L’amyotrophie spinale (SMA) est causée par une réduction du taux de la protéine de Survie des MotoNeurones (SMN). Cette protéine est associée aux protéines Gemin 2 à Gemin 8 et unrip pour former le complexe SMN. Bien que la protéine SMN soit présente dans tous les types cellulaires, la pathologie SMA est exclusivement liée à un défaut des motoneurones. Récemment, il a été proposé que SMN puisse avoir des fonctions spécifiques dans le transport des ARNm et dans la régulation de la traduction dans les neurones. La protéine FMRP, défective dans le syndrome de l’X fragile, joue également un rôle dans le transport de particules messagères (mRNP) et dans leur traduction. Dans cette étude, nous avons mis en évidence un lien entre le complexe SMN et la protéine FMRP dans les cellules neuronales suggérant un rôle du complexe SMN dans ces mécanismes. Les connaissances sur la composition, les interactions et les fonctions du complexe SMN ont bien avancées ces dernières années. L’idée actuelle est que le complexe SMN agirait comme un chaperon macromoléculaire des RNP en augmentant l'efficacité et la fidélité des interactions ARN-protéines et en fournissant l’opportunité à ces interactions d’être régulées. Le deuxième volet de cette étude a été d’analyser l’implication du complexe SMN dans l’assemblage de RNP différentes des UsnRNP. Le défaut spécifique des motoneurones nous a conduit à considérer le rôle du complexe SMN dans l’assemblage de RNP spécifiques à ce type cellulaire et notamment la RNP BC200. Finalement, nous nous sommes également intéressé à l’implication du complexe SMN dans l’assemblage et/ou la fonction de la particule SRP, une particule ubiquitaire. / Spinal muscular atrophy (SMA) is caused by reduced levels of the survival of motor neuron (SMN) protein. SMN protein is associated with the proteins Gemin 2 to 8 and unrip to form the SMN complex. Although the SMN protein is present in all cell types, SMA is restricted to a defect in motor neuron. SMN was recently proposed to have specific functions in mRNA transport and translation regulation in neuronal processes. The defective protein in Fragile X mental retardation syndrome (FMRP) also plays a role in transport of mRNPs and in their translation. In this study, we showed a link between the SMN complex and FMRP in neuronal cells suggesting a role for the SMN complex in these processes. Knowledges of the composition, interactions and functions of the SMN complex have advanced greatly in recent years. The emerging picture is that the SMN complex acts as a macromolecular chaperone of RNPs to increase the efficiency and fidelity of RNA–protein interactions, and to provide an opportunity for these interactions to be regulated. The second part of this study was to analyse the involvement of the SMN complex in the biogenesis of RNP different of UsnRNP. The specific defect of motor neuron led us to analyse the role of the SMN complex in the biogenesis of specific RNP to this cell types in particular the RNP BC200. Finally, we are also interested to the SMN complex involvement in the assembly and/or the function of the SRP particle, an ubiquitous particle.

Le Syndrome de l'X fragile (FXS) est la forme la plus fréquente de retard mental héréditaire. Il est causé par l’inactivation du gène FMR1 codant une RNA Binding Protein (FMRP) impliquée dans le contrôle de la traduction. Afin de mieux comprendre la fonction de FMRP, nous nous somme intéressé à ses interacteurs et mon travail s’est organisé en deux parties: la caractérisation de l'interaction FMRP/ARNm GRK4 et la caractérisation de la fonction neuronale de CYFIP1/2, deux protéines interacteurs de FMRP. Nous avons confirmé l'interaction FMRP/ARNm GRK4 et identifié une portion contenant deux motifs ACUK / WGGA, connu pour être de nouvelles cibles pour FMRP. FMRP se lie à GRK4 via son domaine RGG-box et régule négativement sa traduction. Dans les cellules granulaires du cervelet, GRK4 se lie au récepteur GABABR(GBR), induisant sa désensibilisation. Sachant l’importance de la signalisation GBR du cervelet dans la coordination motrice, un niveau élevé de GRK4 peut contribuer au déficit de l'apprentissage moteur et la coordination des mouvements dans FXS. Nous avons également caractérisé la fonction neuronale de CYFIP1/2 en induisant leur knockdown (KD). Ces protéines appartiennent au complexe WAVE (WRC) qui est impliqué dans la régulation de l’établissement de la polarité axonale et dendritique. Nous avons identifié un mécanisme de co-régulation de la transcription des ARNm codant les membres du WRC lors de l’altération de l'expression de CYFIP1/2. Le KD CYFIP1/2 modifie également neuronale ramification et connectivités. L'interaction de FMRP/CYFIP1/2 permettrait de comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des anomalies des épines dendritiques dans FXS. / Fragile X syndrome (FXS) is the most common form of inherited mental retardation. It is caused by the silencing of the FMR1 gene, which encodes for an RNA-binding protein (FMRP) involved in translational control. To better understand the function of FMRP, we are interested in its interactors and so my work was organized into two main parts: the characterization of the interaction between FMRP and GRK4 mRNA and the characterization of the neuronal function of CYFIP1/2, two FMRP interacting proteins. We confirmed in vivo and in vitro the FMRP/ GRK4 mRNA interaction and identified a portion containing two ACUK/WGGA motifs, known to be a novel targets for FMRP. FMRP binds this target via its RGG box domain and negatively modulates the expression of GRK4 at the translational level only in cerebellum. In cerebellar granule cells, GRK4 interacts directly with the GABAB receptor (GBR), promoting its desensitization. Since in cerebellum GBR signaling has a relevant role in motor coordination, an elevated level of GRK4 can contribute to deficits of motor learning and movement coordination in FXS. Next, we characterized the function of CYFIP1/2 in neurons by inducing their knockdown (KD). CYFIP1/2 are components of the canonical WAVE regulatory complex (WRC), important in the spatiotemporal regulation of actin dynamics to get correct axonal and dendrites polarity and branching. We identified a co-regulation of transcription of mRNA coding the WRC members when the expression of CYFIP1/2 is disturbed. KD CYFIP1/2 also alters neuronal branching. The FMRP/CYFIP1/2 interaction would allow us to understand the mechanisms involved in the development of dendritic spines abnormalities in FXS.

Le syndrome de l’X-fragile est la forme la plus fréquente de déficience intellectuelle héréditaire liée au chromosome X. Cette maladie résulte de la mutation du gène FMR1 localisé sur le chromosome X. La protéine correspondante, FMRP, est absente chez les patients atteints de la maladie. Il faut noter ici qu’il existe un modèle murin mimant la pathologie humaine. Ainsi dans ces animaux qui n’expriment pas la protéine FMRP, les neurones présentent des anomalies architecturales de la synapse entraînant d’importants dysfonctionnements dans la transmission et la plasticité synaptique qui sont à l’origine des déficits intellectuels observés chez les patients atteints du syndrome de l’X-fragile. FMRP joue donc un rôle majeur dans la genèse et la maturation des épines dendritiques. Une des fonctions de FMRP est de lier de nombreux ARNm, de les transporter et d’inhiber leur traduction jusqu’à la synapse. Pour accomplir ses fonctions, FMRP interagit avec de nombreux partenaires cellulaires et ses interactions sont finement régulées par différentes modifications post-traductionnelles. Nous avons montré in vivo que la protéine FMRP est un substrat d’une nouvelle modification, la sumoylation. Nous avons également montré que la sumoylation de FMRP est impliquée dans le maintien de l’architecture synaptique et participe à la régulation de la transmission synaptique. Et enfin, nous avons montré que la sumoylation de FMRP permet sa dissociation avec ses partenaires protéiques au sein des complexes ribonucléoprotéiques se trouvant à la base des épines dendritiques. Les ARNm réprimés par FMRP au sein de ces complexes sont ainsi libérés puis traduits. / Fragile X Syndrome is the most frequent inherited cause of intellectual disability in children and is caused by the lack of the mRNA-binding Fragile-X Mental Retardation Protein (FMRP) expression. FMRP plays a role in the activity-dependent targeting and translation of specific mRNAs in dendrites. The absence of FMRP expression in neurons leads to an abnormal neuronal morphology with increased spine length and density. FMRP is therefore playing key roles both in neuronal development and synaptic plasticity. However, the molecular mechanisms underlying the functional regulation of FMRP-mediated mRNA trafficking, translation and subsequent protein synthesis are still largely unknown. My host laboratory has recently discovered that FMRP is sumoylated in vivo. Sumoylation is a post-translational modification that consists in the covalent conjugation of the protein SUMO to specific lysine residues of target proteins. To start unraveling the functional consequences of FMRP sumoylation, I studied first the spine morphology of the WT and FMRP Knock Out mice that recapitulated the human disease. Morphological analysis of fmr1-KO neurons transfected with the WT form of FMRP restores the correct mature spine morphology whereas the non-sumoylatable protein failed to do so. Moreover the non-sumoylatable form of FMRP acts as a dominant negative on WT neurons so confirming the important role of FMRP sumoylation in its function. We report here that FMRP sumoylation is required for the control of spine morphology.

Despite our understanding of the role of the survival motor neuron protein (SMN) in cytoplasmic small ribonucleoproteins (snRNP) assembly, it is unclear how loss of this protein causes motor neuron degeneration in Spinal Muscular Atrophy (SMA). It could be explained by defects in functions that are specific to tissues most affected in SMA. In neurons, SMN localizes to neuronal RNA granules, RNA-containing foci in axons. They regulate many aspects of mRNA fate which include transport along neurites, mRNA stability, and mRNA translation. Most recently, our work provided evidence for SMN’s role in mRNA translation. Specifically, we demonstrated that SMN associates with polyribosomes and may repress translation of specific mRNA targets. Our group demonstrated that SMA-causing mutations within the Tudor domain of SMN completely abolished this activity. This indicates the potential significance of this novel SMN function in the SMA pathology. To further investigate SMN’s function in regulating translation, our group performed a proteomic screen on polysome-containing sucrose gradient fractions. We identified and validated novel interacting partners for SMN that may act as co-factors to regulate translation. DDX5 (an RNA helicase) is an unexpected novel interacting partner as it is known for its role in micro-RNA processing. Moreover, we observe that FMRP, a recognized protein in translational complexes, is required for the presence of SMN and DDX5 in polysomal fractions. With these latest findings, we updated our model of the molecular mechanism by which SMN regulates translation. This work provides more insights on how SMN regulates translation, a newly uncovered role for SMN in motor neurons. Identification of the molecular targets that are misregulated due to loss of this function may reveal new information on the pathogenesis of SMA.

FMRP est une protéine cytoplasmique possédant des domaines consensus de liaison à l'ARN. Dans tous les tissus ou types cellulaires étudiés jusqu'à présent, elle est majoritairement retrouvée associée aux polysomes en se liant à l'ARN messager. FMRP jouerait donc un rôle dans le métabolisme de l'ARN. Toutefois, sa fonction précise reste encore inconnue. Notre hypothèse est que l'étude des plaquettes sanguines, où la synthèse protéique est très faible, pourrait permettre de découvrir une nouvelle fonction pour FMRP qui est habituellement camouflée par son importante association avec les polyribosomes dans les autres types cellulaires. Mon objectif de recherche est d'étudier la localisation subcellulaire de FMRP dans les plaquettes quiescentes et activées afin de mieux comprendre sa fonction. Différentes approches biochimiques et biophysiques ont été utilisées afin d'étudier la distribution subcellulaire de FMRP dans les plaquettes sanguines. Nous avons confirmé par des immunobuvardages faits sur des extraits totaux de plaquettes que la protéine détectée se présente sous forme d'isoformes comparables aux autres cellules. La technique de bombe à l'azote montre une localisation cytoplasmique de FMRP. Alors qu'en immunofluorescence, nous observons une colocalisation de FMRP avec des protéines impliquées dans le métabolisme de l'ARN. Toutefois, les résultats de centrifugations différentielles de plaquettes quiescentes suggèrent que FMRP possède une distribution subcellulaire différente de celle observée dans les autres types cellulaires. Elle a un coefficient de sédimentation entre 6-10S alors que celui observé dans les autres types cellulaires varient entre 150-500S. Bien que FMRP soit retrouvée dans la fraction soluble dans les plaquettes quiescentes, ce type cellulaire est néanmoins métaboliquement peu actif. L'activation des plaquettes par des agonistes enclenche une myriade de mécanismes. Suivant l'activation, FMRP est redistribuée dans la fraction du cytosquelette. La concentration ionique affecte cette distribution, suggérant une association protéine-protéine et/ou protéine-ARN.En conclusion, le profil d'expression de FMRP semble distinct dans les plaquettes et leur activation modifierait dynamiquement cette distribution. FMRP semble donc avoir une fonction dans les plaquettes puisqu'elle est affectée par le processus d'activation. L'étude de l'association au cytosquelette pourrait s'avérer une voie intéressante dans la détermination de la fonction de FMRP dans les plaquettes.

Fragile X syndrome (FXS), the most common cause of inherited mental impairment, is caused by the loss of expression of the fragile X mental retardation protein (FMRP). As an RNA binding protein, FMRP has been proposed to regulate the transport and translation of specific message RNA (mRNA). It has been reported that FMRP uses its RGG box domain to bind mRNA targets that form a G-quadruplex structure, structure believed to be important for FMRP recognition of at least a subclass of its mRNA targets. We have hypothesized that the interaction of FMRP with selected relevant mRNA targets occurs in a G-quadruplex dependent manner. By analyzing the structure of two FMRP in vivo mRNA targets, Shank1 mRNA and BASP1 mRNA, and their interactions with FMRP, we showed a high-affinity interaction between Shank1 RNA G-quadruplex and FMRP. The other G-quadruplex forming mRNA BASP1, however, interacts with FMRP using other structural elements. / Mylan School of Pharmacy and the Graduate School of Pharmaceutical Sciences; / Pharmaceutics / MS; / Thesis;

La Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP) est une protéine régulant la traduction locale de nombreux ARNm dans le cerveau. Elle est absente dans le Syndrome de l'X Fragile (SXF), première cause de retard mental héréditaire. J'ai étudié le rôle de FMRP dans la plasticité structurelle des cellules granulaires (CG) produites à l'âge adulte dans le bulbe olfactif (BO) en réponse à un apprentissage chez la souris. L'apprentissage perceptif (AP) induit de profonds changements structurels des nouveaux neurones du BO adulte. En absence de FMRP dans les CG nouvellement générées, l'apprentissage et la plasticité induite par cet apprentissage sont abolis. αCamKII est une cible traductionnelle connue de FMRP impliquée dans la plasticité synaptique et structurelle. En absence de l'ARNm de αCamKII dans les neurites, l'AP et la plasticité structurelle associée ne sont pas permis. De plus, l'AP augmente la traduction locale de αCamKII de façon dépendante de FMRP. De manière inattendue, αCamKII est présente dans 50% des CG. La plasticité structurelle des CG induite par l'apprentissage ne se produit que dans les CG qui expriment αCamKII (αCamKII+). De manière intéressante, l'AP active les deux populations de manière similaire. Ces résultats révèlent un rôle nouveau de la traduction locale dans la plasticité structurelle induite par l'apprentissage. De plus, l'AP produit des effets différents sur les deux populations que nous avons identifiées, qui pourtant participent probablement toutes deux à l'AP. / The Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP) is a major regulator of local translation in neurons. It is absent in the Fragile X Syndrom (FXS), which is the main cause of inherited intellectual deficiency. I studied the role of FMRP in structural plasticity of adult-born granule cells (abGC) of the mouse olfactory bulb (OB) in response to learning. Perceptual learning (PL) induces profound structural changes in abGC. In absence of FMRP in adult-born neurons, learning and associated structural plasticity are prevented. αCamKII is a well known translational target of FMRP, which is involved in synaptic and structural plasticity. In absence of αCamKII mRNA in neurites, PL and associated structural plasticity are abolished. Besides, PL increases the dendritic local translation of αCamKII in an FMRP-dependent manner. Unexpectedly, αCamKII is present in 50% of the total GC population of the OB. Learning-associated structural plasticity occurs only in αCamKII expressing GC. Interestingly, PL activates similarly both populations. These results reveal a new role for local translation in learning-induced structural plasticity. Moreover, PL induces different effects in the two subpopulations we identified, which probably both participate to PL.

Le syndrome du X fragile est la première cause monogénique de déficience intellectuelle héréditaire affectant un garçon sur 5161 et une fille sur 6000. La maladie résulte de mutations dynamiques dans le gène FMR1 (expansion de trinucléotides CGG et méthylation du gène) conduisant à l'absence ou à la diminution importante d'expression de la protéine FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein).Le syndrome du X fragile est difficile à identifier étant donné la grande variabilité des manifestations cliniques entre les individus. La déficience intellectuelle est variable et elle est moins profonde chez les femmes et les individus mosaïques.Le phénotype atténué chez ces patients serait dû à la présence d'un allèle fonctionnel permettant la synthèse de la protéine FMRP dans une portion des cellules. Ainsi, il est suggéré qu'une relation existerait entre la quantité de synthèse de FMRP au cerveau et le phénotype cognitif des individus avec le syndrome du X fragile.Le but de notre projet de recherche est de développer un test diagnostique pour le syndrome du X fragile, basé sur la mesure quantitative de la protéine FMRP dans les plaquettes sanguines. D'abord, les niveaux de FMRP ont été mesurés dans une population d'individus sans déficience intellectuelle d'âge et de sexe différents. Nos résultats montrent que les niveaux mesurés suivent une distribution normale et ne seraient pas influencés par le sexe ou l'âge. Ensuite, ces niveaux de FMRP ont été comparés avec ceux mesurés chez les individus diagnostiqués avec le syndrome du X fragile. Comme attendu, les niveaux de FMRP des individus avec le X fragile sont inférieurs à ceux des contrôles et permettent d'établir une valeur seuil pour le diagnostic de la maladie. En combinant les résultats obtenus chez les femmes et hommes avec la maladie, une relation positive entre FMRP, le quotient intellectuel et le comportement adaptatif a été observée. Dans le groupe des femmes avec le syndrome du X fragile, la relation entre FMRP et le comportement adaptatif demeure statistiquement significative. L'approche que nous proposons permet non seulement de détecter les cas de syndrome du X fragile, mais également de donner des informations prédictives des capacités cognitives des individus atteints. Ce nouvel outil diagnostique pourrait avoir des impacts significatifs dans l'investigation et la prise en charge des individus avec le syndrome du X fragile.

Fragile X syndrome (FXS) is caused by the lack of fragile X mental retardation protein (FMRP). The animal model of FXS, Fmr1 knockout (KO) mice, shows impairment in hippocampus-dependent learning and memory. However, results for long-term potentiation (LTP), remain inconclusive in the hippocampus of Fmr1 KO mice. Here, we demonstrate that FMRP is required for glycine-induced LTP (Gly-LTP) in the CA1 of hippocampus. The Gly-LTP requires activation of postsynaptic NMDA receptors and metabotropic glutamateric receptors, as well as the subsequent activation of extracellular signal-regulated kinase (ERK) 1/2. However, paired-pulse facilitation was not affected by glycine treatment. Our study provide evidences that FMRP participates in Gly-LTP by regulating the phosphorylation of ERK1/2, and that improper regulation of these signaling pathways may contribute to the learning and memory deficits observed in FXS.

Fragile X syndrome (FXS) is caused by the lack of fragile X mental retardation protein (FMRP). The animal model of FXS, Fmr1 knockout (KO) mice, shows impairment in hippocampus-dependent learning and memory. However, results for long-term potentiation (LTP), remain inconclusive in the hippocampus of Fmr1 KO mice. Here, we demonstrate that FMRP is required for glycine-induced LTP (Gly-LTP) in the CA1 of hippocampus. The Gly-LTP requires activation of postsynaptic NMDA receptors and metabotropic glutamateric receptors, as well as the subsequent activation of extracellular signal-regulated kinase (ERK) 1/2. However, paired-pulse facilitation was not affected by glycine treatment. Our study provide evidences that FMRP participates in Gly-LTP by regulating the phosphorylation of ERK1/2, and that improper regulation of these signaling pathways may contribute to the learning and memory deficits observed in FXS.