting that oxidative stress may contribute to replication defects. Finally, using ChIP-qPCR, we observed that the genes involved in RET/PTC1 translocation present more double-stranded breaks than RET/PTC-unrelated genes 3 days after irradiation. Hence, we propose that replicative stress is potentially involved in the etiology of RET/PTC-positive tumors. / HECHT, Fabio. The role of reactive oxygen species in thyroid radio-carcinogenesis. Rio de Janeiro, 2018. Doctoral thesis - Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil and Université Paris-Saclay, Orsay, France, 2018.O câncer papilífero de tireoide é o tumor endócrino mais comum e corresponde a 2-3% de todos os cânceres humanos. As alterações genéticas mais relevantes relacionadas a esse tumor são mutações nos genes BRAF e RAS e translocações do gene RET, um proto-oncogene ativado em 15-20% dos tumores papilíferos. Essas translocações, conhecidas como RET/PTC, resultam da fusão de RET com diversos outros genes. A radiação ionizante é um importante fator de risco para a formação de RET/PTC, no entanto, o mecanismo molecular responsável por essa translocação radioinduzida ainda não foi elucidado. Nos últimos anos, nosso grupo demonstrou um papel crítico exercido pelas espécies reativas de oxigênio na formação de RET/PTC em células tireoidianas in vitro e também mostrou que a irradiação promove um estresse oxidativo persistente causado pelo aumento de expressão da NADPH Oxidase DUOX1, levando à dano ao DNA, mediando assim parte dos efeitos da radiação. No entanto, como o ROS leva à formação de RET/PTC ainda não é compreendido. Crianças possuem um risco significativamente mais alto de desenvolver tumores tireodianos após a irradiação, especialmente RET/PTC positivos, provavelmente em função da intensa proliferação das células tireodianas. Essa associação sugere que a replicação esteja envolvida na formação de RET/PTC. De fato, foi observado que a indução farmacológica de estresse replicativo pode estimular a formação in vitro de RET/PTC em células tireodianas. Portanto, para investigar se o estresse replicativo contribui com os efeitos da irradiação no longo prazo sobre o dano ao DNA e formação de RET/PTC, nós investigamos o papel da radiação sobre o estresse oxidativo e replicativo, além da dinâmica de replicação de linhagem de células tireodianas NTHY-ori 3.1. Nossos resultados confirmam que a irradiação desencadeia duas ondas de estresse oxidativo: primeiramente, um forte, mas transitório pico de espécies reativas de oxigênio é observado minutos após a irradiação, seguido por um novo e persistente pico que só é observado a partir de dois dias após a irradiação. Esses dois picos de estresse oxidativo resultam em dois picos de dano ao DNA. A irradiação causou pouco ou nenhum efeito na proliferação ou na progressão do ciclo celular. No entanto, vários marcadores de estresse replicativo foram observados três dias após a irradiação, como pATR, pATM, pChk1 e pRPA. Além disso, a análise da dinâmica de replicação mostrou uma diminuição na velocidade da replicação que foi revertida por antioxidantes, sugerindo que o estresse oxidativo contribui para distúrbios dos mecanismos replicativos. Por fim, utilizando ChIP-qPCR, nós observamos que os genes envolvidos na translocação RET/PTC possuem mais quebras duplas do que genes endógenos, dias após a irradiação. Portanto, propomos que o estresse replicativo está potencialmente envolvido na etiologia dos tumores RET/PTC positivos.

Abstract : Adverse drug reactions (ADRs) are undesirable effects caused after administration of a single dose or prolonged administration of drug or result from the combination of two or more drugs. Idiosyncratic drug reaction (IDR) is an adverse reaction that does not occur in most patients treated with a drug and does not involve the therapeutic effect of the drug. IDRs are unpredictable and often life-threatening. Idiosyncratic reaction is dependent on drug chemical characteristics or individual immunological response. IDRs are a major problem for drug development because they are usually not detected during clinical trials. In this study we focused on IDRs of Nevirapine (NVP), which is a non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor used for the treatment of Human Immunodeficiency Virus (HIV) infections. The use of NVP is limited by a relatively high incidence of skin rash. NVP also causes a rash in female Brown Norway (BN) rats, which we use as animal model for this study. Our hypothesis is that idiosyncratic skin reactions associated with NVP treatment are due to post-translational modifications of proteins (e.g., glutathionylation) detectable by MS. The main objective of this study was to identify the proteins that are targeted by a reactive metabolite of Nevirapine in the skin. The specific objectives derived from the general objective were as follow: 1) To implement the click chemistry approach to detect proteins modified by a reactive NVP-Alkyne (NVP-ALK) metabolite. The purpose of using NVP-ALK was to couple it with Biotin using cycloaddition Click Chemistry reaction. 2) To detect protein modification using Western blotting and Mass Spectrometry techniques, which is important to understand the mechanism of NVP induced toxicity. 3) To identify the proteins using MASCOT search engine for protein identification, by comparing obtained spectrum from Mass Spectrometry with theoretical spectrum to find a matching peptide sequence. 4) To test if the drug or drug metabolites can cause harmful effects, as the induction of oxidative stress in cells (via protein glutathionylation). Oxidative stress causes cell damage that mediates signals, which likely induces the immune response. The results showed that Nevirapine is metabolized to a reactive metabolite, which causes protein modification. The extracted protein from the treated BN rats matched 10% of keratin, which implies that keratin was the protein targeted by the NVP-ALK. / Résumé : Les effets indésirables (EI) sont les effets indésirables causés après l'administration d'une dose unique ou une administration prolongée du médicament ou le résultat de la combinaison de deux médicaments ou plus. La Réaction idiosyncratique (IDR) est une réaction indésirable qui ne se produit pas dans la plupart des patients traités avec un médicament et qui ne comporte pas l'effet thérapeutique du médicament. IDR sont imprévisibles et peuvent mettre la vie du malade en danger. Cette réaction dépend des caractéristiques chimiques du médicaments et/ou de la réponse immunitaire individuelle du patient. IDR est un problème majeur pour le développement de médicaments car ils ne sont généralement pas détectés au cours des essais cliniques. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur la Réaction idiosyncratique de névirapine (NVP) qui est un inhibiteur de transcriptase inverse non nucléosidique utilisé pour le traitement du virus d'immunodéficience humaine (VIH). L'utilisation de NVP est limitée par une incidence relativement élevée d'éruption cutanée. NVP provoque également une éruption cutanée chez les rats femelles de souche Brown Norway. Notre étude vise à mieux comprendre les IDRs induites par l'administration de NVP chez l'animal. La présente étude vise à vérifier l'hypothèse que les problèmes cutanés associés à la prise de NVP soient attribuables à la modification post-traductionnelle de protéines détactable par spectrométrie de masse. Les principaux objectifs de ce projet étaient : 1) Déterminer si la Nevirapine alcynes (NVP-ALK), un analogue de la NVP peut développer la même éruption cutanée que la NVP. La NVP-ALK a été couplé avec de la biotine en utilisant la réaction chimique (click chemistry). 2) Détecter les modifications post-traductionelles des proteines par Western blot et des techniques de spectrométrie de masse, pour comprendre le mécanisme de la toxicité induite par la NVP. 3) Identifier les protéines modifiées en utilisant le moteur de recherche MASCOT pour l'identification des protéines, en comparant le les spectres de masse obtenus avec les spectres théoriques pour trouver une séquence correspondante de peptide. 4) Tester si la NVP et ses métabolites peuvent provoquer des effets nocifs, comme l'induction d'un stress oxydatif dans les cellules (par la mesure de la glutathionylation des protéines). Les résultats ont montré que la névirapine est métabolisé en métabolite réactif ce qui provoque une modification de la kératine. Ainsi nos résultats suggèrent que la kératine est la cible des métabolites de la NVP-ALK.

La néphropathie diabétique (DN) est l’une des premières causes de maladie rénale en phase terminale (ESKD). L’ESKD est un important facteur de risque d'insuffisance cardiaque et d'accidents vasculaires cérébraux. La dysfonction du système rénine-angiotensine intrarénal (iRAS) est considérée comme étant l'une des principales causes du développement de la DN. Tous les composants du iRAS sont identifiés dans les cellules épithéliales des tubules rénaux proximaux (RPTCs), y compris l'angiotensinogène (Agt), le seul précurseur de toutes les angiotensines. Notre laboratoire a rapporté précédemment que la surexpression spécifique de l’Agt dans les RPTCs provoque l’hypertension, la protéinurie, la fibrose rénale, l’apoptose et des lésions rénales. Nrf2 (Nuclear factor erythroid 2-related factor 2) est un facteur de transcription qui est exprimé de façon abondante dans les RPTCs et a été considéré comme étant un régulateur central de l'équilibre redox dans les réponses cytoprotectrices cellulaires. Le rôle de l’activation du Nrf2 dans la DN, toutefois, est controversé. L’objectif général de cette thèse est de comprendre le rôle physiologique du Nrf2 dans la DN et d’étudier le(s) mécanisme(s) moléculaire(s) de l’action de Nrf2. Premièrement, nous avons démontré que la délétion génétique de Nrf2 ou l’inhibition pharmacologique de Nrf2 avec de la trigonelline chez les souris Akita diabétiques de type 1 régule à la hausse la voie Ace2/MasR et supprime l’expression de Agt/ACE dans les RPTCs, ce qui a pour effet d'atténuer l’hypertension systémique et les lésions rénales. Conformément, dans les cellules immoratalisées de tubule proximal de rat (IRPTC) en culture, la transfection de ARNsi ou le traitement à la trigonelline empêche la régulation positive de Agt/ACE induite par le HG, avec une baisse subséquente de l’expression des gènes Ace2/MasR. Ces données identifient un nouveau mécanisme dans lequel l’activation de Nrf2 stimule l’expression et l’activation des gènes du iRAS, menant au développement de l’hypertension et de la néphropathie dans le diabète. Deuxièmement, nous avons généré des souris Nrf2 transgéniques qui surexprime spécifiquement Nrf2 dans les RPTCs (souris Nrf2RPTC Tg), sous le contôle du promoteur KAP (kidney specific androgen-regulated protein). Nous avons ensuite croisé les souris Nrf2RPTC Tg avec les 6 souris Akita Nrf2-/- pour générer des souris Akita Nrf2-/- /Nrf2RPTC Tg. Nous avons trouvé que la surexpression de Nrf2 dans les RPTCs des souris Akita Nrf2-/- augmentait significativement l’expression du gène SGLT2, entraînant une élévation du glucose sanguin, du taux de filtration glomérulaire, du rapport albumine/créatinine urinaire et de la fibrose tubulo-interstitielle. Dans les cellules tubulaires proximales humaines immortalisées (HK2), le traitement à l’oltipraz ou la transfection de l’ADNc du NRF2 stimule l’expression de l’ARNm du SGLT2 et l’activité de son promoteur. De plus, des tests de retard sur gel et d’immunoprécipitation de chromatine ont montrés que NRF2 se lie au NRF2-RE du promoteur du SGLT2. En outre, une expression plus élevée de NRF2 et SGLT2 est observée dans les RPTCs de reins de patients diabétiques que dans les reins de patients non diabétiques. Ces données ont établi un nouveau mécanisme de la régulation du NRF2 sur l’expression et l’activation du gène SGLT2, menant à une exacerbation du glucose sanguin, de l’hyperfiltration et des lésions rénales dans le diabète. En somme, cette thèse a démontré que le stress oxidatif (hyperglycémie) induisait l’activation du Nrf2 qui stimulait le iRAS et l’expression de SGLT2, contribuant ainsi à la progression de la DN. Ces études suggèrent que le Nrf2 pourrait être une cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la DN et pourront fournir de valabless données pré-cliniques pour les essais cliniques en cours avec le bardoxolone méthyle (un activateur de Nrf2). / Diabetic nephropathy (DN) is one of the leading causes of end-stage kidney disease (ESKD). ESKD is a major risk factor for heart failure and stroke. Dysfunction of intrarenal renin angiotensin system (iRAS) is considered as one of the main reasons that caused the DN. All components of the iRAS are identified in the renal proximal tubule cells (RPTCs), including angiotensinogen (Agt), the sole precursor of all angiotensins. Our lab has previously reported that specific overexpression of Agt in RPTCs induces hypertension, proteinuria, kidney fibrosis, apoptosis and kidney injury. Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) is a transcription factor that abundantly expresses in RPTCs and has been considered as a master regulator of redox balance in cellular cytoprotective responses. The role of Nrf2 activation in DN, however, is not clear. The overall aim of this study is to understand the physiological role of Nrf2 in DN and investigate the molecular mechanism(s) of Nrf2 action. First, we have demonstrated that genetic deletion of Nrf2 or pharmacological blockade of Nrf2 with trigonelline in type 1 diabetic Akita mice effectively upregulates Ace2/MasR and suppresses Agt/ACE expression in isolated RPTCs, resulting in attenuation of systemic hypertension and kidney injury. Consistently, in cultured IRPTCs, Nrf2 siRNA transfection or trigonelline treatment prevents high glucose-induced upregulation of Agt/ACE with downregulation of Ace2/MasR gene expression. These data identified a novel mechanism in which Nrf2 activation stimulates iRAS gene expression and activation, leading to the development of hypertension and nephropathy in diabetes. Second, we have generated Nrf2 transgenic mice under the kidney specific androgen regulated protein (KAP) promoter which specifically overexpress Nrf2 in RPTCs (Nrf2RPTC Tg mice). We further crossbred the Nrf2RPTC Tg mice with Akita Nrf2-/- mice to generate Akita Nrf2-/- /Nrf2RPTC Tg mice. We have found that overexpression of Nrf2 in RPTCs of Akita Nrf2-/- mice significantly unregulated sodium-glucose transporter-2 (SGLT2) expression, resulting in elevation of blood glucose, glomerular filtration rate, albumin-creatinine ratio and tubulointerstitial fibrosis. In 8 immortalized human proximal tubular cells (HK2), oltipraz treatment or NRF2 cDNA transfection stimulated SGLT2 mRNA expression and its promoter activity. Furthermore, NRF2 bound to NRF2- RE of SGLT2 promoter were identified by gel mobility shift assay and chromatin immunoprecipitation assay. Moreover, human diabetic kidneys exhibited higher expression of NRF2 and SGLT2 in RPTCs than non-diabetic kidneys. These data established a novel mechanism of NRF2’s regulation on SGLT2, leading to exacerbation of blood glucose, hyperfiltration and kidney injury in diabetes. In summary, this study documented that activation of Nrf2 in hyperglycemia contributed to the progression of DN via regulation of iRAS and SGLT2, suggesting that Nrf2 might be a potential therapeutic target in the treatment of DN.

Au début des années 2000, il a été montré que le développement des métastases était fortement limité par un phénomène de dormance cellulaire. En effet, après s’être extravasées dans un organe distant, la plupart des cellules tumorales disséminées qui survivent entrent immédiatement dans un état quiescent réversible mais durable sur le long terme, qui est qualifié de dormant. Si le phénomène de dormance permet de limiter le taux de développement de métastases, il est aussi à l’origine de récidives métastasiques tardives, car les cellules dormantes peuvent persister longtemps et sont résistantes à la chimiothérapie. Il est donc important d’analyser les mécanismes moléculaires régulant la dormance des cellules tumorales. Mais cette analyse est difficile à réaliser in vivo du fait de la relative grande rareté des cellules cancéreuses disséminées. Récemment, mon équipe d’accueil a observé que la clonogénicité in vitro des cellules de cancer de la prostate peut être fortement régulée par un phénomène de dormance. Celle-ci est induite lorsque les cellules sont cultivées à la faible densité cellulaire et dans un milieu légèrement hypertonique comme le DMEM. L’objectif de mon travail de thèse était d’analyser les mécanismes moléculaires régulant la dormance des cellules de cancer de la prostate in vitro.Dans un premier temps, nous avons mis en évidence que la dormance nécessite l’activation conjointe de la voie de signalisation BMP/TGF-ß et d’un stress oxydatif. La faible densité cellulaire joue un rôle capital dans l’établissement de la dormance en pré-activant la voie du BMP/TGF-ß et en sensibilisant la cellule au stress oxydatif. L’amplification de ces effets par l’hypertonicité explique l’induction du phénomène de dormance. Nous avons étendu la portée de ces observations en montrant que les androgènes à des concentrations proches des niveaux physiologiques permettent d’induire un phénomène de dormance très similaire, reposant lui-aussi sur l’activation des voies de signalisation du BMP/TGF-ß et du stress oxydatif. De manière intéressante, nous avons confirmé qu’une fois que la dormance est établie, elle se maintient d’une manière autonome. Ainsi, un traitement transitoire par des androgènes s’avère suffisant pour induire la dormance qui se maintient après la remise en culture dans un milieu dépourvu d’androgènes ajoutés. Par ailleurs, nous avons identifié CDKN1A (p21CIP1/WAF1) comme un régulateur de la dormance principalement régulé par le stress oxydatif. Sa surexpression à faible densité cellulaire suffit à induire un phénomène de dormance caractéristique.En conclusion, nous avons montré que la dormance des cellules de cancer de la prostate est régulée par les voies de signalisation du BMP/TGF-ß et du stress oxydatif qui semblent être interconnectées au travers d’une boucle de régulation auto-entretenue. Les androgènes pourraient constituer des inducteurs de dormance efficaces in vivo pour limiter le développement des métastases, ce que nous voudrions tester dans un modèle de dissémination métastasique simplifié chez la souris obtenu par injection intracardiaque de cellules cancéreuses. Par ailleurs, notre modèle prédit que les CTCs (Cellules Tumorales Circulantes dispersées dans la circulation sanguine) pourraient être induites à entrer en dormance avant même de s’extravaser du milieu sanguin du fait des conditions pro-oxydantes régnant dans ce milieu, ce qui pourrait être testé en étudiant si des inhibiteurs du stress oxydatif et/ou des voies du BMP/TGF-ß favorisent la prolifération de CTCs purifiées et mises en cultures. / In the early 2000s, development of metastases was shown to be strongly limited by a phenomenon of cellular dormancy. Indeed, after extravasation in a distant organ, most of the disseminated cancer cells that survive enter into a reversible quiescent that is called dormant state. The phenomenon of dormancy is also the cause of late metastatic recurrences because dormancy confers long-term cellular survival and resistance to chemotherapy. Thus, it is important to analyze the molecular mechanisms regulating cancer cell dormancy. However, in vivo studies are difficult due to the extreme scarcity of disseminated cancer cells. Recently, T. Tchenio et al observed that clonogenicity of prostate cancer cells was strongly regulated by a dormancy phenomenon in vitro. A dormant state was induced when cells are cultured at low density in a slightly hypertonic medium, such as DMEM. The aim of my thesis was to analyze the molecular mechanisms regulating the dormancy of prostate cancer cells in vitro.We first demonstrated that dormancy required a combined activation of both BMP/TGF-ß and oxidative stress signaling pathways. Low cell density plays a key role in dormancy establishment by priming both signaling pathways. Hypertonicity induced dormancy through further amplifying these signaling pathways. We extended the biological relevance of our observation by showing that a closely related phenomenon could be induced by androgens at concentrations close to physiologic levels. Androgen-induced dormancy also relied on activation of the BMP/TGF-ß and oxidative stress signaling pathways. Interestingly, we observed that once dormancy was established, it was maintained autonomously since a transient treatment with androgen was sufficient to induce a dormant state that was self-sustained after withdrawal of exogenous androgens. Besides, CDKN1A (p21 CIP1/WAF1) was identified as a dormancy regulator modulated by oxidative stress. We showed that its transient overexpression at low cell density was sufficient to induce a dormancy phenomenon that mimicked those induced by hypertonicity or androgens.In conclusion, we showed that dormancy of prostate cancer cells was regulated by BMP/TGF-ß and oxidative stress signaling pathways that seemed to be interconnected through a self-sustained regulation loop. Androgen may constitute an effective inducer of dormancy in vivo to limit metastases development. Therefore, we would like to test its effects in vivo in a simplified model of metastatic dissemination in mouse relying on intracardiac injection of cancer cells. Furthermore, our model allowed us to predict that CTCs (Circulating Tumor Cells dispersed in bloodstream) could enter into a dormant state before their extravasation from blood vessels due to the pro-oxidant conditions in this environment. This prediction could be tested by studying whether oxidative stress and BMP/TGF inhibitors could promote proliferation of purified CTCs in vitro.

Les complications vasculaires telles que l’augmentation de la contractilité et la prolifération cellulaire sont les complications les plus communes observées dans le diabète et l’hyperglycémie chronique est un facteur important dans ces processus. La voie de signalisation de Gαq joue un rôle important dans la régulation du tonus vasculaire et l’altération de celle-ci peut contribuer aux complications vasculaires observées dans les cas de diabète et d’hyperglycémie. Il a été observé que les taux et l’activité des protéines kinase C (PKC) et du diacylglycérol (DAG) sont augmentés dans ces conditions. Cependant, aucune étude n’a démontré l’implication de Gαq/11 et des PLCβ, molécules de signalisation en amont de PKC/DAG. Plusieurs études révèlent que l’augmentation des taux et de l’activité des PKC et du DAG induite par l’hyperglycémie dans des cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) est attribuée à l’augmentation du stress oxydatif. De plus, les niveaux de certains peptides vasoactifs, tels que l’angiotensine II et l’endothéline-1, augmentés dans les conditions de diabète/d’hyperglycémie, peuvent contribuer à l’augmentation du stress oxydatif observée. Le travail présenté dans cette thèse avait pour but d’examiner les effets de l’hyperglycémie sur les niveaux d’expression protéique de Gαq/11 et de ses molécules associées, ainsi que d’étudier le mécanisme moléculaire par lequel l’hyperglycémie module la voie de signalisation de Gαq dans les CMLV. Dans la première étude, nous avons examiné si l’hyperglycémie pouvait moduler l’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ1 et PLCβ2. Le prétraitement des CMLV A10 avec 26 mM de glucose durant 72 heures augmente l’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ-1 et PLCβ-2 en comparaison avec les CMLV témoins. Le traitement avec des antagonistes aux récepteurs AT1 de l’Ang II, et ETA/ETB de l’ET-1, atténue la hausse de Gαq, de Gα11, de PLCβ1 et de PLCβ2 induite par l’hyperglycémie. De plus, la formation d’IP3 stimulée par l’ET-1 était plus élevée dans les CMLV exposée à 26 mM de glucose. Le traitement des CMLV A10 avec l’Ang II et l’ET-1 augmente également les niveaux d’expression des protéines Gα q/11 et PLCβ. Cette augmentation de l’expression est restaurée au niveau des CMLV témoins par les antagonistes des récepteurs AT1, ETA et ETB. Ces résultats suggèrent que l’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ dans les CMLV induite par l’hyperglycémie est attribuée à l’activation des récepteurs AT1, ETA et ETB. Dans la seconde étude, nous avons examiné l’implication du stress oxydatif dans l’augmentation des niveaux d’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ et de leur signalisation induite par l’hyperglycémie. Nous avons également déterminé le mécanisme responsable de l’augmentation du stress oxydatif induite par l’hyperglycémie. L’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ des CMLV A10 exposées à 26 mM de glucose est revenue au niveau basal après un traitement avec l’antioxydant diphenyleneiodonium (DPI), et la catalase, un chélateur du peroxyde d’hydrogène, mais pas par le 111Mn-tetralis(benzoic acid porphyrin) (MnTBAP) ni par l’acide urique, des chélateurs du peroxynitrite. De plus, l’augmentation de la formation d’IP3 stimulée par l’ET-1 dans les CMLV exposées à 26 mM de glucose est revenue au niveau basal après un traitement avec le DPI et la catalase. Ces résultats suggèrent que l’augmentation du stress oxydatif induite par l’hyperglycémie contribue à l’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et les molécules associées à la voie de signalisation de Gq. De plus, l’augmentation de la production d’anion superoxyde (O2-), de l’activité de la NADPH oxydase et de l’expression des protéines p22(phox) et p47(phox) induite par l’hyperglycémie est revenue à un niveau basal après un traitement avec les antagonistes des récepteurs AT1, ETA et ETB. Ces résultats suggèrent que l’hyperglycémie augmente les niveaux endogènes de l’Ang II et de l’ET-1, ce qui augmente le stress oxydatif par la formation d’O2- et de H2O2 et peut contribuer à l’augmentation des niveaux de Gq/11α et de leurs molécules de signalisation. Puisqu’il a été observé que l’hyperglycémie transactive les récepteurs aux facteurs de croissance tels que le récepteur au facteur de croissance épidermique (EGF-R) et le récepteur au facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-R), nous avons entrepris d’examiner, dans la troisième étude, l’implication d’EGF-R et de PDGF-R dans l’augmentation des niveaux de Gαq/11, de PLCβ et de leur signalisation induite par l’hyperglycémie. L’augmentation des niveaux d’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ-1 et PLCβ-2 induite par l’hyperglycémie est revenue au niveau basal après un traitement avec les inhibiteurs d’EGF-R (AG1478) et de PDGF-R (AG1295) et par l’inhibiteur de c-Src, PP2. L’augmentation de la phosphorylation d’EGF-R et de PDGF-R induite par l’hyperglycémie a été abolie par AG1478, AG1295 et PP2. De plus, l’augmentation des niveaux de Gαq/11, et de PLCβ induite par l’hyperglycémie est atténuée par l’inhibiteur des MAPK, le PD98059, et par l’inhibiteur d’AKT, le wortmannin. L’augmentation de la phosphorylation d’ERK et d’AKT était également atténuée par AG1478 et AG1295. Ces résultats suggèrent que la transactivation des récepteurs aux facteurs de croissance induite par c-Src peut contribuer à l’augmentation des niveaux de Gα q/11/PLC et de leur signalisation par la voie des MAPK/PI3K. En conclusion, les études présentées dans cette thèse indiquent que l’hyperglycémie augmente les niveaux de Gαq/11 et de PLCβ. Nous avons émis des évidences qui démontrent que l’augmentation endogène de l’Ang II et de l’ET-1 par l’hyperglycémie peut contribuer à l’augmentation de la production d’O2- et de H2O2 résultant ainsi en une augmentation du stress oxydatif qui pourrait être responsable de l’augmentation de Gαq/11/PLC et de leur signalisation dans les conditions d’hyperglycémie. Finalement, nous avons démontré que la transactivation des récepteurs aux facteurs de croissance induite par l’hyperglycémie peut être responsable de l’augmentation de Gαq/11/PLC et les molécules associées à la voie de signalisation de Gq dans les cas de diabète et d’hyperglycémie. / Vascular complications including increased contractility and cell proliferation are most common complications in diabetes, and chronic hyperglycemia seem to be an important contributing factor in this process. Gqα signaling pathway plays an important role in the regulation of vascular tone and aberration of these mechanisms may contribute to vascular complications in hyperglycemia/diabetes. The levels and activity of protein kinase C (PKC) and diacylglycerol (DAG) were shown to be up-regulated in diabeteshyperglycemia. In addition, studies on the expression of upstream signaling molecules of phosphatidyl inositol (PI) turnover were lacking. The enhanced activity/levels of protein PKC and DAG induced by high glucose in VSMC have been shown to be attributed to the increased oxidative stress. Furthermore, the levels of various vasoactive peptides including Ang II and ET-1 which are augmented in diabetes and under hyperglycemic conditions, may also contribute to the enhanced oxidative stress in diabetes/hyperglycemia. The work presented in this thesis was therefore undertaken to examine if hyperglycemia/diabetes could also modulate the expression of Gqα and phospholipase Cb (PLCβ) proteins and associated PI turnover signaling in A10 VSMC exposed to high glucose and to explore the molecular mechanisms by which high glucose modulates Gqα/PLC signaling. The first study was undertaken to investigate if hyperglycemia can modulate the expression of Gqα, G11α, PLCβ-1 and PLCβ-2 and associated signaling. Pre-treatment of A10 VSMC with high glucose (26 mM) for 3 days augmented the levels of Gqα, G11α, PLCβ-1 and β-2 proteins as compared to control cells which were restored to control levels by endothelin-1 (ET-1) ETA and ETB and angiotensin II (Ang II) AT1 receptor antagonists. In addition, ET-1-stimulated IP3 formation was also significantly higher in VSMC exposed to high glucose. Furthermore, treatment of A10 VSMC with Ang II and ET-1 also increased significantly the levels of Gq/11α and PLCβ proteins which were restored towards control levels by ETA/ETB and AT1 receptor antagonists. These results suggest that high glucose augmented the expression of Gq/11α, PLCβ and -mediated signaling in VSMC which may be attributed to activation of AT1, ETA and ETB receptors. The second study was undertaken to investigate the implication of oxidative stress in high glucose-induced enhanced expression of Gq/11α and PLCβ1/2 proteins and associated signaling in A10 VSMC and to explore the mechanism responsible for high glucose induced enhanced oxidative stress. We showed that the increased levels of Gqα, G11α, PLCβ-1 and PLCβ-2 proteins in A10 VSMCs exposed to high glucose were restored to control levels by the antioxidant diphenyleneiodonium (DPI), and catalase, a scavenger of hydrogen peroxide, but not by 111Mn-tetralis(benzoic acid porphyrin) (MnTBAP) and uric acid, scavengers of peroxynitrite. In addition, endothelin-1 (ET-1)-stimulated production of IP3 that was enhanced by high glucose was also restored towards control levels by DPI and catalase. These results suggest that high glucose-induced enhanced oxidative stress that contributes to the enhanced expression of Gq/11α and PLCβ protein and signaling. Furthermore, the enhanced production of superoxide anion (O2-), NADPH oxidase activity and enhanced expression of p22(phox) and p47(phox) proteins induced by high glucose was restored to control levels by losartan, BQ123 and BQ788, the antagonists of angiotensin AT1 and endothelin-1 ETA/ETB receptors respectively. These results suggest that high glucose-induced enhanced levels of endogenous Ang II and ET-1, by increasing oxidative stress may contribute to the increased levels of Gq/11α and-mediated signaling in A10 VSMC. Since high glucose has been shown to increase growth factor receptor activation, we investigated, in the third study, the role of epidermal growth factor receptor (EGF-R) and platelet-derived growth factor receptor (PDGF-R) transactivation in high glucose-induced enhanced expression of Gq/11α and PLCβ. The increased levels of Gqα, G11α, PLCβ-1 and PLCβ-2 proteins induced by high glucose were restored to control levels by AG1478, an inhibitor of EGF-R, and AG1295, an inhibitor of PDGF-R as well as by PP2, an inhibitor of c-Src. High glucose-induced increased phosphorylation of EGF-R and PDGF-R which were abolished by AG1478, AG1295 and PP2. High glucose-induced enhanced levels of Gq, G11α and PLCβ were also attenuated by PD98059, an inhibitor of mitogen-activated protein kinase (MAPK), and wortmannin, an inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K). In addition, high glucose-induced enhanced phosphorylation of ERK1/2 and AKT was also attenuated by AG1478 and AG1295. These results suggest that c-Src-induced transactivation of growth factor receptor contributes to the high glucose-induced enhanced expression of Gq/11α/PLC and-mediated cell signaling through MAPK/PI3K pathway. In conclusion, the studies presented in this thesis indicate that hyperglycemia increased the levels of Gq/11α and PLCβ1/2 proteins and mediated signaling. We provided evidence that high glucose-induced increased levels of Ang II and ET-1 may contribute to the enhanced production of O2- and H2O2 and results in enhanced oxidative stress which may be responsible for the high glucose-induced enhanced expression of Gq/11α and PLCβ. Finally, we demonstrated that high glucose-induced transactivation of growth factor receptors may also be responsible for the high glucose-induced enhanced expression of Gq/11α and PLCβ1/2.