Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Nous avons étudié les propriétés cardioprotectrices de l’hémine, un composé hémique inducteur de l’hème oxygénase-1 (HO-1), dans un modèle, in vivo d’hypertension rénovasculaire « Two- kidney, one clip (2K1C) » chez le rat, et dans un modèle cellulaire de cardiomyocytes de rat stimulés par angiotensine II.L’HO-1 est une enzyme inductible qui dégrade l’hème en monoxyde de carbone, biliverdine/bilirubine, et libérant les ions Fe3+. Ces effets anti-inflammatoires, antioxydants, anti-apoptotiques et anti-prolifératifs sont de plus en plus connus et étudiés. Le stress oxydant jouerait un rôle majeur dans les pathologies de dysfonctionnement endothélial, d’hypertension et pourrait être à l’origine de phénomènes inflammatoires, fibrotiques et apoptotiques. Dans un premier temps nous avons à partir d’un modèle chirurgical d’hypertension rénovasculaire caractérisé les effets de l’hémine sur le développement de la fibrose, le stress oxydatif et l’activation de la NADPH oxydase cardiaque en comparaison à un traitement anti-hypertenseur de référence, le losartan. Dans un second temps, nous avons cherché à caractériser les voies de signalisation intracellulaires impliquées dans cette cardioprotection en utilisant un modèle cellulaire de cardiomyocytes stimulés par angiotensine II. / No summary available

Le cancer colorectal est un cancer majeur en termes de fréquence et de mortalité. Il s’agit de la deuxième cause de décès par cancer, avec 17 500 décès en France en 2011. Le traitement des stades avancés repose sur différentes molécules anti-cancéreuses telles que l’oxaliplatine. Cependant le développement de résistances entraine des échecs thérapeutiques expliquant le faible taux de survie observé. Il est donc crucial d’identifier les mécanismes de résistance et ses acteurs et de découvrir de nouvelles pistes de traitements.Dans un premier temps, nous nous sommes donc intéressés aux rôles joués par les calpaïnes et NOX1 dans le développement de la résistance à l’oxaliplatine en étudiant des cellules tumorales colorectales résistantes à cette drogue. Ce qui nous a permis d'identifier une voie de signalisation impliquée dans la résistance à cette chimiothérapie.Dans un second temps nous nous sommes intéressés à étudier la réversion de cette résistance à l’oxaliplatine. En criblant différentes chimiothérapies ce qui a permis de mettre en évidence une inversion du statut résistant/sensible dans nos cellules sélectionnées.La première partie de nos données met en évidence de nouvelles régulations de Nox1 qui diffèrent en fonction de la sensibilité des cellules à l’oxaliplatine. Nos résultats montrent aussi que p38 MAPK pourrait être une cible thérapeutique de choix. Dans la deuxième partie nous avons identifié un nouveau traitement permettant l'induction de l'apoptose dans nos cellules résistantes. Ainsi la gemcitabine pourrait être une solution pour traiter les patients ne répondant pas ou plus aux protocoles basés sur l’oxaliplatine / Colorectal cancer is a major cancer in terms of frequency and mortality. This is the second leading cause of cancer death, with 17,500 deaths in France in 2011. The treatment of advanced stages is based on different chemotherapeuties including oxaliplatin. However, the development of resistance leads to therapeutic failures explaining the low survival rate. It is therefore crucial to identify the mechanisms of resistance and the actors involved and to discover new therapeutic approaches. We first investigated the role played by calpains and NOX1 in the development of resistance to oxaliplatin, studying oxaliplatin-resistant colorectal tumor cells. This allowed us to identify a signaling pathway involved in resistance to this chemotherapy.Secondly, we have studied the reversion of this resistance to oxaliplatin. A screening of different chemotherapies revealed a reversal of the resistant / sensitive status in our selected cells In the first part, our data highlight novel Nox1 regulations which differ according to the sensitivity of the cells to oxaliplatin. Our results also show that p38 MAPK could be a therapeutic target for treating colorectal cancers resistant to oxaliplatin. In the second part, we have identified a new treatment to induce apoptosis in our resistant cells. Indeed, gemcitabine may be a solution to treat patients who do not respond to oxaliplatin-based protocols.

Les cellules dendritiques jouent un rôle prépondérant dans le développement des réponses immunitaires ; les nombreuses activités fonctionnelles de ces cellules dont leur importante capacité de phagocytose leur confèrent le pouvoir d'activer les différents mécanismes de défense de l'organisme qu'ils fassent parties de l'immunité innée ou adaptative. Or de nombreux travaux ont montré que lors du développement des réponses immunitaires, les mécanismes oxydatifs ont un rôle essentiel et sont donc étroitement contrôlés. Dans le cas des cellules dendritiques, la production de radicaux oxygénés est en très grande partie relié au fonctionnement d'une NADPH Oxydase (NOX2) que notre laboratoire a été le premier à identifier dans ces cellules, il y a quelques années. Ce complexe enzymatique à une position centrale dans la production en premier des radicaux superoxydes puis des différentes formes réactives de l'oxygène (FRO) qui en découlent. Au cours de ma thèse, j'ai tout d'abord mis en place un protocole permettant l'étude de la production des FRO dans les cellules dendritiques. Les différentes méthodes employées m'ont permis de démontrer que d'autres protéines du système oxydant tels NOX1 et SOD3, étaient également produites par les cellules dendritiques. Nos résultats montrent que ces protéines, à l'instar de ce qui avait été montré pour NOX2, jouent un rôle dans la formation et le contrôle des FRO. J'ai également étudié la localisation intracellulaire de ces protéines, ce qui m'a permis de mieux comprendre les rôles respectifs de ces dernières dans le contrôle de la production et de l'activité des FRO dans les cellules dendritiques. Il avait été préalablement montré que la dégradation des pathogènes dans les cellules dendritiques, après qu'ils aient été phagocytés, était en partie liée à l'activité NOX2. Le travail réalisé dans le cadre de cette thèse nous permet d'envisager un impact des FRO résultant de l'activité de NOX1 sur le contrôle de l'apoptose des cellules dendritiques ou sur certaines voies de signalisation au niveau de noyau. De plus, la dismutation du superoxyde en peroxyde (H2O2) pourrait ne pas être une réaction spontanée comme plusieurs auteurs l'ont proposé, mais pourrait être lié à la présence de SOD3 qui interviendrait dans les compartiments d'endocytose. / Dendritic cells play an important role in the development of immune responses; the numerous functional activities of DC, among them their important phagocytic potential, give to these cells the capacity to activate both innate and acquire immune responses. Many authors have shown that during the development of these processes, oxidative mechanisms have a very important role and consequently must be strictly controlled. In dendritic cells, oxygen radicals production is mainly related to an NADPH Oxidase activity (NOX2), that our laboratory was the first to identify in these cells few years ago. This enzymatic complex has an important function in the production of firstly oxygen superoxide radicals and secondly, various reactive oxygen species (ROS) that are produced like hydrogen peroxide. During my PhD, I have developed various protocols, which enabled us to analyse ROS production by dendritic cells. The different results allowed me to demonstrate that other proteins belonging to the family of the Red/Ox controlling elements are produced by dendritic cells: NOX1 and SOD3. My results showed that these proteins play an important role in ROS formation and control, in complement to what was previously demonstrated for NOX2. I have studied also their intracellular localisation, which permitted a better understanding of their respective role in dendritic cells. It was already shown that, after phagocytosis, pathogen degradation in dendritic cells was partially related to NOX2 activity. The work performed in this thesis let us consider a potential impact of NOX1 derived ROS on the control of the apoptosis of dendritic cells or on signalling pathways at nucleus level. Moreover, superoxyde anion dismutation in hydrogen peroxide (H2O2) could be due to the presence of SOD3 that may be found in endocytic compartments rather than the result of spontaneous reactions most often proposed by authors.

Les neutrophiles participent à la défense de l'hôte en phagocytant les agents pathogènes et en les détruisant via notamment la production de formes réactives de l'oxygène (FRO). Les FRO sont produites par un complexe multi- protéique :la NADPH oxydase (NOX2). Celle-ci peut s’assembler à la membrane du phagosome lors de la phagocytose mais aussi à la membrane plasmique lors de la stimulation des neutrophiles par des agents bactériens ou des médiateurs de l’inflammation. La NADPH oxydase est une arme à double tranchant; une activation excessive ou inappropriée de la NADPH oxydase génère un stress oxydant, facteur aggravant des nombreuses pathologies. Cette enzyme doit donc être finement régulée. La NADPH oxydase est activée lorsque les sous-unités cytosoliques de NOX2 (p67phox, p47phox, p40phox) et la petite GTPase Rac s’assemblent avec les sous-unités membranaires (p22phox et gp91phox) à la membrane phagosomale ou plasmique. P67phox régule le flux d'électrons qui transite via gp91phox du NADPH à O2.-. Des travaux récents indiquent que les phospholipides anioniques contribueraient à la régulation de la NADPH oxydase. De plus, Les protéines organisatrices p40phox et p47phox possèdent des domaines de liaison à ces phosphoinositides : p40phox peut se lier au phosphatidylinositol 3-phosphate (PI(3)P) et p47phox au phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate (PI(3,4)P2). Nous avons donc voulu comprendre le rôle des ces phospholipides dans la régulation de la NADPH oxydase. Dans un premier temps nous nous sommes intéressés au rôle du PI(3)P, présent au phagosome après la fermeture de celui-ci, dans l’activation de la NADPH oxydase. Nos données indiquent que p40phox fonctionne comme un adaptateur, PI(3)P dépendant, permettant de maintenir p67phox dans le complexe de la NADPH oxydase. Le PI(3)P agit comme un « timer » pour l'activation de la NADPH oxydase au phagosome. Nous avons ensuite voulu examiner le rôle du PI(3,4)P2 dans la régulation de la NADPH oxydase à la membrane plasmique. Ce lipide est formé à la membrane plasmique par phosphorylation du PI(4)P par la PI3K de classe I lors de l’activation des neutrophiles. Nous avons montré que, l'activité PI3K de classe I est nécessaire pour maintenir l’activation, intégrine-dépendante, de la NADPH oxydase à la membrane plasmique. / The NADPH oxidase of the professional phagocyte is essential for the immune system. The phagocyte NADPH oxidase, NOX2, catalyze the reduction of molecular oxygen to superoxide. Superoxide is transformed rapidly into other reactive oxygen species (ROS) which play a critical role in the killing of pathogens in host defense. Indeed neutrophils, the first cells that arrive at the site of infections, engulf pathogens in a process called phagocytosis. The production of reactive oxygen species is then triggered by the NADPH oxidase in the phagosome. The importance of ROS production is demonstrated by the recurrent bacterial and fungal infections that face patients who lack functional NADPH oxidase as in the rare genetic disorder known as the chronic granulomatous disease (CGD). Upon stimulation by bacterial peptide or in some pathological conditions, NADPH oxidase can also be activated at the phagocyte plasma membrane producing ROS in the extracellular medium. So, an excessive or inappropriate NADPH oxidase activation generates oxidative stress involve in chronic inflammation, cardiovascular disease and neurodegenerative disease. The NADPH oxidase activity should be tightly regulated. The activity of the enzyme is the result of the assembly of cytosolic subunits (p47phox, p67phox, p40phox and Rac2) with membranous subunits (gp91phox and p22phox). P67phox regulates the electron flow through gp91phox from NADPH to oxygen leading to the formation of superoxide. Recent data indicate that the anionic phospholipids are important for the NADPH oxidase regulation. Moreover, p40phox and p47phox bear a PX domain that binds respectively phosphatidylinositol3-phosphate (PI3P) and phosphatidylinositol (3,4)-bisphosphate(PI(3,4)P2). Our objective was to decipher the importance of these phosphoinositides on the NADPH oxidase activity. We first examined the role of PI3P, which is present on the cytosolic leaflet of phagosome after its sealing, in NADPH oxidase activation. Our data indicate that p40phox works as a late adaptor controlled by PI3P to maintain p67phox in the NADPH oxidase complex. Thus, PI3P acts as a timer for NADPH oxidase assembly. We then examined the role of PI(3,4)P2 in the activation of the NADPH oxidase assembled at the plasma membrane. PI(3,4)P2 and PI(3,4,5)P3 are formed at the plasma membrane, upon neutrophil activation, by phosphorylation by Class I PI3K of respectively PI4P and PI(4,5)P2. We found that class I PI3K activity is required to maintain the integrin-dependent activation of NADPH oxidase at the plasma membrane.

Lors d’une infection, les polynucléaires neutrophiles phagocytent l’agent pathogène et le détruisent grâce à la production de formes réactives de l’oxygène (FRO) par la NADPH oxydase. Cette enzyme est constituée de sous-unités membranaires (Nox2, p22phox) et cytosoliques (p67phox, p47phox,p40phox, Rac) qui s’assemblent soit à la membrane plasmique, lors de l’activation des cellules par un stimulus soluble comme le fMLF, soit à la membrane du phagosome, lors de la phagocytose de particules. La régulation de la NADPH oxydase implique divers facteurs comme la signalisation calcique et les lipides, notamment les phospholipides anioniques. En effet, il a été montré que l’activation et la translocation de la petite protéine G Rac peuvent être dépendantes du calcium. D’autre part les sous unités Rac et p47phox peuvent interagir avec les phospholipides anioniques tels que la phosphatidylsérine,grâce à des interactions stéréosélectives et/ou électrostatiques.L’objectif de ce travail est donc d’évaluer le rôle du calcium et de la phosphatidylsérine dans le recrutement de p47phox et/ou Rac lors de l’assemblage de NADPH oxydase. Pour suivre la dynamique des deux protéines, nous avons exprimé ces sous-unités marquées avec des protéines fluorescentes dans des lignées phagocytaires mimant les neutrophiles (HL-60 et PLB-985). Nous avons ainsi pu suivre, par vidéomicroscopie, le déplacement des sous-unités marquées lors d’une stimulation par fMLF ou PMA etdurant la phagocytose de particules opsonisées. Après stimulation par fMLF, Rac1 transloque du cytosol à la membrane plasmique, alors que le mutant constitutivement actif de Rac1 est constamment localisé àla membrane plasmique, indépendamment de la stimulation par fMLF. De plus après stimulation parPMA, le mutant constitutivement actif de Rac2 transloque à la membrane plasmique, suggérant que sa translocation pourrait être possible en absence d’un influx de calcium extracellulaire. Lors de la phagocytose, en masquant la phosphatidylsérine avec le domaine C2 discoïdine de la lactadhérine qui lie spécifiquement ce phospholipide, nous avons pu montrer que la phosphatidylsérine régule la production initiale des FRO en favorisant le recrutement de p47phox et de Rac2 au phagosome. De plus, ces deux sous-unités se détachent du phagosome alors que la production intraphagosomale de FRO continue,suggérant que leur départ n’est pas un signal de terminaison pour l’activité oxydase. Plus précisément,p47phox et Rac2 sont recrutées de manière transitoire, pendant seulement 1 à 3 minutes après la fermeture du phagosome. Ceci est en accord avec le modèle qui propose que p47phox servirait principalement à transporter p67phox au phagosome, et que les deux sous-unités p47phox et Rac2 faciliteraient le positionnement de p67phox dans le complexe membranaire. / During phagocytosis, neutrophils internalize pathogens in a phagosome and kill them through the production of reactive oxygen species (ROS) by the NADPH oxidase enzyme. The cytosolic NADPHoxidase subunits (p67phox p47phox, p40phox, Rac2) and the membranous subunits (Nox2, p22phox) assemble either at the plasma membrane after stimulation with soluble agonist, or at the phagosomal membrane during particle phagocytosis. The regulation of this enzyme involves several actors like calciumsignalling and anionic phospholipids. Actually Rac activation and translocation was found to be calciumdependent and, on the other hand, p47phox and Rac can interact with anionic phospholipids such asphosphatidylserine through stereoselective and/or electrostatic interactions.Therefore we wanted to investigate the role of calcium and phosphatidylserine in p47phox and Rac membrane recruitment. To study this dynamic, we expressed the subunits tagged with a fluorescent protein in neutrophil-like cells (HL-60 and PLB-985), and followed them by videomicroscopy duringfMLF or PMA stimulation or during phagocytosis of opsonised particles. After fMLF stimulation, Rac1translocated from the cytosol to the plasma membrane whereas constitutively active form of Rac1 was permanently located at the plasma membrane, independently of fMLF stimulation. In addition, afterPMA treatment, constitutively active form of Rac2 translocated to the plasma membrane, suggesting that its translocation could occur without extracellular calcium entry. By using the specific phosphatidylserine binding discoïdine C2 domain of lactadherin, we could mask this phospholipid and found that phosphatidylserine is involved in NADPH oxidase activity by participating in the phagosomal recruitment of p47phox and Rac2. In addition we show that these two subunits detached from the phagosome while ROS production continued for a longer period, suggesting that their dissociation from the complex is not a termination signal for oxidase activity. More precisely, p47phox and Rac2 were briefly recruited to the phagosomal membrane, for 1 to 3 minutes after the phagosome closure. These results support the model in which p47phox serves as a carrier for p67phox and both p47phox and Rac2 are adapters that correctly position p67phox in the complex.

Le polynucléaire neutrophile (PN) humain est une cellule phagocytaire qui constitue une des premières barrières de défense de l’organisme contre les agents pathogènes. Sa stimulation par des facteurs chimioattractants, provoque sa migration de la circulation sanguine vers le foyer inflammatoire. Dans le site inflammatoire, les PN reconnaissent l’agent pathogène par l'intermédiaire d'opsonines, des fractions résultant de l'activation du complément et par l’intermédiaire de motifs de reconnaissance conservés au cours de l’évolution des agents pathogènes qui se lient à des récepteurs de la famille Toll (Toll-like receptors ; TLR). Le contact du pathogène avec le PN va provoquer sa phagocytose et sa destruction par la libération de molécules contenues dans les granules du PN et par la production de formes réactives de l’oxygène (FRO) par un complexe enzymatique la NADPH phagocytaire composée au repos de de protéines cytosoliques (p40phox, p47phox, p67phox et Rac 2) et membranaires (gp91phox et p22phox formant le cytochrome b558). Un des événements majeur de l’activation de la NADPH oxydase est la phosphorylation de certains composants cytosoliques comme la p47phox ou la p67phox ce qui conduit à la translocation de ces protéines vers le cytochrome b558 membranaire et permet d’activer l’enzyme pour la production de FRO. L’hyperactivation de cette enzyme ou son « priming » consiste en une pré-activation du PN par des agents dit « primants » tels que des cytokines (TNFα, GM-CSF, IL-1), des chimiokines comme l’IL-8, des molécules lipidiques (PAF et LTB4), ou encore des endotoxines bactériennes LPS, agoniste de TLR4. Les TLR sont des récepteurs exprimés à la surface de nombreuses cellules dont les cellules immunitaires ; ils détectent des motifs conservés au cours de l’évolution des agents pathogènes appelés PAMPs pour "pathogen-associated molecular patterns", des protéines modifiées reconnues comme étrangères, des lipides oxydés, des ligands endogènes. Quelques agonistes des TLR comme le LPS ont été décrits pour induire un priming de la production des FRO par les PN. D’autres ont été connus par leur pouvoir activateur de la NADPH oxydase des PN. Le CL097 (Imidazoquinoline : agoniste des TLR7/8) était l’agoniste des TLR induisant le plus fort effet de « priming » par les PN stimulés par le fMLP. Le CL097 induit la phosphorylation de la p47phox sur la sérine 345. Cette phosphorylation implique des MAPKinases ERK1/2 et de la p38MAPK. La phosphorylation de ce site induit le changement de conformation de la p47phox sous l’action d’une proline isomérase Pin1. Ce changement de conformation favorise la phosphorylation des autres sites (Ser-315, Ser-328) et par conséquent l’activation de la NADPH oxydase. La comparaison de l’effet du CL097 à deux agonistes reconnaissant l’un le TLR7, l’autre le TLR 8 a montré que l’action du CL097 dépendait du TLR8. Le zymosan non opsonisé (agoniste de TLR2) stimule l’activation de la NADPH oxydase des neutrophiles. IL induit la phosphorylation de la p47phox au niveau des Ser-345, -315 et -328. Ces phosphorylations font intervenir respectivement les MAPK ERK1/2 et p38, une protéine tyrosine kinase et les PKC. En plus cet agoniste active la petite protéine cytosolique Rac2, nécessaire à l’activation de la NADPH oxydase des PN. Ces données permettraient d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques de première importance afin de moduler les réponses inflammatoires pathologiques. / Superoxide anion production by the neutrophil NADPH oxidase plays a key role in host defense; however, excessive superoxide production is believed to participate to inflammatory reactions. Neutrophils express several TLR that recognize a variety of microbial motifs or agonists. The interaction between TLR and their agonists is believed to help neutrophils to recognize and to eliminate the pathogen. However, the effects of some TLR agonists on the NADPH oxidase activation and the mechanisms controlling these effects have not been elucidated. In this study, we show that the TLR7/8 agonist CL097 by itself did not induce NADPH oxidase activation in human neutrophils, but induced a dramatic increase of fMLF-stimulated activation. Interestingly, CL097 induced cytochrome b558 translocation to the plasma membrane and the phosphorylation of the NADPH oxidase cytosolic component p47phox on Ser345, Ser328 and Ser315. Phosphorylations of Ser328 and Ser315 were significantly increased in CL097-primed and fMLF-stimulated neutrophils. Phosphorylation of Ser345, Ser328 and Ser315 was decreased by inhibitors of p38MAPK and the ERK1/2-pathway. Phosphorylation of Ser328 was decreased by a PKC inhibitor. Genistein, a braod range protein tyrosine kinase inhibitor, inhibited the phosphorylation of these serines. Our results also show that CL097 induced proline isomerase (Pin1) activation and that juglone, a Pin1 inhibitor, inhibited CL097-mediated priming of fMLF-induced p47phox phosphorylation and superoxide production. These results show that activation of TLR7/8 in human neutrophils induces hyper-activation of the NADPH oxidase by stimulating the phosphorylation of p47phox on selective sites, and suggest that p38MAPK, ERK1/2, PKC and Pin1 control this process.Zymosan a cell-wall preparation from saccharomyces cerevisiae is largely used to activate neutrophils in its opsonized form. In this study, we show that non-opsonized zymosan induced ROS production by human neutrophils. Interestingly, zymosan induced the phosphorylation of the NADPH oxidase cytosolic component p47phox on Ser345, Ser328 and Ser315; and activation of the GTPase Rac2. Phosphorylation of p47phox as well as Rac2 activation were inhibited by genistein a broad range protein tyrosine kinase inhibitor. Wortmannin a PI3Kinase inhibitor, inhibited phosphorylation of p47phox on Ser328 and Ser315 and Rac2 activation. SB203580 and UO126, inhibitors of p38MAPK and ERK1/2-pathway respectively, inhibited phosphorylation of p47phox on Ser345. GF109203X a PKC inhibitor inhibited phosphorylation on Ser328 and Ser315. Zymosan-induced ROS production was inhibited by genistein, wortmannin, SB203580, UO126 and GF109203X. These results show that zymosan induced ROS production by NADPH oxidase in human neutrophils via the phosphorylation of p47phox and Rac2 activation. Our results also suggest that a protein tyrosine kinase and PI3Kinase control p47phox phosphorylation and Rac2 activation while p38MAPK, ERK1/2 and PKC are involved in zymosan-induced p47phox phosphorylation.

La production d’anion superoxyde (O2-) par le complexe NADPH oxydase 2 (NOX2) du polynucléaire neutrophile (explosion oxydative, EO) contribue à l’élimination d’agents pathogènes. Cette fonction de défense est stimulée par divers agents pro-inflammatoires, notamment par des peptides bactériens (fMLP), qui déclenchent une cascade de signalisation impliquant différentes protéines kinases (PKC, AKT, MAP-Kinases) et aboutissant à l’activation de la NOX2 (également nommée gp91phox), le coeur catalytique du complexe. Dans cette thèse, j’ai identifié la protéine kinase mTOR comme un nouvel effecteur majeur de l’EO dans les neutrophiles sains et j’ai comparé son mode d’action transductionnel dans les neutrophiles de patients ayant une cirrhose alcoolique décompensée en vue de comprendre leur grande susceptibilité aux infections bactériennes.Une contribution majeure de mTOR dans la production d’O2- induite par le fMLP a pu être démontrée à l’aide de son antagoniste spécifique, le médicament Rapamycine et par une approche antisense. mTOR agit en amont de la p38-MAPK qui phosphoryle la p47phox, un composant majeur du complexe NADPH oxydase. Dans les neutrophiles de patients cirrhotiques, l’EO est fortement défaillante, associée à un défaut d’activation de la voie p38-MAPK/p47phox(S345). Ce déficit d’EO est aggravé par la Rapamycine. Les neutrophiles de patients cirrhotiques présentent également un déficit d’expression de la gp91phox (NOX2), p22phox, p47phox et mTOR. Un déficit d’expression de la NOX2 a pu être reproduit en traitant les neutrophiles sains par le fMLP ou du plasma des patients. De plus, ce phénomène met en jeu une dégradation protéolytique insoupçonnée de la gp91phox impliquant l’élastase. Enfin, la déficience fonctionnelle des neutrophiles de patients a pu être corrigée dans des neutrophiles isolés et dans du sang total des patients cirrhotiques à l’aide d’un agoniste de récepteurs « Toll-like receptor (TLR) » qui agit en favorisant la transcription du gène de la gp91phox et sa synthèse protéique.En conclusion, mTOR émerge comme un nouvel effecteur transductionnel majeur de l’EO des neutrophiles, favorisant l’activation de la voie p47phox/gp91phox via les MAPK. Cette nouvelle voie de signalisation est fortement impactée au cours de la cirrhose alcoolique, ce qui favorise la susceptibilité des patients aux infections bactériennes. Bien que notre étude soulève ainsi des inquiétudes quant à l’utilisation d’inhibiteurs de mTOR chez les patients immunodéprimés, elle suscite par ailleurs la perspective de pouvoir corriger les déficits fonctionnels des neutrophiles à l’aide d’agents capables de stimuler des TLR intracellulaires. / Superoxide anion (O2-) production by NADPH oxidase 2 (NOX2) complex of polymorphonuclear neutrophil (i.e respiratory burst, RB) contributes to efficient elimination of pathogens. This defense function is stimulated by various pro-inflammatory agents, especially by bacterial peptides (fMLP) which trigger a signaling cascade involving many protein kinases (PKC, AKT, MAP-Kinases) resulting in activation of NOX2, also called gp91phox, the catalytic core of the complex. In this thesis, I identified the protein kinase mTOR as a novel major RB effector of healthy neutrophils and I compared its transductional activity in neutrophils from patients suffering from alcoholic decompensated liver cirrhosis, aiming at understanding their high susceptibility to bacterial infections.A major contribution of mTOR to fMLP-induced neutrophil superoxide production was demonstrated using its specific drug antagonist Rapamycin, and by an antisens strategy. mTOR is activated upstream of p38-MAPK which phosphorylates p47phox, a major component of the NADPH oxidase complex. In neutrophils from cirrhotic patients, the RB is dramatically impaired and this was associated with a deficient activation of the p38-MAPK/p47phox(S345) signaling pathway. This RB deficiency was aggravated by Rapamycin. Neutrophils from cirrhotic patients also exhibited a deficient expression of gp91phox (NOX2), p22phox, p47phox and mTOR. A deficient NOX2 expression can be reproduced by treating healthy neutrophils with fMLP or plasma from cirrhotic patients. Furthermore, this phenomenon involved an unexpected proteolytic degradation of gp91phox mediated by elastase. Finally, this deficient superoxide production by neutrophil from cirrhotic patients can be corrected ex vivo in isolated neutrophils and in patients’ whole blood, using a Toll-like receptor agonist that acts by promoting the transcription and traduction of gp91phox .In conclusion, mTOR emerges as a novel and major signaling effector of neutrophil RB, promoting the activation of p47phox/gp91phox through MAPKs. This novel signaling pathway is strongly impaired during alcoholic liver cirrhosis, which increases patients’ susceptibility to bacterial infections. Although our study raises concerns about the use of mTOR inhibitors in immunocompromised patients, it also provides therapeutic propects for correcting neutrophil functional deficiencies using agents capable of stimulating intracellular TLR .

La prévalence de l'obésité est en constante augmentation dans les pays occidentaux, en raison d'une sédentarisation accompagnée d'une alimentation malsaine. L'obésité est souvent associée à une dysfonction endothéliale et à un risque athérogène élevé. Plusieurs observations cliniques ont montré que la modification du mode de vie, incluant la pratique régulière d'une activité physique et l'adoption d'un mode alimentaire sain, représente une stratégie efficace pour combattre l'obésité et ses complications cardiovasculaires. Cependant, de nombreux mécanismes précisant les effets thérapeutiques directs de l'exercice physique sur le risque athérogène lié à l'obésité sont encore largement inconnus. Le but principal de ce travail a donc été d'identifier, en utilisant un modèle de rat rendu obèse par un régime enrichi en graisse, les mécanismes athéro-protecteurs de l'exercice physique seul et/ou associé à une modification du régime alimentaire (du régime riche en graisse au régime standard). Nos résultats montrent que l'exercice physique, indépendamment de la diète utilisée, corrige la dysfonction endothéliale installée au cours de l'obésité. Cet effet bénéfique a été associé à une diminution du stress oxydatif au niveau vasculaire. En effet, nos résultats indiquent que l'exercice diminue l'activité de la NADPH oxydase au niveau aortique. De plus, nous montrons pour la première fois que l'exercice physique seul, indépendamment de la diète utilisée, est capable de moduler la translocation de la sous-unité de la NADPH oxydase p47phox (principal acteur dans l'activation de ce complexe enzymatique) vers la membrane. Nos résultats indiquent également que l'exercice physique, avec ou sans modification du régime, améliore la voie Akt/eNOS phosphorylée, suggérant une augmentation de la production du NO. Ainsi, l'exercice physique, même sans l'associer à un changement du mode alimentaire, peut être considéré comme une stratégie non-pharmacologique efficace pour le traitement du risque athérogène généré par l'obésité

La prévalence de l’obésité est en constante augmentation dans les pays occidentaux, en raison d’une sédentarisation accompagnée d’une alimentation malsaine. L’obésité est souvent associée à une dysfonction endothéliale et à un risque athérogène élevé. Plusieurs observations cliniques ont montré que la modification du mode de vie, incluant la pratique régulière d’une activité physique et l’adoption d’un mode alimentaire sain, représente une stratégie efficace pour combattre l’obésité et ses complications cardiovasculaires. Cependant, de nombreux mécanismes précisant les effets thérapeutiques directs de l’exercice physique sur le risque athérogène lié à l’obésité sont encore largement inconnus. Le but principal de ce travail a donc été d’identifier, en utilisant un modèle de rat rendu obèse par un régime enrichi en graisse, les mécanismes athéro-protecteurs de l’exercice physique seul et/ou associé à une modification du régime alimentaire (du régime riche en graisse au régime standard). Nos résultats montrent que l’exercice physique, indépendamment de la diète utilisée, corrige la dysfonction endothéliale installée au cours de l’obésité. Cet effet bénéfique a été associé à une diminution du stress oxydatif au niveau vasculaire. En effet, nos résultats indiquent que l’exercice diminue l’activité de la NADPH oxydase au niveau aortique. De plus, nous montrons pour la première fois que l’exercice physique seul, indépendamment de la diète utilisée, est capable de moduler la translocation de la sous-unité de la NADPH oxydase p47phox (principal acteur dans l’activation de ce complexe enzymatique) vers la membrane. Nos résultats indiquent également que l’exercice physique, avec ou sans modification du régime, améliore la voie Akt/eNOS phosphorylée, suggérant une augmentation de la production du NO. Ainsi, l’exercice physique, même sans l’associer à un changement du mode alimentaire, peut être considéré comme une stratégie non-pharmacologique efficace pour le traitement du risque athérogène généré par l’obésité / The prevalence of obesity is increasing at an alarming rate in the western countries. It has been attributed to sedentariness and abundance of unhealthy food. Obesity is often associated with endothelial dysfunction and a high atherogenic risk. Several clinical investigations have reported that life style modification included physical exercise and the adoption of healthydiet was an efficient strategy to combat cardiovascular complications linked to obesity. However, numerous mechanisms by which exercise exerts the direct therapeutic effect on atherogenic risk linked to obesity are still unknown. Using the experimental model of high fat diet-induced obesity rat, the general aim of this study, was to identify the possible molecularmechanisms through which exercise with or without diet modification (high fat to standard diet) exerts an antiatherogenic action. Our results show that exercise independently of diet used, corrected the endothelial dysfunction induced by obesity. This benefit effect was associated with the decreased vascular oxidative stress. In effect, our results show that exercise alone was able to decrease NADPH oxidase activity in aortic tissue. Furthermore, we show for the first time that exercise, independently diet used, was able to modulate the translocation of p47phox subunit to membrane (which plays a pivotal role in NADPH oxidase activation). Ours results show also, that exercise with or without diet modification improves the Akt/eNOS phosphorylation pathway, suggesting that exercise increases NO production. In summary, exercise training even without diet modification, may be a non-pharmacological strategy treatment for atherogenic risk linked to obesity