Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de protéines transmembranaires et régulent une panoplie de processus physiologiques. La densité de récepteurs exprimés à la surface d'une cellule dicte l’intensité de la réponse cellulaire suite à l’activation par un ligand. Un débalancement dans les niveaux d’expressions protéiques est la cause de plusieurs pathologies. C’est pourquoi il est d’une importance capitale de comprendre les mécanismes qui régissent les niveaux d’expressions totaux et membranaires des RCPG. Dans un premier temps, nos travaux ont permis de caractériser la dynamique d’internalisation et de recyclage du récepteur CRTH2. Nous avons identifié les domaines qui sont impliqués dans la régulation du trafic du récepteur. Des essais d’expression de surface ont révélé les cibles majeures des GRK2, GRK5, de la PKC et de l’arrestine-3 pour l’internalisation de CRTH2 suite à une stimulation du récepteur. De plus, nous rapportons la présence d’un motif de recyclage interne de type PDZ dans la queue cytoplasmique de CRTH2. Avant de se rendre à la membrane plasmique, les RCPG doivent être synthétisés au réticulum endoplasmique (RE), subir des étapes de maturation au Golgi et être transportés à la membrane plasmique. Les évènements coordonnant ces processus sont encore très peu étudiés. La dernière partie de nos travaux a permis d’élucider différents mécanismes régulant le contrôle qualité des RCPG à un stade précoce de synthèse. Tout d’abord, une nouvelle stratégie de purification protéomique a été développée et validée dans le but d’identifier des nouveaux partenaires d’interaction des RCPG dans un contexte cellulaire. Les résultats des criblages ont montré une interaction entre le récepteur [beta indice inférieur 2]AR et l’ubiqutine ligase RNF5. Ceci a conduit à la découverte d’un nouveau mécanisme de contrôle qualité des RCPG faisant intervenir les protéines RNF5 et JAMP comme étant des composantes importantes d’un système de régulation qui module la stabilité des RCPG. En dernier lieu, une nouvelle protéine, ANKRD13A, régulerait l’expression des RCPG par un mécanisme encore inconnu. Des évidences nous permettent de croire que les protéines RNF5, JAMP et ANKRD13A feraient partie d’un complexe protéique régulant le contrôle qualité des RCPG au RE.

La Radiothérapie Conformationnelle par Modulation d'Intensité (RCMI) est aujourd'hui reconnue comme une technique de référence permettant d'augmenter le contrôle local de la tumeur tout en réduisant la dose reçue par les organes à risques avoisinants. Cependant, son développement est freiné par l'étape de préparation du traitement du patient qui nécessite une charge de travail considérable. Dans le but d'augmenter l'efficience de la mise en œuvre d'un traitement, deux axes de travail ont été déterminés.<br />Le premier axe concernait l'optimisation automatique des incidences des faisceaux. Nous avons pour cela mis en œuvre un algorithme (le simplexe) qui a été intégré dans le système de planification de traitement. Il permet, à partir des objectifs dosimétriques fixés par l'utilisateur, de déterminer automatiquement les incidences de faisceaux optimales : irradiant suffisamment le volume cible tout en épargnant les organes à risques avoisinants. En plus d'un gain en temps, les résultats du simplexe ont montré – sur trois patients atteints d'un cancer de l'oropharynx – un gain en qualité par rapport à une sélection manuelle des faisceaux. En effet, pour une couverture du volume cible équivalente voire meilleure, il permet de réduire la dose reçue par les organes à risques.<br />Le second axe concernait l'optimisation des contrôles pré-traitement. Nous avons pour cela utilisé une méthode industrielle : la Maîtrise Statistique des Processus (MSP) afin d'analyser rétrospectivement les résultats des contrôles de la dose absolue effectués avec la chambre d'ionisation au Centre Alexis Vautrin (CAV). Cette étude a montré l'intérêt de la MSP pour renforcer la sécurité des traitements grâce à la mise en place de cartes de contrôle. Elle a également montré que notre processus de délivrance de la dose était stable et statistiquement capable pour les traitements de la prostate, ce qui implique qu'une réduction du nombre de contrôles peut être envisagée pour ce type de traitement au CAV.

La Radiothérapie Conformationnelle par Modulation d’Intensité (RCMI) est aujourd’hui reconnue comme une technique de référence permettant d’augmenter le contrôle local de la tumeur tout en réduisant la dose reçue par les organes à risques avoisinants. Cependant, son développement est freiné par l’étape de préparation du traitement du patient qui nécessite une charge de travail considérable. Dans le but d’augmenter l’efficience de la mise en œuvre d’un traitement, deux axes de travail ont été déterminés. Le premier axe concernait l’optimisation automatique des incidences des faisceaux. Nous avons pour cela mis en œuvre un algorithme (le simplexe) qui a été intégré dans le système de planification de traitement. Il permet, à partir des objectifs dosimétriques fixés par l’utilisateur, de déterminer automatiquement les incidences de faisceaux optimales : irradiant suffisamment le volume cible tout en épargnant les organes à risques avoisinants. En plus d’un gain en temps, les résultats du simplexe ont montré – sur trois patients atteints d’un cancer de l’oropharynx – un gain en qualité par rapport à une sélection manuelle des faisceaux. En effet, pour une couverture du volume cible équivalente voire meilleure, il permet de réduire la dose reçue par les organes à risques. Le second axe concernait l’optimisation des contrôles pré-traitement. Nous avons pour cela utilisé une méthode industrielle : la Maîtrise Statistique des Processus (MSP) afin d’analyser rétrospectivement les résultats des contrôles de la dose absolue effectués avec la chambre d’ionisation au Centre Alexis Vautrin (CAV). Cette étude a montré l’intérêt de la MSP pour renforcer la sécurité des traitements grâce à la mise en place de cartes de contrôle. Elle a également montré que notre processus de délivrance de la dose était stable et statistiquement capable pour les traitements de la prostate, ce qui implique qu’une réduction du nombre de contrôles peut être envisagée pour ce type de traitement au CAV / Intensity Modulated Radiation Therapy (IMRT) is currently considered as a technique of choice to increase the local control of the tumour while reducing the dose to surrounding organs at risk. However, its routine clinical implementation is partially held back by the excessive amount of work required to prepare the patient treatment. In order to increase the efficiency of the treatment preparation, two axes of work have been defined. The first axis concerned the automatic optimisation of beam orientations. We integrated the simplex algorithm in the treatment planning system. Starting from the dosimetric objectives set by the user, it can automatically determine the optimal beam orientations that best cover the target volume while sparing organs at risk. In addition to time sparing, the simplex results of three patients with a cancer of the oropharynx, showed that the quality of the plan is also increased compared to a manual beam selection. Indeed, for an equivalent or even a better target coverage, it reduces the dose received by the organs at risk. The second axis of work concerned the optimisation of pre-treatment quality control. We used an industrial method: Statistical Process Control (SPC) to retrospectively analyse the absolute dose quality control results performed using an ionisation chamber at Centre Alexis Vautrin (CAV). This study showed that SPC is an efficient method to reinforce treatment security using control charts. It also showed that our dose delivery process was stable and statistically capable for prostate treatments, which implies that a reduction of the number of controls can be considered for this type of treatment at the CAV

Mise en oeuvre de microréseaux de lectines naturelles et recombinantes dédiés au suivi de production des glycoprotéines d’intérêt thérapeutiqueLes anticorps thérapeutiques, biomédicaments dont le marché est en pleine expansion, sont des glycoprotéines obtenues en bioproduction dans des cellules eucaryotes. Leur N-glycosylation, cruciale pour la modulation des fonctions effectrices des anticorps, confère un effet pro-inflammatoire ou anti-inflammatoire aux anticorps. Les anticorps thérapeutiques recombinants actuellement commercialisés présentent des glycosylations dites tronquées (GlcNAc terminaux) ou non humaines (α-Gal, NeuGc) rendant les anticorps immunogènes et, par conséquent, réduisant notablement leur efficacité. Les Agences de Santé exigent de réduire cet effet secondaire. La société SiaMed’Xpress a développé un savoir-faire pour obtenir une glycosylation complète, incluant la sialylation terminale des N-glycanes par ingénierie des cellules eucaryotes. Il est nécessaire de disposer d’outils d’analyse permettant de suivre la qualité de la N-glycosylation au cours de la production.La modification du milieu de culture par ajout de suppléments nutritionnels permet une modulation supplémentaire de la glycosylation. L’utilisation de suppléments nutritionnels commerciaux augmentent le taux de production mais bloquent la glycosylation au stade G0(F) (GlcNAc terminaux) alors que l’utilisation d’un supplément propre à SiaMed’Xpress permet de poursuivre jusqu’à la galactosylation et la sialylation, mettant ainsi en évidence un carrefour métabolique clé dans la glycosylation. Pour suivre les modifications de glycosylation dans différentes conditions de production, un test utilisant des lectines a été développé. Un jeu de treize lectines naturelles et recombinantes a été sélectionné par analyse bio-informatique et intégré dans un glycotest. L’utilisation de ce glycotest pour l’analyse de la glycosylation de trois anticorps produits en présence de différents suppléments nutritionnels permet d’obtenir de façon rapide, fiable et reproductible les profils de glycosylation des anticorps. Ainsi, le glycotest développé est fonctionnel et permet de caractériser la glycosylation des anticorps thérapeutiques recombinants. / Development of natural and recombinant lectin microarrays for monitoring the production of glycosylated protein drugsTherapeutic antibodies, biologic drugs whose market is growing, are glycoproteins obtained though bioproduction in eukaryotic cells. Their N-glycosylation, which is crucial for the modulation of effector functions, confers a pro-inflammatory or anti-inflammatory effect to antibodies. Currently, marketed therapeutic recombinant antibodies have truncated (terminal GlcNAc) or non human (α-Gal, NeuGc) glycosylation, inducing immunologic reaction and, consequently, reducing their effectiveness. Health agencies demand to reduce such secondary effects. SiaMed’Xpress developped a knowledge to obtained a complete glycosylation, including terminal sialylation of N-glycans by engineering eukaryotic cells for production. It is now necessary to develop analysis tools to monitor the quality of the N-glycosylation during bioproduction.Modification of culture media with feeds allows to further modulate glycosylation. The use of marketed feeds increase the production rate but block the glycosylation process in the G0(F) state (terminal GlcNAc) whereas SiaMed’Xpress feed allows for galactosylation and sialylation, highlighting a metabolic key point during the glycosylation. To follow the glycosylation modifications under different conditions of production, an assay using lectins has been developed. A panel of 13 lectins, recombinants and naturals, has been determined by bio-informatic analysis and integrated into a glycotest. The use of this glycotest to analyse glycosylation of 3 antibodies produced with different feeds allows fast, reliable and reproductible glycosylation profils of these antibodies. So, this developped glycotest is functionnal and this using permits to monitore therapeutic recombinant antibody glycosylation during bioproduction.

Durant les dix dernières années, l'imagerie médicale a profité pleinement de l'essor technologique des techniques d'imagerie numérique. Dans le domaine de la radiographie X, les nouveaux détecteurs, possédant un encombrement réduit et une meilleure sensibilité, détrônent progressivement les anciennes techniques à film ou à tube. Cette thèse, préparée en partenariat avec l'entreprise Trixell, leader mondial des détecteurs plats pour radiographie médicale, traite du contrôle qualité des images issues de ces détecteurs. L'exigence du domaine médical impose un contrôle strict des défauts pouvant apparaître sur les images. Cette thèse est donc axée sur la conception d'une chaîne complète d'analyse de la qualité des images issues des détecteurs numériques. Un éclairage particulier est donné à la détection des défauts, parfois peu visibles, à l'aide de techniques de détection adaptées à notre contexte de défauts spatialement corrélés dans un fort bruit de fond.

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La thèse réalisée dans le cadre d'une coopération entre l'Université de Savoie et une grande manufacture horlogère traite du problème de la maîtrise de la qualité visuelle des produits manufacturés de haute qualité. Nous faisons l'hypothèse que la maîtrise de cette qualité passera encore pour de nombreuses années par un contrôle visuel des produits. Le travail présenté dans cette thèse propose ainsi les bases d'un modèle métrologique sensoriel formalisant le contrôle visuel. Ce travail repose sur les démarches d'analyse sensorielle. Le premier chapitre présente une étude bibliographique des différents éléments relatifs au contrôle qualité en général, et au contrôle visuel en particulier. Le chapitre 2 décrit la démarche générique que nous proposons pour percevoir, puis évaluer une anomalie. Cette démarche distingue de façon formelle la perception d'une anomalie de son évaluation. Nous montrons que cette distinction apporte une bien meilleure compréhension des sources de variabilité dans le contrôle visuel. En partant des démarches largement utilisées dans le cadre de l'analyse sensorielle, notre démarche formalise donc ces deux étapes afin de réduire la variabilité dans la décision de conformité lors d'un contrôle visuel. Le chapitre 3 propose une structuration d'une démarche métrologique ayant pour objectif de garantir, la justesse et la faible variabilité dans le temps et dans l'espace. Notre proposition, basée sur les concepts d'une métrologie dimensionnelle, intègre les spécificités liées à toute mesure sensorielle réalisée par l'homme, et en particulier la part de subjectivité importante qui peut être associée à cette mesure. Partant de l'évaluation d'une seule anomalie, nous décrivons dans le chapitre 4 une démarche permettant de décider de l'acceptation ou du refus d'un produit combinant différentes anomalies sur différentes surfaces. Notre approche, fondée sur la fonction perte de Taguchi, permet de généraliser au contrôle visuel les approches de tolérancement largement utilisées en qualité géométrique des produits. Le chapitre 5 illustre l'application de ces concepts au sein de l'entreprise avec laquelle nous avons collaboré. Il propose également une synthèse de gains que peut apporter une telle démarche dans une entreprise.

Les médicaments à base de substances naturelles telles que les plantes et les venins sont de plus en plus développés dans l’industrie pharmaceutique. Le contrôle qualité des matières premières ou teintures mères d’origine végétales ou animales, obligatoire dans un environnement BPF, est bien plus complexe que celui des petites molécules pharmaceutiques de synthèse. En effet, les substances responsables de l’activité thérapeutique recherchée sont souvent mal identifiées et on observe une variabilité qualitative et quantitative naturelle parfois importante, ce qui peut modifier de façon significative leur efficacité. Afin de s’assurer de l’homogénéité de chaque souche reçue, il est demandé, entre autre, de développer des méthodes de contrôle analytique permettant d’obtenir un « profil ou empreinte » analytique de la souche considérée, assimilable à une « carte d’identité » qui servira de référence pour le contrôle des lots utilisés en production. L’empreinte analytique (spectre, chromatogramme, électrophérogramme …) devra permettre une séparation la plus complète possible de l’ensemble des composés présents dans la souche considérée tout en tenant compte de sa « variabilité naturelle » afin d’assurer un contrôle qualitatif et semi-quantitatif.L’étude présentée a consisté à développer une approche analytique originale, combinant électrophorèse capillaire et chimiométrie, afin d’établir des profils électrophorétiques spécifiques («fingerprint») permettant d’effectuer le contrôle qualité de souches brutes de venins de serpents utilisés en thérapeutique. Les venins de serpent sont des mélanges complexes de peptides et de protéines, de plus en plus utilisés dans la conception de nouveaux médicaments. Comme toutes les substances naturelles, la composition des venins de serpents est sujette à une variabilité intra et inter individus relativement importante. De fait, la qualité de la matière première pour la production de médicament devient un challenge. Dans cette étude, l’électrophorèse capillaire s’est révélée comme une technique efficace pour la séparation des divers constituants composant les souches brutes de venins de serpent et l’obtention de leurs empreintes analytiques. L’étude a porté sur 4 venins de serpent, Lachesis muta, Bothrops lanceolatus, Vipera aspis aspis, Naja naja qui sont parmi les plus utilisés en thérapeutique. Une approche chimiométrique a alors été développée afin de tenir compte de variabilité qualitative et quantitative observée entre différents lots. Cette approche originale nous a permis d’extraire les pics d’intérêts (i.e. présents dans chaque lot d’un même venin) et d’établir une empreinte analytique de référence avec des seuils de conformité quantitatifs. / Although the therapeutic potential of natural substances is known for thousands of years in traditional medicine, it knows an increasing renewed interest in modern pharmaceutical industry as being an inexhaustible source of therapeutic active substances for various diseases.However, the quality control of these products, which is necessary to obtain reproducible biological activities and new commercial approvals, remains a great analytical challenge. Indeed, natural substances show a myriad of biological activities that can result from a specific or synergistic effects of many different components and this information remains still mostly unknown. Furthermore, because they are derived from living organisms and hence are affected by biotic and abiotic factors, it is extremely difficult to ensure a constant qualitative and quantitative composition for these natural substances among different batches. Consequently, there is a need to develop analytical strategies able to assess the “sameness” of natural productions that is analytical strategies able to assess required similarity between different batches by integrating acceptable qualitative and quantitative variations.To achieve this, the concept of analytical fingerprint has become more and more popular and is now starting to be accepted by regulatory authorities such as the FDA. This so-called “pattern-approach” aims at: (i) gaining effective and stable information about common features of a given strain (ii) evaluating similarity and difference with chemometric methods.If this concept has been quite largely studied for the quality assessment of herbal medicines, it is very still very little developed for animal active substances like snake venoms, which are of increasing interest in therapeutic research due to their rich composition in peptides and proteins. The routine quality control of venom raw substances is still often limited to a single gel electrophoresis which is clearly insufficient in terms of components resolution to achieve similarity-/dissimilarity between strains.MethodsIn this context, we have developed an original analytical fingerprint strategy that combines capillary electrophoresis and chemometrics. CE is a particularly well suited technique for peptides/proteins separation allowing to obtain complex specific fingerprints. Batches of different snake venoms have been analyzed with many replicates. All electropherograms have been processed using several chemometrics approaches (baseline correction, signals alignment, automatic recognition of common peaks …) to obtain a representative analytical trace that can be used for the quality assessment of different production lots.ResultsWe show that CE is a very well adapted method to produce highly specific and repeatable analytical profiles of different venom strains. Chemometric methods applied are very efficient to produce an average fingerprint for each strain that integrates features common to all batches and define acceptable variations in quantitative composition. Similarity/dissimilarity of different batches can then be assessed in an automatic manner.ConclusionAll presented results show the efficacy of CE combined with chemometrics to assess the quality of snake venom raw substances. It can be easily implemented in industrial quality control. This strategy can be implemented in future for other type of therapeutic substances of animal origin.

De nombreuses maladies génétiques sont directement liées à la reconnaissance de protéines mal repliées par le contrôle qualité du réticulum endoplasmique (RE), conduisant à leur rétrotranslocation vers le cytosol puis leur dégradation. Dans le cas des glycoprotéines mutées, comme la protéine F508del-CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), la démannosylation extensive de leur résidus mannoses constitue une étape clé dans ce processus. L’objectif de ce travail a été d’identifier et de caractériser des molécules capables de rétablir l’expression membranaire de F508del-CFTR en ciblant cette activité enzymatique. Dans un premier temps, nous avons testé des dérivés multivalents basés sur le Deoxymannojirimycin (DMJ), un inhibiteur spécifique de la classe I des α-mannosidases et révélé leur effet correcteur puissant sur F508del-CFTR. Nous avons par la suite mis en évidence leur mécanisme d’action et tenté d’expliquer l’augmentation d’efficacité observée entre les monovalents et les multivalents. Nous nous sommes enfin focalisés sur le rôle des principales mannosidases dans le RE, l’α1,2-mannosidase I du RE (ERManI) et la famille des lectines EDEM (ER degradation-enhancing α-mannosidase-like protein). Nous avons montré par une stratégie de siRNA qu’ERManI, EDEM1 et EDEM2 sont impliquées dans la rétention réticulaire du F508del-CFTR.Notre étude ouvre ainsi de nouvelles perspectives quant à l’identification de nouveaux agents pharmacologiques ciblant ces protéines. / Numerous genetic diseases are directly associated to the recognition of misfolded proteins by the endoplasmic reticulum (ER) quality control, leading to their retention and subsequently their retrotranslocation to the cytosol for degradation. In the case of mutated glycoproteins such as F508del-CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), causing CF pathology, mannose trimming is a key step of this process. Our objective was to identify and characterize molecules targeting ER-mannosidases activity, with the goal to restore F508del-CFTR to the plasma membrane.First, we tested multivalent derivatives, based mainly on Deoxymannojirimycin (DMJ), a specific inhibitor of α-mannosidasesI and revealed their better corrective effect on F508del-CFTR and their mechanism of action. Then we explored the mechanism explaining the higher efficiency of the multivalents compared to the monovalent. Finally, we focused on the role of key players of mannose trimming, ER-α1,2-mannosidase I (ERManI) and EDEMs (ER degradation-enhancing α-mannosidase-like protein) proteins on F508del-CFTR trafficking defect. We showed the implication of ERManI, EDEM1 and EDEM2 in F508del-CFTR retention, using a siRNA strategy. In conclusion, our study highlights these proteins as potential pharmacological targets to develop correctors for the F508del-CFTR trafficking defect.

La plupart des médicaments anticancéreux sont des substances à marge thérapeutique étroite, les erreurs médicamenteuses peuvent avoir des conséquences majeures pour les patients. Il est de la responsabilité pharmaceutique de garantir le bon médicament à la bonne dose par la mise en place d’un contrôle qualité des préparations avant administration. Par ailleurs, ces molécules potentiellement cancérogènes, mutagènes et reprotoxiques présentent un risque pour les personnes exposées notamment le personnel de santé. L’objectif de ce travail de thèse a été de développer des outils permettant d’optimiser la sécurité du circuit de ces médicaments anticancéreux à l’hôpital tant pour le patient que pour le personnel de santé. Des outils analytiques associés à des méthodes d’interprétation des données issues de la chimiométrie et de la gestion de risque ont été mis en œuvre afin de répondre à cette problématique.Dans le cadre de la sécurisation du personnel, la recherche de traces de molécules anticancéreuses dérivées du platine a permis de mettre en évidence les zones les plus contaminées. Sur la base de ces contaminations et des conditions de travail, une méthodologie d’analyse de risque multicritère a été développée pour évaluer le risque d’exposition du personnel. Face au risque encouru, différentes mesures correctives ont été envisagées et des études évaluant plus spécifiquement l’efficacité détergente des opérations de décontamination des surfaces et des flacons ont été menées.En parallèle, des essais visant à sécuriser les préparations avant administration ont été conduits sur deux molécules anticancéreuses : le 5-fluorouracile et la gemcitabine. Au regard de leur caractère non destructif, non invasif et de ce fait, plus sécurisé, les spectroscopies vibrationnelles Raman et proche infrarouge ont été explorées. Les données spectrales (zones spectrales et prétraitements) ont été optimisées par des analyses multivariées ComDim pour développer des modèles de régression PLS prédisant la concentration en principe actif en solution. Les résultats ont montré la faisabilité et la complémentarité des techniques de spectroscopie Raman et proche infrarouge pour la détermination quantitative des molécules anticancéreuses. / Most of the anticancer drugs are defined by a narrow therapeutic margin; therefore medical errors can have major consequences on patients. Thus, it’s necessary to guarantee the good drug at the good dose by the implementation of a quality control of the preparation before administration. These potentially carcinogenic, mutagenic or teratogenic drugs present a risk for exposed people especially healthcare workers.The aim of this study was to develop tools which can optimize the safety of the cytotoxic medication circuit in hospitals, for the patient as much as for healthcare workers. In order to respond to these problematics, analytical tools have been associated with different methods of data interpretation of chemometric and risk management.To improve healthcare workers’ safety, environmental monitoring looking for traces of platinum compound cytotoxic drugs were performed to identify the most contaminated areas. Based on these contaminations and working conditions, a methodology of multi-criteria risk analysis has been developed to quantify the risk of exposure of healthcare workers. Regarding the risk, various corrective measures were considered. Thus, studies based on the detergent efficiency of decontamination protocols used to clean workplace surfaces and cytotoxic vials were conducted.In parallel, assays were performed on two anticancer molecules to secure cytotoxic preparations before administration: 5-fluorouracile and gemcitabine. Regarding their non-destructive, non-invasive properties and therefore, more secured handling, Raman and near infrared spectroscopy were explored. Spectral data (spectral zones and pretreatments) were optimized by multivariate analyses ComDim to develop models of regression PLS predicting the concentration of the active ingredient in solution. Results showed the feasibility and the complementarity of these two spectroscopies in the quantitative determination of the cytotoxic drugs.These works participate in the continuous approach of quality assurance implemented in numerous health institutions. We hope that they will contribute to durably decrease risks associated to cytotoxic drugs for both patients and healthcare workers.