Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 74-87. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Plusieurs études ont discuté du potentiel des cystatines en protection des plantes contre les insectes phytophages nuisibles. Ces protéines s'accumulent dans les tissus végétaux soumis à l'herbivorie, où elles exercent leurs fonctions protectrices en réprimant l'activité des protéases sécrétées dans le tube digestif de l'ennemi herbivore. Lorsque retrouvées en abondance dans la plante, les cystatines montrent un effet de protection mesurable, fonction de leur efficacité à interagir avec les protéases digestives de l'insecte. Dans le cas d'une forte inhibition, un déséquilibre fonctionnel est engendré, qui provoque un blocage de la digestion des protéines et une carence nutritionnelle menant à des troubles de développement. Un long processus coévolutif entre la plante et ses ennemis herbivores a mené toutefois à des adaptations métaboliques chez l'insecte en réponse aux inhibiteurs de protéases, qui lui permettent souvent d'éviter l'effet négatif des inhibiteurs ingérés. Pour cette raison, un grand intérêt a été porté au fil des ans à l'amélioration des qualités fonctionnelles des inhibiteurs de protéases par différentes approches du génie des protéines. Plusieurs chercheurs se sont intéressé, en particulier, au cas du doryphore de la pomme de terre (Leptinotarsa decemlineata Say), un insecte ravageur d'importance majeure dans les cultures de pommes de terre à travers le monde. Dans l'optique d'améliorer l'efficacité des cystatines contre les protéases digestives du doryphore, ce projet de thèse avait pour objectif d'explorer le potentiel d'une nouvelle approche du génie des protéines, le design par substitution de boucles' (de l'anglais Loop Replacement Design, ou LRD), pour en générer des variants à efficacité améliorée contre les protéases digestives de l'insecte cible. Un survol de la diversité fonctionnelle des cystatines végétales répertoriées dans la banque génomique GenBank a d'abord été réalisé pour identifier des cystatines candidates à capacités inhibitrices variées, à partir desquelles devaient ensuite être puisés les éléments fonctionnels pour le design des inhibiteurs hybrides. Les éléments fonctionnels sélectionnés ont été 'greffés' sur une cystatine modèle à potentiel inhibiteur modéré, la cystatine de tomate SlCYS8, pour la confection des cystatines hybrides à boucles substituées. Plus spécifiquement, des tests enzymatiques en laboratoire ont permis de confirmer le potentiel de l'approche LRD pour le design de cystatines améliorées. En bref, nos résultats ont démontré une amélioration significative du potentiel inhibiteur de la cystatine SlCYS8 modifiée de manière à inclure les sous-régions fonctionnelles de cystatines à plus fort potentiel inhibiteur, ils ont démontré, à l'inverse, un coût fonctionnel mesurable dans le cas des inhibiteurs hybrides intégrant les régions fonctionnelles de cystatines moins efficaces. Ces résultats confirmaient l'intérêt de l'approche LRD pour le développement de cystatines améliorées contre les protéases digestives d'un insecte nuisible et mettaient en relief, sur le plan biochimique, un découplage fonctionnel des différents éléments structuraux de ces protéines. À la lumière de ces conclusions et en complément au premier volet du projet, un deuxième volet a consisté à déterminer l'influence de la partie restante, ou « charpente » (de l'anglais : scaffold), des cystatines sur leur activité inhibitrice. Pour ce faire, les éléments fonctionnels de la cystatine SlCYS8 ont été greffés aux charpentes structurales d'autres cystatines. L'activité inhibitrice des hybrides générés a été évaluée ensuite pour déterminer si cet élément structural, qui n'est pas un élément fonctionnel à proprement parler, influençait l'activité de l'inhibiteur. En bref, nos données ont montré une influence marquée de la charpente des cystatines sur leur potentiel inhibiteur et la pertinence de considérer cet élément structural comme un « élément fonctionnel secondaire » dans toute stratégie d'ingénierie moléculaire des cystatines à des fins de phytoprotection. En somme, ce projet de thèse aura permis d'établir le potentiel d'une approche LRD pour la production de cystatines hybrides à forte activité inhibitrice contre les protéases digestives du doryphore de la pomme de terre. Nos travaux auront permis aussi de mettre en évidence l'influence, sur le plan fonctionnel, de la charpente protéique des cystatines, un élément structural négligé jusqu'ici dans le design de variants améliorés de ces protéines. Des travaux complémentaires seront maintenant bienvenus pour déterminer le potentiel protecteur des nouveaux hybrides exprimés in planta. Des travaux seront utiles également pour mesurer leur potentiel comme partenaires de fusions traductionnelles, une approche complémentaire aux stratégies actuelles de mutagénèse pour le design d'inhibiteurs de protéases hybrides à spectre d'action étendu.

Pour assurer leur survie, les plantes ont développé au cours du temps une gamme de mécanismes de défense leur offrant une protection contre plusieurs organismes herbivores. Un de ces moyens de défense consiste à produire des inhibiteurs de protéases de classes variées, incluant les cystatines, actives contre les protéases digestives de type cystéine utilisées par plusieurs herbivores (Haq et al, 2004). Chez les plantes, les cystatines sont impliquées dans plusieurs processus importants incluant l'organogenèse, la mort cellulaire programmée, le recyclage des protéines de réserve et la défense directe contre les insectes herbivores (Arai et al, 2002; Belenghi et al, 2003). Des travaux récents réalisés dans notre laboratoire ont permis de détecter au niveau moléculaire des événements de sélection positive documentant l'évolution des cystatines végétales (Kiggundu et al, 2006). Les données obtenues indiquaient que des mutations survenant à certains sites des gènes cystatine pourraient permettre de générer une grande variabilité fonctionnelle utile pour l'inhibition des protéases digestives des herbivores. D'un point de vue biologique, l'existence de ces régions hypervariables chez les cystatines serait vraisemblablement un processus clé expliquant l'évolution adaptative de ces protéines au cours du processus de coévolution entre la plante hôte et ses ennemis herbivores (Rausher, 2001). Dans le cadre de ce travail, nous avons formulé une première hypothèse selon laquelle l'existence de régions hypervariables chez les cystatines végétales, expliquée par un processus de sélection positive, favorise la génération de diversité fonctionnelle contre les protéases de type cystéine. En complément, nous avons aussi posé l'hypothèse selon laquelle cette diversité fonctionnelle pourrait permettre la génération d'inhibiteurs de protéases à la fois plus efficaces contre les protéases digestives des insectes et moins actifs contre les protéases endogènes de la plante. Des variants cystatine mutés à des sites hypervariables ont été développés en utilisant comme modèle la 8'^ unité de la multicystatine de tomate, S'/CYSS. La multicystatine de tomate, d'une masse moléculaire de 88 kDa, comprend huit unités fonctionnelles pouvant lier la papaïne, une protéase modèle de type cystéine (Wu and Haard, 2000). Pour nos travaux, trois codons identifiés statistiquement comme étant soumis à la sélection positive et deux codons soumis à la sélection neutre ont été soumis à la mutagenèse dirigée. Les variants correspondants ont été ensuite exprimés chez E. coli et purifiés à l'aide du système d'expression glutathione S-transférase (Michaud et al, 1994). Leur activité inhibitrice a été mesurée par fluorimétrie contre différentes protéases modèles de type cystéine d'intérêt médical, industriel ou agricole. Le potentiel d'inhibition des variants iS/CYS8 a aussi été testé par fluorimétrie contre les protéases endogènes de la pomme de terre et les protéases digestives de larves de doryphores de pomme de terre. Ce ravageur important en agriculture utilise une panoplie de protéases digestives, certaines sensibles, d'autres insensibles aux cystatines végétales. En bref, l'analyse des différents variants 5/CYS8 a permis de confirmer que l'existence de sites hypervariables chez les cystatines était corrélée à une diversification fonctionnelle de ces inhibiteurs contre les protéases modèles étudiées. Nos analyses ont aussi permis de mettre en évidence certaines contraintes pour la sélection positive, liées notamment aux altérations structurales et chimiques créées par certaines mutations. Suite aux résultats obtenus dans la première partie du projet, nous avons voulu vérifier si cette variabilité fonctionnelle pouvait s'appliquer à un système biologique d'intérêt agronomique, en l'occurrence, l'interaction doryphore/pomme de terre. En combinant les résultats des différents tests effectués, nous avons pu confirmer que certains inhibiteurs montraient effectivement une activité accrue contre les protéases de l'insecte tout en montrant une activité diminuée contre les protéases endogènes de la plante. Cette nouvelle stratégie d'amélioration moléculaire, combinée à d'autres stratégies comme la confection d'inhibiteurs de protéases hybrides, pourrait s'avérer très prometteuse dans les années à venir pour le développement d'outils utiles en phytoprotection. D'une manière plus générale, la variabilité fonctionnelle générée par mutagenèse des cystatines à des sites soumis à la sélection positive confirme l'utilité possible de modèles évolutifs statistiques pour l'amélioration dirigée des protéines de défense.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdorales, 2015-2016 / Des cystatines recombinantes employées en phytoprotection dans des variétés végétales transgéniques ont été étudiées pour les effets d’interférence métabolique qu’elles causaient dans la plante hôte. L’objectif de ce projet était d’évaluer ces effets pléiotropiques à l’aide de lignées de pommes de terre (Solanum tuberosum) exprimant des cystatines de céréales de façon constitutive dans l’ensemble des tissus de la plante. Nos résultats ont montré que la cystatine du maïs CCII induit, dans les feuilles, une activation de protéines endogènes reliées au stress, conférant notamment un effet protecteur contre le champignon Botrytis cinerea. La cystatine du riz OCI, exprimée dans les tubercules transgéniques, a engendré un délai de leur germination et une préservation des principaux nutriments en période d’entreposage. En somme, nos lignées de pommes de terre exprimant une cystatine recombinante démontrent des effets d’interférence métabolique à valeur agronomique éventuellement intéressante.

De nombreuses études ont été publiées sur le potentiel des inhibiteurs de protéases en phytoprotection et les stratégies développées par les insectes herbivores pour éviter l'effet antidigestif de ces protéines. Le but du projet était de documenter plus à fond les mécanismes compensatoires mis en place chez les insectes en réponse à la diète ou aux inhibiteurs de protéases, en utilisant comme système d'étude des larves du doryphore de la pomme de terre (Leptinotarsa decemlineata) se nourrissant de différentes Solanacées ou de lignées transgéniques de pomme de terre (Solanum tuberosum) exprimant différents variants d'un inhibiteur de protéases, la cystatine de tomate SlCYS8, générés par mutagénèse dirigée. Des bioessais ont été réalisés pour étudier l'impact de la diète sur la croissance, la consommation foliaire et l'abondance des protéases digestives sécrétées par l'insecte. D'autres bioessais ont été réalisés pour étudier l'impact des variants SlCYS8, administrés ex planta sur feuilles de pomme de terre ou in planta par voie transgénique. Les insectes étaient comparés à l'aide d'indicateurs macroscopiques (prise de poids, consommation foliaire) et biochimiques (protéases digestives, protéome digestif). Des analyses protéomiques étaient notamment réalisées pour estimer l'impact global de la diète sur les protéases digestives de l'insecte et identifier les protéases sensibles aux variants cystatine à l'étude. Ce projet aura contribué, dans l'ensemble, à une meilleure compréhension des mécanismes de compensation digestive chez les insectes herbivores. Il aura aussi permis de confirmer le potentiel des approches courantes du génie des protéines pour une amélioration rationnelle des inhibiteurs de protéases à des fins de phytoprotection.