Early embryonic development in vertebrates is directed in part by maternal mRNAs expressed in oocytes and stored in cytoplasmic messenger ribonucleoprotein particles (mRNPs). Abundant evidence demonstrates the importance of mRNPs in embryonic development and in post-embryonic cellular function; however their characterization has been hampered by lack of suitable methodologies. The Xenopus oocyte has been the primary model system for studies of mRNPs. YY1 is a well-studied transcriptional regulatory factor that is sequestered in the oocyte cytoplasm and present entirely in cytoplasmic oocyte mRNPs. The objective of this thesis was to examine the biochemistry of YY1 association with maternal mRNA molecules in order to shed light on the role of YY1 in development and the poorly understood biology of oocyte mRNPs. The initial working hypotheses were that association of YY1 with mRNPs is dependent on sequence-specific RNA-binding activity and, therefore, that YY1 associates with a definite subset of maternal mRNA. A number of unique methods were developed in this study to address these hypotheses. RNA immunoprecipitation-DNA microarray (RIP-CHIP) analysis establishes that YY1 associates with a subset of mRNAs in the oocyte pool. A novel sequence-specific RNA-binding activity of the YY1 protein is demonstrated, and the RNA-binding activity of YY1 is shown to be required for its association with oocyte mRNPs in vivo. The functional roles of YY1 mRNA substrates are discussed in the context of embryological development and the biological function of YY1 in oocyte mRNPs. Extension of the experimental approaches developed in this thesis to the entire set of mRNP proteins would significantly advance our understanding of mRNP composition and heterogeneity, as well as the biological function of maternal mRNAs and mRNPs in development.

Early embryonic development in vertebrates is directed in part by maternal mRNAs expressed in oocytes and stored in cytoplasmic messenger ribonucleoprotein particles (mRNPs). Abundant evidence demonstrates the importance of mRNPs in embryonic development and in post-embryonic cellular function; however their characterization has been hampered by lack of suitable methodologies. The Xenopus oocyte has been the primary model system for studies of mRNPs. YY1 is a well-studied transcriptional regulatory factor that is sequestered in the oocyte cytoplasm and present entirely in cytoplasmic oocyte mRNPs. The objective of this thesis was to examine the biochemistry of YY1 association with maternal mRNA molecules in order to shed light on the role of YY1 in development and the poorly understood biology of oocyte mRNPs. The initial working hypotheses were that association of YY1 with mRNPs is dependent on sequence-specific RNA-binding activity and, therefore, that YY1 associates with a definite subset of maternal mRNA. A number of unique methods were developed in this study to address these hypotheses. RNA immunoprecipitation-DNA microarray (RIP-CHIP) analysis establishes that YY1 associates with a subset of mRNAs in the oocyte pool. A novel sequence-specific RNA-binding activity of the YY1 protein is demonstrated, and the RNA-binding activity of YY1 is shown to be required for its association with oocyte mRNPs in vivo. The functional roles of YY1 mRNA substrates are discussed in the context of embryological development and the biological function of YY1 in oocyte mRNPs. Extension of the experimental approaches developed in this thesis to the entire set of mRNP proteins would significantly advance our understanding of mRNP composition and heterogeneity, as well as the biological function of maternal mRNAs and mRNPs in development.

Le complexe EJC (Exon Junction Complex) joue un rôle central dans le couplage des processus post-transcriptionnels chez les métazoaires. Ce complexe multi-protéique est assemblé sur les ARN messagers (ARNm) par la machinerie d’épissage. Organisé autour d’un complexe cœur servant de plate-forme à de nombreux facteurs, les EJCs accompagnent les ARNm dans le cytoplasme et participent à leur transport, leur traduction et leur stabilité. L’importance physiologique de l’EJC est supportée par les nombreux défauts développementaux et les maladies génétiques associées aux composants de l’EJC. Les analyses transcriptomiques révélant un assemblage hétérogène des EJCs renforcent l’hypothèse que les EJCs participent à la régulation de l’expression des gènes. Cependant, malgré une connaissance précise de la structure de ce complexe, les liens fonctionnels entre l’assemblage de l’EJC et la régulation de transcrits spécifiques dans des conditions physiologiques doivent être établis puis caractérisés.Durant cette thèse, j’ai étudié l’expression d’eIF4A3, Y14 et MLN51, trois protéines du cœur de l’EJC, dans des cultures primaires de cellules souches neurales murines (CSN). Les CSN peuvent être différenciées en cellules épendymaires multi-ciliées qui tapissent les ventricules cérébraux et ont un rôle important dans le développement du cerveau. J’ai observé par immunofluorescence dans des CSN quiescentes que les 3 protéines sont concentrées autour du centrosome à la base du cil primaire. Ces localisations reflètent la présence d’EJC assemblés comme le prouve l’étude d’un mutant d’Y14 incapable de former l’EJC. / The Exon Junction Complex (EJC) plays a central role in coupling post-transcriptional processes in metazoans. This multi-protein complex is assembled onto messengers RNAs (mRNAs) by the splicing machinery. Organized around a core complex serving as a platform for numerous factors, EJCs accompany mRNAs to the cytoplasm and is involved in mRNA transport, translation and stability. The physiological importance of the EJC is supported by observations associating defects in EJC component expression to developmental defects and human genetic disorders. Transcriptomic studies revealing the non-ubiquitous deposition of EJCs strengthened the hypothesis that EJCs could participate to gene expression regulation. However, despite a precise picture of the structure of the EJC, functional links between EJC assembly and regulation of specific transcripts under physiological conditions is yet to be established.During this thesis, I studied the expression of eIF4A3, Y14 and MLN51 three core proteins of the EJC in primary cultures of mouse neural stem cells (NSCs). NSCs can be differentiated into multiciliated ependymal cells that line all brain ventricles and have important physiological functions in brain development. We observed by immunofluorescence that in quiescent NSCs, all three proteins are concentrated in the vicinity of the centrosome at the base of the primary cilia. This localization reflects the presence of fully assembled EJCs as proved by the study of Y14 mutant that prevent EJC core mounting.

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Chez les eucaryotes, l’information génétique est transcrite en ARN messager qui subit plusieurs étapes de maturation et évènements d’assemblage avant d’être exporté hors du noyau. Ces modifications du transcrit sont effectuées par de nombreux facteurs protéiques recrutés au transcrit naissant, formant ainsi une particule ribonucléoprotéique (mRNP). La biogenèse du mRNP est étroitement liée avec la transcription et le contrôle qualité afin d’assurer l’efficacité et l’exactitude de la production de mRNPs matures. Des études récentes suggèrent que les membres du complexe THO-Sub2 pourraient être des facteurs cruciaux dans le couplage de la transcription, de la biogénèse du mRNP et de l’export. Dans notre groupe, nous avons mis en oeuvre un essai novateur pour étudier la biogénèse du mRNP et le contrôle qualité, basé sur l’expression du facteur Rho bactérien dans Saccharomyces cerevisiae. Rho interfère avec l’assemblage adéquat du mRNP et génère des transcrits aberrants qui sont dégradés par la machinerie de dégradation nucléaire. Dans cette étude, nous avons utilisé le système expérimental Rho pour mieux comprendre Rrp6 et l’implication de l’exosome dans la dégradation des transcrits liée au contrôle qualité, ainsi que pour mieux caractériser le rôle et la fonction du complexe THO-Sub2 dans le processus de biogénèse du mRNP. Les résultats obtenus révèlent une différence intéressante dans le comportement des membres du complexe THO sous l’action de Rho et dévoilent leur dépendance à la liaison à l’ARN, ce qui n’aurait pas pu être observé avec d’autres techniques expérimentales. Cela confirme le potentiel attendu du système expérimental basé sur Rho dans l’étude des facteurs protéiques impliqués dans la biogénèse et le contrôle qualité du mRNP. / In eukaryotes, the genetic information is transcribed into messenger RNA which undergoes various processing and assembly events prior to its export from the nucleus. These transcript modifications are performed by numerous protein factors recruited to the nascent transcript, thus making a messenger ribonucleoprotein particle (mRNP). mRNP biogenesis is tightly interconnected with both transcription and quality control to ensure efficiency and accuracy in production of mature mRNPs. Recent findings suggest that members of THO-Sub2 complex might be crucial factors in coupling transcription, mRNP biogenesis and export. In our group, we have implemented an innovative assay to study mRNP biogenesis and quality control, based on the expression of the bacterial factor Rho in Saccharomyces cerevisiae. Rho interferes with proper mRNP assembly and generates aberrant transcripts degraded by the nuclear degradation machinery. In this study, we use Rho experimental system to expand our findings on Rrp6 and exosome involvement in quality control degradation of transcripts, as well as to better characterize the role and function of THO-Sub2 complex in the process of mRNP biogenesis. Obtained results reveal an interesting difference in behavior of THO complex members upon Rho action and disclose their dependence on binding to the RNA, which could not be observed by other experimental techniques. This substantiates the expected potential of Rho-based experimental system in the study of protein factors involved in mRNP biogenesis and quality control.

Résumé: Mémoire présenté à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention du diplôme de maître sciences (M.Sc.) en biochimie, Faculté de médecine et des sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4. Le document présent est un mémoire par article, lequel explorera la fonction d'une protéine liant l'ARN, FMRP, dans la différenciation cellulaire. Cette protéine joue un rôle de premier plan puisque son absence conduit à des anomalies développementales durant la neurogenèse et à une plasticité synaptique déficiente. Ces anomalies sont observées chez la souris KO pour le gène FMR1, mais également dans le cerveau des individus avec le syndrome du X fragile (SXF). Ces derniers dont le gène FMR1 est muté présentent une déficience intellectuelle (DI). Puisque la DI est la principale manifestation du SXF, et que les neurones « normaux » expriment FMRP à des niveaux supérieures à ceux des autres tissus corporels, son rôle a presqu'exclusivement été étudié dans les cellules neuronales. Pourtant, FMRP est une protéine hautement conservée et est exprimée dans presque toutes les cellules du corps. Logiquement, FMRP devrait jouer un rôle important dans tous les tissus l’exprimant à des niveaux de base, bien que son absence dans les tissus ne se manifeste pas cliniquement. Cette polyvalence fonctionnelle est encore plus probable de par le fait que plusieurs ARNm différents ont la possibilité d’interagir avec FMRP puisqu’elle identifie ses cibles par reconnaissance de motifs. L'étude présentée se fonde sur l'hypothèse que FMRP effectue des fonctions de base critiques au développement de tous types de tissus humains, et non seulement dans les neurones. L’hypothèse sera davantage développée. Puis, un modèle innovateur de la différenciation cellulaire non-neuronal sera présenté pour l'étude de FMRP. L'enquête sur la distribution subcellulaire et les interactions dynamiques de cette protéine sera détaillée durant les différents changements morphologiques de la spécialisation et de la maturation cellulaire. Les résultats des expériences seront analysés en profondeur. Puis, un retour sur l'hypothèse en guise des résultats expérimentaux permettra de constater que FMRP semble bien jouer un rôle durant la différenciation cellulaire non-neuronale. Ce rôle est intimement lié à la réorganisation du cytosquelette et à la synthèse protéique locale, régulée dans les complexes mRNPs composés de FMRP et ses cibles d'ARNm qui sont régulés, stabilisés et transportés vers les régions en maturation. Ultimement, plusieurs éléments indiquent que FMRP doit interagir correctement avec de nombreuses molécules, décrites dans ce mémoire, afin de permettre aux cellules de se spécialiser et d'acquérir les caractéristiques désirées au cours d’une différenciation normale. / Abstract: The present article-based memoire will explore the involvement of an important RNA-binding protein, FMRP, in cellular differentiation. This protein is well-known for the developmental anomalies during neurogenesis as well as the loss of synaptic plasticity which occur when its gene, FMR1, is mutated. Since FMRP expression is most pronounced in neurons and because the absence of its expression results in the intellectual deficiency known as the Fragile X Syndrome, FMRP has nearly always been studied in neurons alone. However, FM RP is a highly conserved protein, expressed ubiquitously across the body. Additionally, its influence in cells can be vast since its motif - based RNA recognition renders it capable of binding a variety of transcripts. Logically speaking, FMRP should play a role of first rate importance in the other tissues where it is present. The clinical manifestation of its impact in those tissues is likely to be lessened only by the lower levels of FMRP expressed in the average human cell. The main hypothesis of the current study is that FMRP performs critical but basic functions involved in the development of all human tissues where it is present at basal levels, rather than exerting an impact limited to the nervous system alone. The hypothesis will be further elaborated. An innovative non-neuronal model will be presented for the study of FMRP throughout the differentiation process. The behaviour and dynamic interactions of FMRP during cell specialization and morphological maturation will be investigated. An in-depth analysis of the experimental results will follow. Returning to the hypothesis of the study with these results at hand, it will be concluded that FMRP does indeed appear to play a major role in the differentiation of non-neuronal cells. In fact, FMRP's function seems to be closely linked to cytoskeletal reorganization, as well as local protein synthesis through the formation of mRNP complexes with its target mRNAs, which are stabilized, regulated and transported towards the active areas of the cell in differentiation. Ultimately, it is clear that proper interaction between FMRP and certain types of molecules, described in this memoire, is required for cells to specialize and acquire the characteristics of mature cells through normal differentiation.

The exosome, an evolutionarily conserved protein complex with exoribonucleolytic activity, is one of the key players in mRNA quality control. Little is known about the functions of the exosome in metazoans. We have studied the role of the exosome in nuclear mRNA surveillance using Chironomus tentans and Drosophila melanogaster as model systems. Studies of the exosome subunits Rrp4 and Rrp6 revealed that both proteins are associated with transcribed genes and nascent pre-mRNPs in C. tentans. We have shown that several exosome subunits interact in vivo with the mRNA-binding protein Hrp59/hnRNP M, and that depleting Hrp59 in D. melanogaster S2 cells by RNAi leads to reduced levels of Rrp4 at the transcription sites. Our results on Rrp4 suggest a model for cotranscriptional quality control in which the exosome is constantly recruited to nascent mRNAs through interactions with specific hnRNP proteins. Moreover, we show that Rrp6 interacts with mRNPs in transit from the gene to the nuclear pore complex, where it is released during early stages of nucleo-cytoplasmic translocation. Furthermore, we show that Rrp6 is enriched in discrete nuclear bodies in the salivary glands of C. tentans and D. melanogaster. In C. tentans, the Rrp6-rich nuclear bodies colocalize with SUMO. We have also constructed D. melanogaster S2 cells expressing human b-globin genes, with either wild type of mutated splice sites, and we have studied the mechanisms by which the cells react to pre-mRNA processing defects. Our results indicate that two surveillance responses operate co-transcriptionally in S2 cells. One requires Rrp6 and retains defective mRNAs at the transcription site. The other one reduces the synthesis of the defective transcripts through a mechanism that involves histone modifications. These observations support the view that multiple mechanisms contribute to co-transcriptional surveillance in insects. / At the time of the doctoral defense, the following paper was unpublished and had a status as follows: Paper 4: Manuscript.

Chez les eucaryotes, les RNA Binding Proteins (RBP) s’associent aux transcrits pour former des Particules Ribo-Nucléoprotéiques (mRNP) dynamiques, dont la localisation et la composition sont déterminantes pour la maturation, l’export, la stabilité et la traduction des ARNm. Les protéines à motif LA sont des protéines de liaison à l’ARN, présentes chez plusieurs centaines d’espèces eucaryotes, qui se répartissent en 5 sous-familles : LA authentiques, LARP1, 4, 6 et 7. Les membres de ces sous-familles partagent des caractéristiques évolutives, des domaines additionnels et des fonctions conservés. Mes travaux de thèse ont contribué à l’étude fonctionnelle de protéines LARP6 chez Arabidopsis thaliana. On sait, à l’heure actuelle, que chez Manduca sexta et plusieurs espèces de vertébrés, LARP6 est impliquée dans la régulation de la différenciation cellulaire. Chez l’Homme, elle agit en tant que RBP pour coordonner la traduction des ARNm codant les sous-unités du collagène de type I. Les plantes vasculaires ont la particularité de contenir plusieurs protéines LARP6, classées en trois groupes évolutifs. Chez A. thaliana, l’unique représentant de chaque sous-famille semble s’être spécialisé. D’ailleurs, les protéines LARP6b et c ont des profils d’expression mutuellement exclusifs, où LARP6c est présente dans le pollen et LARP6b est ubiquitaire mais absente du gamétophyte mâle. Nous avons axé notre travail sur la protéine LARP6c et démontré qu’elle est cytoplasmique et impliquée, dans le pollen, dans le contrôle de la quantité d’ARNm codant des acteurs du transport vésiculaire. Les ARNm identifiés comme cibles potentielles de LARP6c codent, eux aussi, des facteurs impliqués dans le transport ; et possèdent dans leur 5’-UTR deux motifs qui pourraient permettre leur co-régulation par fixation de RBP. La délétion de LARP6c, affecte la capacité du tube pollinique à se diriger vers l’ovule suggérant un défaut de communication; ce qui est cohérent avec la dérégulation des ARNm codant des acteurs de la sécrétion/réception de signaux extracellulaires. Nous proposons que LARP6c intervient, dans le pollen, en tant que protéine de mRNP et co-régule la traduction et/ou la stabilité de transcrits codant des acteurs des voies de communications dépendantes de la sécrétion et de l’endocytose, et intervenant dans les échanges mâle/femelle / In eucaryotes, RNA Binding Proteins (RBP) associate with transcripts to form dynamic Ribo-Nucleoprotein Particles (mRNP), whose localization and composition are determinant for mRNA maturation, export, stability and translation. LA motif proteins are RNA binding proteins, found in several hundred eucaryotic species, which fall in 5 sub-families: genuine LA, LARP1, 4, 6 and 7. Members of these subfamilies share conserved evolutionary history, additional motifs and functions. My thesis work contributed to deciphering the functional properties of the Arabidopsis thaliana LARP6 proteins. Currently, we know that in Manduca sexta and many vertebrates species LARP6 is implicated in the regulation of cellular differentiation. In humans, it acts as an RBP to coordinate the translation of mRNA coding for type I collagen subunits. Vascular plants differ in possessing many LARP6 proteins classified in three evolutionary groups. In A. thaliana, the unique member of each subfamily seems to be specialized. LARP6b and c proteins present mutually exclusive expression profiles, with LARP6c only present in pollen and LARP6b ubiquitously expressed except in the male gametophyte. We mostly focused our work on LARP6c and showed it to be cytoplasmic and implicated in controlling the level of mRNAs encoding vesicular transport actors in pollen tubes. Putative identified LARP6c mRNA baits also encode proteins involved in transport and share two motifs in their 5’-UTR that could allow their co-regulation via RBP binding. LARP6c deletion induces deficiencies in pollen tube guidance towards the ovule, suggesting a communication default. This is consistent with the deregulation of mRNA coding for extra-cellular signal secretion/reception actors. We propose that LARP6c acts as an mRNP protein in pollen and co-regulates translation and/or stability of mRNA coding for actors of communication pathways depending on secretion and endocytosis; hence acting on male/female exchanges.

Les ARNm sont des molécules centrales pour la régulation des gènes, aidant à convertir l'information génétique stockée dans l'ADN en protéines fonctionnelles. En tant que polymère simple brin, mesurant des centaines à des milliers de nucléotides, les ARNm peuvent former des structures secondaires et tertiaires étendues formant des particules appelés ribonucléoprotéines messagères (RNPm) en s’assemblant avec des protéines. L'organisation 3D des (pré-)RNPm influence de nombreux aspects de leur métabolisme, incluant la régulation de leur maturation, de leur export et de leur traduction dans le cytoplasme. Malgré leur importance, notre compréhension de l'organisation structurelle des (pré-)RNPm in vivo, et des principes qui la régissent est minime. Au cours de ma thèse, j'ai analysé l'organisation des (pré-)mRNP en développant une vision centrée sur l'ARN. Pour cela, j'ai mis en place une approche combinant l'hybridation in situ d'ARN monomoléculaire (smFISH) avec la microscopie à illumination structurée (SIM) et l'ai utilisée pour étudier l'organisation des mRNP dans le noyau et le cytoplasme. Nos résultats suggèrent que l'organisation (pré-)mRNP varie à différents stades de sa vie. Nous montrons que l'empaquetage (pré-)mRNP commence de manière co-transcriptionnelle, avec des introns organisés en conformations compactes. Cette organisation est modifiée au cours de la transcription au fur et à mesure que la polymérase se déplace le long du gène, assemblant finalement un intron avec les extrémités à proximité l’une de l’autre, d'une manière dépendante du spliceosome, suggérant que l'organisation co-transcriptionnelle des introns pourrait être critique pour déterminer son excision. Une fois libérés, les mRNP ont une organisation linéaire compacte dans le nucléoplasme et éventuellement une conformation en tige. L'organisation d’un mRNP dans le cytoplasme est influencée par sa traduction. Alors que la traduction ouvre les mRNP, la séparation des extrémités de l'ARNm, l'inhibition de la traduction et la libération de ribosomes, ou le recrutement dans les granules de stress, donnent aux mRNP une structure très compacte. Fait intéressant, nous trouvons rarement des ARNm avec les extrémités 5' et 3' à proximité, ce qui suggère que la traduction en boucle fermée n'est pas un état universel pour tous les ARNm en cours de traduction. Ensemble, nos résultats fournissent une image essentielle de l'organisation du mRNP dans les cellules et souligne le rôle important de la conformation du RNPm dans la régulation de la traduction et de la maturation d’une RNPm. / mRNAs act as the central molecules in gene regulation, helping convert the genetic information stored in the DNA to functional proteins. As a single-stranded polymer, hundreds to thousands of nucleotides in length, mRNAs can form extensive secondary and tertiary structures and, together with proteins, are packaged into assemblies called messenger ribonucleoproteins (mRNPs). The 3D organisation of (pre-)mRNPs influences many aspects of what happens to them, including regulating their processing, export and translation in the cytoplasm. Despite their significance, our understanding of the structural organisation of (pre-)mRNPs in vivo is minimal, as is our comprehension of the principles that govern it. During my PhD, I have developed an RNA-centric view on (pre-)mRNP organisation. For this, I have established an approach combining single-molecule RNA in situ hybridisation (smFISH) with structured illumination microscopy (SIM) and used it to study mRNP organisation in the nucleus and cytoplasm. Our results suggest that (pre-)mRNP organisation is altered at various stages during its lifetime. We show that (pre-)mRNP packaging starts co-transcriptionally, with introns organised into compact conformations. This organisation is altered during the course of transcription as the polymerase travels along the gene, finally assembling an intron with the ends in proximity in a spliceosome dependent manner, suggesting that co-transcriptional intron organisation could be critical in determining its excision. Once released, mRNPs have a compact linear organisation in the nucleoplasm and possibly a rod-like conformation. mRNP organisation in the cytoplasm is influenced by its translational status. While translation opens up mRNPs, separating the ends of the mRNA, translation inhibition and release of ribosomes, or recruitment to stress granules result in mRNPs having a highly compact structure. Interestingly, we rarely find mRNAs with the 5’ and 3’ ends in proximity, suggesting that closed-looped translation is not a universal state for all translating mRNAs. Together, our results provide a unique and essential view of mRNP organisation in cells and reveal important insight into the role of mRNP conformation in regulating translation and mRNP processing.

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