Les études sur la structure atomique des macromolécules biologiques ont été d'une grande importance en révélant des relations structurales et fonctionnelles d'enzymes, d'acides nucléiques et d'autres macromolécules dans divers systèmes biologiques. Dans la présente étude, la cristallogenèse et la cristallographie aux rayons X ont été utilisés pour déterminer la structure d'inhibiteur de protéinase A à une résolution atomique. Les inhibiteurs de protéinase A et B (API-A, -B) de la arrowhead, sont les deux principaux composés inhibiteurs qui sont purifiés à partir de la arrowhead (Sagittaria sagittifolia, Linn.). Ils sont des inhibiteurs à double tête multifonctionnels de diverses protéases. La structure du complexe ternaire de l'inhibiteur API lié à deux trypsines a été déterminée. Cependant, la structure tridimensionnelle de l'apoenzyme API-A est encore inconnue. A cet effet, la cristallogenèse de l’apoenzyme API-A a été réalisée. Après des étapes de purification et de cristallisation appropriées, des cristaux de l’apoenzyme API-A d’une qualité permettant la diffraction des rayons-X à haute résolution ont été obtenus en utilisant la méthode de diffusion de vapeur dans une goutte suspendue. Un ensemble complet de données de diffraction des rayons-X jusqu’à une résolution de 3,10 Å a été obtenu avec un crystal en forme de diamant, dont, le groupe d'espace a été déterminé comme étant P1. Ces données seront importantes pour comprendre la fonction d'API-A dans des systèmes biologiques. / Structural studies of biological macromolecules at atomic resolution have revealed many specific aspects of the structure/function relationships of the enzymes, nucleic acids and other macromolecules in biological systems. In the present study, protein crystallogenesis and X-ray crystallography were used to determine the structure of the protease inhibitor A at atomic resolution. The arrowhead protease inhibitors A and B (API-A, -B), are the two major inhibitor components which are purified from the tubes of arrowhead (Sagittaria sagittifolia, Linn.). Both API-A and API-B are double-headed multifunctional protease inhibitors. The ternary structure of the inhibitor API-A complex with two trypsins has been reported. However, the three-dimensional structure of the apoenzyme API-A is still unknown. In this regard, crystallogenesis of apoenzyme API-A was studied. After proper purification and crystallization steps, diffraction-quality crystals of the apoenzyme API-A were obtained, using the hanging drop vapor diffusion method. Moreover, a complete set of X-ray diffraction data was collected up to a resolution of 3.10 Å, using a diamond-shaped crystal whose space group was determined to be P1. These data will be important for understanding the function of API-A in biological systems.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / Selon l’université Johns Hopkins, plus de 600 millions de cas de coronavirus 2019 (COVID - 19) infectés par le SRAS-CoV-2 ont été signalés dans le monde depuis décembre 2019. La COVID-19 a causé une catastrophe énorme dans le monde, tuant plus de six millions de personnes. Il est donc essentiel de trouver des médicaments ou des vaccins efficaces. L'ARN polymérase ARN - dépendante (RdRp) joue un rôle clé dans la réplication du virus SARS-CoV-2. Nous avons constaté que la RdRp du SRAS-CoV-2 présentait 98,1% de similitude avec la RdRp du SRAS-CoV, alors que la similitude génomique de virus n'était que de 80%. Les alignements de séquences des coronavirus ont montré une homologie plus élevée entre les RdRps (60% - 98%) et une homologie plus faible entre les protéines Spike (24% - 77%). Les structures 3D de la RdRp et de la nucléotide transférase (NiRAN) ont été rapidement déterminées par modélisation à partir des structures correspondantes du SRAS. Dans le nouveau coronavirus, trois substitutions apparaissent dans le motif RdRp, ainsi qu'une liaison hydrogène supplémentaire, mais la structure des régions des doigts et du pouce est légèrement modifiée. La structure NiRAN est très conservatrice dans le COV. Les homologies de séquence et de structure entre RdRp et NiRAN sont donc supposées être des cibles médicamenteuses potentielles pour le traitement du COV émergent. La protéase principale (Mpro), également connue sous le nom de protéase 3-chymotrypsine-like (protéase 3CL), joue un rôle important dans le clivage des polyprotéines virales pour former des complexes de réplication fonctionnelle. Mpro est donc une cible pharmaceutique prometteuse pour le traitement de la COVID-19. Grâce à la modélisation moléculaire, à l'amarrage et à la détermination de l'activité protéasique, nous avons trouvé quatre nouveaux inhibiteurs ciblant le Mpro avec une affinité de liaison révélée par la moitié de la concentration maximale inhibitrice (IC50) et des constantes de dissociation (KD). Nos nouveaux inhibiteurs CB-21, CB-25, CP-1 et LC24-20 ont des CI50s de 14,88 µM (IC à 95%: 10,35 µM à 20,48 µM), 22,74 µM (IC à 95%: 13,01 µM à 38,16 µM), 18,54 µM (IC à 95%: 6,54 µM à 36,30 µM) et 32,87 µM (IC à 95%: 18,37 µM à 54,80 µM), respectivement. L'évaluation des interactions a montré que chaque inhibiteur avait des liaisons hydrogène ou des interactions hydrophobes avec des résidus importants, y compris les résidus catalytiques les plus importants: his41 et Cys145. La dose létale à 50% (DL50) des quatre inhibiteurs est beaucoup plus élevée que celle de l'inhibiteur bien connu de la Mpro, GC376, ce qui indique une faible toxicité. Ces quatre inhibiteurs peuvent servir de médicaments potentiels pour d'autres études in vitro et in vivo contre la COVID-19. Dans l'ensemble, pour RdRp et Mpro, nos résultats fournissent des informations utiles pour la recherche et le traitement de la COVID-19. / According to the data from Johns Hopkins University, more than 600 million Coronavirus Virus Disease 2019 (COVID-19) cases infected by SARS-CoV-2 has been reported worldwide since December 2019. COVID-19 brought huge disaster to the world with more than 6 million death cases. Therefore, finding efficient drugs or vaccines is of vital importance. RNA-dependent-RNA-polymerase (RdRp) plays a key role in SARS-CoV-2 viral replication. We found that SARS-COV-2 RdRp shares 98.1% of similarity with SARS-CoV RdRp while the genome similarity is only 80%. Sequence alignment of coronaviruses demonstrated higher identity among RdRps (60% – 98%) and lower identity among Spike proteins (24% – 77%). The RdRp and nucleotide-transferase (NiRAN) 3D-structures were quickly determined by modelling starting from the SARS counterpart structures. In COVID-19, three substitutions appeared in RdRp motifs with an additional hydrogen-bonding, but slight structural change shown in the finger and thumb domains. The NiRAN structure is well conserved in CoV. The sequence and structural homology among RdRp and NiRAN thus postulate them as potential drug targets to treat emerging CoVs. Main protease (Mpro), also called 3-chymotrypsin-like protease (3CL protease), plays an essential role in cleaving virus polyproteins for the functional replication complex. Therefore, Mpro is a promising drug target for COVID-19 therapy. Through molecular modelling, docking and a protease activity assay, we found four novel inhibitors targeting Mpro with the half maximal inhibitory concentration (IC50) and their binding affinities shown by the dissociation constants (KDs). Our new inhibitors CB-21, CB-25, CP-1 and LC24-20 have IC50s at 14.88 µM (95% Confidence Interval (95% CI): 10.35 µM to 20.48 µM), 22.74 µM (95% CI: 13.01 µM to 38.16 µM), 18.54µM (95% CI: 6.54 µM to 36.30 µM) and 32.87µM (95% CI: 18.37 µM to 54.80 µM)), respectively. The evaluation of interactions suggested that each inhibitor has a hydrogen bond or hydrophobic interactions with important residues, including the most essential catalytic residues: His41 and Cys145. All the r inhibitors have a much higher 50% lethal dose (LD50) compared with the wellknown Mpro inhibitor GC376, demonstrating its low toxicity. These four inhibitors can be potential drug candidates for further in vitro and in vivo studies against COVID-19.Overall, targeting RdRp and Mpro, our findings provide useful information for the research and treatment of COVID-19.

La présente étude avait pour but d'étudier la HE4 humaine, une protéine faisant partie de la famille des protéines à motif Whey Acidic Protein (WAP) et normalement retrouvée dans différents tissus incluant le poumon, et n'ayant aucune fonction connue, afin d'établir son rôle physiologique. Pour ce faire, la HE4 a été comparée à la pré-élafine et au Secretory leucocyte proteinase inhibitor (SLPI), deux protéines structuralement semblables à la HE4 et ayant des activités anti-protéolytique, anti-inflammatoire, anti-microbienne et une implication dans le contrôle de la prolifération cellulaire. Les résultats obtenus démontrent que, si la HE4 est un inhibiteur de protéases, son profil d'inhibition est différent de celui du SLPI et de la pré-élafine, et que HE4 n'a aucun effet sur la production de cytokines pro-inflammatoires de base et induite par des LPS chez des cellules épithéliales alvéolaires et bronchiques. Cependant, la HE4 semble posséder une fonction antiproliférative puisqu'elle induit une diminution dose dépendante de la prolifération cellulaire des mêmes lignées de cellules épithéliales pulmonaires.

De nombreuses études ont été publiées sur le potentiel des inhibiteurs de protéases en phytoprotection et les stratégies développées par les insectes herbivores pour éviter l'effet antidigestif de ces protéines. Le but du projet était de documenter plus à fond les mécanismes compensatoires mis en place chez les insectes en réponse à la diète ou aux inhibiteurs de protéases, en utilisant comme système d'étude des larves du doryphore de la pomme de terre (Leptinotarsa decemlineata) se nourrissant de différentes Solanacées ou de lignées transgéniques de pomme de terre (Solanum tuberosum) exprimant différents variants d'un inhibiteur de protéases, la cystatine de tomate SlCYS8, générés par mutagénèse dirigée. Des bioessais ont été réalisés pour étudier l'impact de la diète sur la croissance, la consommation foliaire et l'abondance des protéases digestives sécrétées par l'insecte. D'autres bioessais ont été réalisés pour étudier l'impact des variants SlCYS8, administrés ex planta sur feuilles de pomme de terre ou in planta par voie transgénique. Les insectes étaient comparés à l'aide d'indicateurs macroscopiques (prise de poids, consommation foliaire) et biochimiques (protéases digestives, protéome digestif). Des analyses protéomiques étaient notamment réalisées pour estimer l'impact global de la diète sur les protéases digestives de l'insecte et identifier les protéases sensibles aux variants cystatine à l'étude. Ce projet aura contribué, dans l'ensemble, à une meilleure compréhension des mécanismes de compensation digestive chez les insectes herbivores. Il aura aussi permis de confirmer le potentiel des approches courantes du génie des protéines pour une amélioration rationnelle des inhibiteurs de protéases à des fins de phytoprotection.

Au cours des dernières années, les plantes ont émergé comme une plateforme de choix pour la production de protéines recombinantes d'intérêt pharmaceutique ou industriel. La moléculture n'est par contre pas exempte de difficultés alors que les protéines hétérologues rencontrent souvent, par exemple, des problèmes de dégradation causés par les protéases endogènes, avec un impact direct sur le rendement et la qualité du produit. Pour répondre à cette problématique, nous avons exprimé des inhibiteurs de protéases hétérologues dans le but de moduler in vivo l'activité protéolytique des plantes et ainsi permettre une protection de protéines recombinantes coexprimées. Afin d'évaluer sur une base globale le potentiel des inhibiteurs de protéases en moléculture, ces expériences furent réalisées avec différents systèmes d'expression et à différents endroits dans la cellule. La transformation de plants de pommes de terre (Solanum tuberosum) avec l'inhibiteur de cathepsine D de tomate (SICDI) ciblé dans le cytosol a provoqué une augmentation marquée du contenu en protéines foliaires associée à une hausse générale de la majorité des protéines endogènes. L'expression de cet inhibiteur à large spectre a par ailleurs permis la protection d'une protéine d'intérêt médical, l' alpha-l-antichymotrypsine humaine, exprimée de façon transitoire dans le cytosol des feuilles d'une lignée transgénique, illustrant le potentiel de la plateforme pour ce compartiment de la cellule. Puisque de nombreuses protéines nécessitent des modifications post-traductionnelles complexes qui ont lieu dans le système de sécrétion, il apparaissait par la suite pertinent de vérifier l'effet des inhibiteurs de protéases dans ce dernier compartiment. Cette évaluation fut réalisée à l'aide d'un système d'expression transitoire par agroinfiltration chez Nicotiana benthamiana. La plateforme étant encore peu caractérisée, une attention particulière ad' abord été accordée aux réactions de la plante au cours du processus d'infiltration, résultant en l'élaboration d'une carte protéomique de l' apoplaste foliaire de N. benthamiana. La coexpression de deux inhibiteurs de protéases dans le système de sécrétion de N. benthamiana, soit SICDI et la cystatine 9 de tomate, avec l'anticorps d'intérêt médical C5-1 a par ailleurs permis une augmentation du rendement de l'anticorps, confirmant l'utilité des inhibiteurs de protéases dans la protection des protéines recombinantes sécrétées.

La moléculture végétale est une alternative abordable et sécuritaire pour la production de protéines recombinantes d’intérêt clinique. Cependant, ces protéines sont souvent sujettes à la dégradation par les protéases endogènes dans les cellules végétales. Plusieurs stratégies ont été mises en place pour contrer ce phénomène, incluant notamment la co-expression d’inhibiteurs de protéases compagnons. Peu de données ont décrit toutefois comment la physiologie de la plante hôte, associée en particulier à son développement, a un impact sur l’expression et la protection d’une protéine d’intérêt. Dans ce projet, nous avons évalué les activités de protéases de types cystéine et aspartate dans des feuilles agroinfiltrées de la plante hôte Nicotiana benthamiana, en fonction de leur stade de développement. Nous démontrons que l’expression de l’inhibiteur SlCYS8 de tomate, actif contre les protéases de type cystéine, permet d’augmenter d’environ 40% le rendement en anticorps monoclonal C5-1, notre protéine modèle, dans les feuilles jeunes et matures où les activités protéolytiques sont moindres. Ces résultats prometteurs sur le plan appliqué font ressortir, en revanche, la complexité des processus biochimiques en cause et la pertinence de développer des stratégies complémentaires pour augmenter les teneurs en protéine recombinante. Dans cette optique, une nouvelle approche basée sur une diversion dirigée du métabolisme de défense de la plante hôte a été explorée. Nous démontrons qu’une activation du sentier de l’acide jasmonique induit dans les feuilles la production de protéines de stress, incluant des inhibiteurs de protéases de classes fonctionnelles variées; et une diminution de la teneur en RuBisCO, un contaminant majeur pendant la purification des protéines recombinantes. Sur cette base, nous avons adjoint à notre procédure de transfection un prétraitement des plantes au jasmonate de méthyle, une forme volatile de l’acide jasmonique. Ce prétraitement a permis d’une part de réduire considérablement les teneurs en RuBisCO dans les feuilles, et de doubler d’autre part le taux d’expression et le rendement en anticorps C5-1. Nos données appuient l’utilité éventuelle d’une manipulation du métabolisme de défense sur les rendements en protéine recombinante, complémentaire aux approches basées sur la co-expression d’inhibiteurs de protéases recombinants. / Plant molecular farming is an affordable and safe alternative to conventional expression animal and microbial systems for the production of clinically-useful recombinant proteins. However, these proteins are often susceptible to degradation by endogenous proteases of the host plant cells. Several strategies have been described to counter degradation processes including the co-expression of companion protease inhibitors. Few data, however, were available describing how the host plant’s physiology, especially its developmental stage, could impact the expression and protection of a clinically useful heterologous protein. In this study, we assessed changes in the activity of cysteine and aspartate proteases in the widely adopted expression host Nicotiana benthamiana, as a function of leaf age. We demonstrate that the expression of a tomato cysteine protease inhibitor, SlCYS8, allows to increase by nearly 40% the total yield of a model protein, the blood-typing C5-1 monoclonal antibody, in young and mature leaves where proteolytic activities are lower. Our results, while promising in practice, highlighted on the other hand the complexity of biochemical processes involved and the relevance of developing additional strategies to boost recombinant protein accumulation in planta. Towards this end, a new approach based on a deliberate diversion of the host plant defense metabolism was explored. We show that an activation of the jasmonic acid pathway in leaves induces the production of stress-related proteins, including protease inhibitors of various functional classes; and a significant decrease in the content of RuBisCO, a major contaminant during the purification of recombinant proteins. Based on this we included in our transfection procedure a pretreatment of plants with methyl jasmonate, a volatile form of jasmonic acid. This pretreatment significantly reduced RuBisCO levels in leaves, concomitant with a more than twofold increase of C5-1 yield in mature leaves. Our data highlight, overall, the potential of manipulating the host plant’s defense metabolism to increase heterologous protein yields, in complement to current protein protection strategies involving the co-expression of recombinant protease inhibitors.

Riches en protéines et énergie, les larves de mouches soldats noires (MSN, Hermetia illucens) démontrent un fort potentiel comme aliments alternatifs pour l'industrie aquacole. Toutefois, la présence de facteurs antinutritionnels (ex. anti-protéases) pourrait limiter l'inclusion des farines de larves de MSN chez les salmonidés, notamment, la truite arc-en-ciel (Oncorynchus mykiss), une espèce importante pour l’industrie aquacole québécoise. Des traitements thermiques généralement utilisés pour réduire la charge bactérienne et permettre l’entreposage prolongés sont proposés pour désactiver les facteurs anti-protéolytiques et augmenter la digestibilité des nutriments présent dans la farine de MSN. Ainsi, cette étude propose la comparaison de différents traitements thermiques (séchées au four à 60°C pendant 12h (LB); ébouillantées (100°C) et séchées au four à 60°C pendant 6h (LE); séchées au four à 130°C pendant 2 h (LS) sur 1) la réduction de l'activité anti-protéolytique in vitro des farines de larves de 5, 10, 15 jours post-éclosion traités avec des extraits d’enzymes digestives de truites arc-en-ciel juvéniles et 2) la digestibilité des nutriments in vivo des farines de larves de 10 jours (stade de récolte commercial). Lors des essais in vitro, nous avons observé que l'activité anti-protéolytique des farines de MSN varie entre les différents stades larvaires (p<0,001) et est maximale chez les farines de larves de 10 jours post-éclosion (inhibition = 22,4 ± 3,7%). Lors des essais de digestibilité, les diètes ont été formulées en remplaçant 30% d’un régime de référence pour les salmonidés avec l’ajout de 1% d’un marqueur indigeste (SipernatTM50). Deux méthodes analytiques (cendres insolubles à l’acide (AIA) et fluorescence X à dispersion d’énergie (EDXFR) ont été utilisées et comparées pour doser le marqueur indigeste et déterminer les coefficients de digestibilité apparente (CDA). De plus, des traitements thermiques ≥ 100°C (LE et LS) permettent d’inhiber complètement l’activité anti-protéolytique. Une plus grande variabilité dans l’estimation des CDA des différents nutriments ainsi que la mise en évidence de valeur CDA inférieurs ont été obtenues par la méthode AIA que par la méthode EDXFR. Quel que soit le procédé de transformation (LB. LE et LS) aucune différence significative n’a été observée avec les protéines réelles, lipides bruts, matière sèche. Les larves stérilisées (LS) ont obtenu des CDA inférieurs aux deux autres traitements (LB et LE) pour l’acide gras C16 :1 et l’acide aspartique, et la lysine. De plus l’acide glutamique s’est montré plus digeste avec les larves ébouillantées (LE) que les deux autres traitements (LB et LS). Les acides gras C12, C17 :0 des farines brutes se sont avérés moins digestes que ceux des farines ébouillantées (LE) et stérilisées (LS). Les minéraux tels que : le phosphore, le calcium se n’ont pas été digérés quel que soit le procédé de transformation, alors que le fer n’a pas été digéré pour les traitements LB et LS. Et le zinc s’est montré plus digeste avec les traitements LB et LS. Malgré les traitements la chitine reste une composante qui n’a pas été digéré chez la truite arc-en-ciel. Compte tenu de l’absence d’études de digestibilité dans la littérature, les résultats obtenus par fluorescence X à dispersion d’énergie (EDXRF) n’ont pas pu être été discutés. Toutefois, c’est une méthode qui a montré moins de variabilités entre les données plus rapide et potentiellement plus précise qui permet de déterminer le silicium, mais aussi d’autres minéraux dans les échantillons tels que le phosphore, calcium, zinc et fer. Et les digestibilités obtenues avec les différents traitements proposés se sont montrés plus efficaces que la méthode standard (AIA). / Rich in protein and energy, black soldier fly larvae (BSF, Hermetia illucens) have a great potential as alternative feed ingredients for the aquaculture industry. However, the presence of antinutritional factors (e.g. antiproteases) could limit the inclusion of insect larvae meals for salmonids, including those for rainbow trout, an important species for the Quebec aquaculture industry. Heat treatments usually used to reduce the bacterial load to allow prolonged storage, could also deactivate antiproteases and increase the protein digestibility. The objective of this study was to compare different heat treatments (oven-dried at 60 °C for 12h (LB); scalded (4 minutes in 100°C water) and oven-dried at 60 °C for 6h (LE); ovendried at 130 °C for 2h (LS) on: 1) the inhibition of the anti-proteolytic activity in vitro of meal from larvae grown to 5, 10, 15 days post-hatching using digestive enzymes extracts of juvenile rainbow trout and 2) the digestibility of nutrients in vivo from 10-day larvae meal (standard commercial harvest age). In in vitro evaluations, we observed that the anti-proteolytic activity of BSF meals varies between the different larval stages (p <0.001) and is maximal in meals from 10-day posthatching BSF (inhibition = 22,4 ± 3.7%). In digestibility tests, the diets were formulated by replacing 30% of a reference diet for salmonids with the addition of 1% of an indigestible marker (Sipernat50™). Two analytical methods (acid-insoluble ash (AIA) and energy dispersive X-ray fluorescence (EDXFR)) were used and compared quantification of the indigestible marker and determine the coefficients of apparent digestibility (CDA). In addition, heat treatments ≥ 100 ° C (LE and LS) completely inhibited the antiprotease activity. Greater variability in the estimation of CDA of the various nutrients as well as the demonstration of lower CDA values were obtained by the AIA method than by the EDXFR method. Irrespective of processing method (LB, LE and LS) no significant difference was observed for proteins, crude lipids, dry matter. The sterilized larvae (LS treatment) demonstrated lower CDAs than the other processing treatments (LB and LE) for C16: 1 fatty acid, aspartic acid, and lysine. In addition, glutamic acid was more digestible with scalded larvae (LE) versus the other two treatments (LB and LS). Also, the fatty acids C12, C17: 0 of raw insect meals were less digestible than those of scalded and sterilized meals. Minerals including phosphorus and calcium were indigestible irrespective of the processing treatment; Iron was indigestible for LB and LS treatments, whereas zinc was more digestible with LB and LS treatments. Under all processing methods, chitin remained indigestible. Despite the absence of digestibility studies in the literature, employing EDXRF to measure external digestibility markers, this approach is a chemical free, faster and potentially more accurate method for determining silicon, but also other minerals in samples such as phosphorus, calcium, zinc and iron. The digestibilities obtained with the different treatments were higher using the EDXRF method versus the standard method measuring AIA. Ultimately, this work should enable insect producers and aquafeed manufacturers meet the specific nutritional of aquaculture species.

La maladie d'Alzheimer (AD) est un désordre neurodégénératif progressif et la forme la plus commune de démence. A l’heure actuelle, il n'y a aucun remède et la maladie est toujours fatale. Une des caractéristiques histopathologiques de l'AD est la présence de dépôts protéiques, les plaques amyloïdes, dans le cerveau. Ces plaques sont formées par les peptides amyloïdes β (Aβ) de 40 et 42 résidus, qui sont les produits de clivage par des protéases de la protéine précurseur de l’amyloïde (l'APP). L'élucidation de certains des processus clés dans la cause et le développement de l'AD est une étape cruciale pour le développement de traitements nouveaux et efficaces.<p><p>Les propriétés conformationnelles du segment transmembranaire (TM) de l’APP peuvent affecter sa protéolyse par la γ-sécrétase. Ces propriétés ne sont pas encore clairement établies. Afin de comprendre le rôle des variations structurelles du TM dans le traitement de l'APP, des détails structurels des peptides APP_TM4K, chimiquement synthétisés, ont été étudiés dans la bicouche lipidique en utilisant la réflexion totale atténuée par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (ATR-FTIR) et la résonance magnétique nucléaire à l’état solide (ssNMR). Tandis que la structure secondaire globale du peptide APP_TM4K est hélicoidale, une hétérogénéité conformationnelle et orientée a été observée pour le site de clivage γ et, dans une plus faible mesure, pour le site de clivage ζ. Ces variabilités conformationnelles autour des sites de clivage γ et ζ peuvent avoir des implications importantes dans le mécanisme de clivage et donc dans la production d’Aβ. Il a été aussi démontré que la dernière glycine dans le motif de dimérisation GxxxG est transmembranaire. Ceci peut impliquer que la dimérisation via ce motif pourrait servir d’ancrage et conférer une orientation transmembranaire stable au segment transmembranaire de l’APP.<p><p>Le peptide amyloïde β est directement lié à la maladie d’Alzheimer. Partant de sa forme monomérique, l’Aβ s'agrège pour produire en final des fibrilles et aussi de manière transitoire toute une gamme d'oligomères, ces derniers étant la plupart neurotoxiques. Une dérégulation de l’homéostasie du Ca2+ dans le cerveau vieillissant et dans des troubles neurodégénératifs joue un rôle crucial dans de nombreux processus et contribue au dysfonctionnement et à la mort cellulaire. Nous avons postulé que le calcium peut permettre ou accélérer l'accumulation d'Aβ. Le modèle d'accumulation d'Aβ (1-40) et celui d'Aβ (1-40) E22G, un peptide amyloïde portant la mutation arctique qui cause une apparition prématurée de la maladie, ont été comparé. Nous avons constaté qu'en présence de Ca2+, l’Aβ (1-40) forme de préférence des oligomères semblables à ceux formés par l’Aβ (1-40) E22G avec ou sans Ca2+, tandis qu'en absence de Ca2+ l'Aβ (1-40) s’agrège sous forme de fibrilles. Les ressemblances morphologiques entre oligomères ont été confirmées par microscopie de force atomique. La distribution des oligomères et des fibrilles dans des échantillons différents a été détectée par électrophorèse sur gel suivie d’une analyse par Western blot, dont les résultats ont été confirmés par des expériences de fluorescence à la thioflavine T. Dans les échantillons sans Ca2+, l’ATR-FTIR révèle la conversion des oligomères en feuillets β antiparallèles en la conformation caractéristique des fibrilles en feuillets β parallèles. En général, ces résultats nous ont ameré à conclure que les ions calcium stimulent la formation d'oligomères d'Aβ (1-40), qui sont impliqués dans la pathogénèse d'AD.<p><p>Malgré les progrès énormes obtenus dans la compréhension de la maladie (AD), il reste un défi majeur, celui du développement de médicaments nouveaux et efficaces. Afin d’obtenir des éclaircissements sur le mécanisme d'action de deux nouveaux puissants modulateurs de la γ-sécrétase - le benzyl-carprofen et le sulfonyl-carprofen dans la bicouche lipidique, la technique de RMN à l’état solide a été employée. Précédemment, les dérivés du carprofen ont été localisés dans des membranes de lipides par des expériences de diffusion (scattering) des neutrons. Les contraintes déterminées à partir des expériences de ssNMR ont permis d’affiner leurs positions et d’obtenir une orientation précise dans la double couche lipidique. Ces résultats combinés indiquent que le mécanisme probable de modulation du clivage par la γ-sécrétase est une interaction directe des carprofènes avec le domaine TM de l’APP. Une telle interaction, empêcherait à la formation de dimères d'APP, dimérisation nécessaire au clivage séquentiel par la γ-sécrétase, diminuant ou réduisant ainsi énormément la production d’Aβ, tout particulièrement d’Aβ42.<p><p>Les résultats de ce travail apporte de nouvelles informations sur les processus clés impliqués dans l'AD; Production de l'Aβ à partir de l'APP, formation des oligomères d'Aβ et mécanisme d'action potentiel de molécules thérapeutiques. Nous pensons que ces résultats pourront permettre une meilleure compréhension de la maladie et pourront aider dans la conception de nouveaux médicaments contre cette maladie.<p><p>Alzheimer’s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder and the most common form of dementia. There is no cure and the disease is fatal. One of the characteristic histopathological markers of AD is the presence of proteinaceous deposits, amyloid plaques, in the brain. These plaques are formed by the amyloid β-peptides (Aβ) 40- and 42-residue-long, which are protease cleavage products of the amyloid precursor protein (APP). Elucidation of some of the key processes in the cause and the development of AD is crucial for the development of new and efficient treatments.<p><p>Conformational properties of the transmembrane (TM) segment of APP may affect its proteolytic processing by γ-secretase. These properties have not been definitely established. In addressing the role of structural variations of the TM sequence in APP processing, structural details of the chemically synthesized APP_TM4K peptides within the membrane bilayers were studied using Attenuated total reflection Fourier transform spectroscopy (ATR-FTIR) and solid-state nuclear magnetic resonance (ssNMR) techniques. While the overall secondary structure of the APP_TM4K peptide is an α-helix, conformational and orientational heterogeneity was observed for the γ-cleavage site and, to a smaller extent, for the ζ-cleavage site. Evidence for the conformational variability around γ- and ζ-cleavage sites may have important implications for the cleavage mechanism and hence for the Aβ production. It was also found that the last glycine within the sequence of GxxxG motifs is in the transmembrane orientation, implying that dimerization via these motifs may act as an anchor, confining the TM dimer to the stable transmembrane orientation. <p><p>Amyloid β-peptide is directly linked to AD. Starting from its monomeric form, Aβ aggregates into fibrils and / or oligomers, the latter being the most neurotoxic. Dysregulation of Ca2+ homeostasis in aging brains and in neurodegenerative disorders plays a crucial role in numerous processes and contributes to cell dysfunction and death. Here we postulated that calcium may enable or accelerate the aggregation of Aβ. The aggregation pattern of Aβ(1-40) and of Aβ(1-40)E22G, an amyloid peptide carrying the Arctic mutation that causes early onset of the disease, were compared. We found that in the presence of Ca2+, Aβ(1-40) preferentially formed oligomers similar to those formed by Aβ(1-40)E22G with or without added Ca2+, whereas in the absence of added Ca2+ the Aβ(1-40) aggregated to form fibrils. Morphological similarities of the oligomers were confirmed by contact mode atomic force microscopy (AFM) imaging. The distribution of oligomeric and fibrillar species in different samples was detected by gel electrophoresis and Western blot analysis, the results which were further supported by thioflavin T fluorescence experiments. In the samples without Ca2+, Fourier transform infrared spectroscopy revealed conversion of oligomers from an anti-parallel β-sheet to the parallel β-sheet conformation characteristic of fibrils. Overall, these results led us to conclude that calcium ions stimulate the formation of oligomers of Aβ(1-40), that have been implicated in the pathogenesis of AD. <p><p>Despite the tremendous progress in understanding AD, there remains the challenge of the development of new and efficient drugs. In order to shed light onto the mechanism of action of two new potent γ-secretase modulators -- benzyl-carprofen and sulfonyl-carprofen within lipid bilayers, ssNMR technique was employed. Using neutron scattering experiments it was previously found that sulfonyl-carprofen and benzyl-carprofen partition into the headgroup region of the lipid bilayer. The orientational constraints derived from the ssNMR experiments refined their position into precise orientation. Combined, these results indicate that carprofen-derivatives can directly interact with the region of APP that mediates dimerization. Such interaction, would interfere with proper APP-dimer formation, which is necessary for the sequential cleavage by γ-secretase, diminishing or greatly reducing Aβ42 production.<p><p>Results obtained during this work shed new light onto some of the key processes in AD: Aβ production from APP, formation of Aβ oligomers and insights into the mechanism of action of potential therapeutics. We believe that these results will promote a better understanding of the disease and will help in future drug design.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished