Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le maintien de la stabilité du génome est essentiel pour la propagation de l’information génétique et pour la croissance et la survie des cellules. Tous les organismes possèdent des systèmes de prévention des dommages et des réarrangements de l’ADN et nos connaissances sur ces processus découlent principalement de l’étude des génomes bactériens et nucléaires. Comparativement peu de choses sont connues sur les systèmes de protection des génomes d’organelles. Cette étude révèle l’importance des protéines liant l’ADN simple-brin de la famille Whirly dans le maintien de la stabilité du génome des organelles de plantes. Nous rapportons que les Whirlies sont requis pour la stabilité du génome plastidique chez Arabidopsis thaliana et Zea mays. L’absence des Whirlies plastidiques favorise une accumulation de molécules rearrangées produites par recombinaison non-homologue médiée par des régions de microhomologie. Ce mécanisme est similaire au “microhomology-mediated break-induced replication” (MMBIR) retrouvé chez les bactéries, la levure et l’humain. Nous montrons également que les organelles de plantes peuvent réparer les bris double-brin en utilisant une voie semblable au MMBIR. La délétion de différents membres de la famille Whirly entraîne une accumulation importante de réarrangements dans le génome des organelles suite à l’induction de bris double-brin. Ces résultats indiquent que les Whirlies sont aussi importants pour la réparation fidèle des génomes d’organelles. En se basant sur des données biologiques et structurales, nous proposons un modèle où les Whirlies modulent la disponibilité de l’ADN simple-brin, régulant ainsi le choix des voies de réparation et permettant le maintien de la stabilité du génome des organelles. Les divers aspects de ce modèle seront testés au cours d’expériences futures ce qui mènera à une meilleure compréhension du maintien de la stabilité du génome des organelles. / Maintenance of genome stability is essential for the accurate propagation of genetic information and for cell growth and survival. Organisms have therefore developed efficient strategies to prevent DNA lesions and rearrangements. Much of the information concerning these strategies has been obtained through the study of bacterial and nuclear genomes. Comparatively little is known about how organelle genomes maintain a stable structure. This study implicates the single-stranded nucleic acid-binding proteins of the Whirly family in the maintenance of plant organelle genome stability. Here we report that the plastid-localized single-stranded DNA binding proteins of the Whirly family are required for plastid genome stability in Arabidopsis thaliana and Zea mays. Absence of plastidial Whirlies favors the accumulation of rearranged molecules that arise through a non-homologous recombination mechanism mediated by regions of microhomology. This mechanism is similar to the microhomology-mediated break-induced replication (MMBIR) described in bacteria, yeast and humans. Additionally we show that plant organelles can repair double-strand breaks using a MMBIR-like pathway. Plants lacking Whirly proteins accumulate elevated levels of microhomology-mediated DNA rearrangements upon double-strand break induction, indicating that Whirlies also contribute to the accurate repair of plant organelle genomes. Using biological and structural data, we propose a working model in which Whirlies modulate the access of repair proteins and complementary DNA to single-stranded regions, thereby regulating the choice of repair pathways and maintaining plant organelle genome stability. The various aspects of this model will be tested in future experiments which should allow a better understanding of the mechanisms underlying genome stability in plant organelles.

Comparativement au génome contenu dans le noyau de la cellule de plante, nos connaissances des génomes des deux organelles de cette cellule, soit le plastide et la mitochondrie, sont encore très limitées. En effet, un nombre très restreint de facteurs impliqués dans la réplication et la réparation de l’ADN de ces compartiments ont été identifiés à ce jour. Au cours de notre étude, nous avons démontré l’implication de la famille de protéines Whirly dans le maintien de la stabilité des génomes des organelles. Des plantes mutantes pour des gènes Whirly chez Arabidopsis thaliana et Zea mays montrent en effet une augmentation du nombre de molécules d’ADN réarrangées dans les plastides. Ces nouvelles molécules sont le résultat d’une forme de recombinaison illégitime nommée microhomology-mediated break-induced replication qui, en temps normal, se produit rarement dans le plastide. Chez un mutant d’Arabidopsis ne possédant plus de protéines Whirly dans les plastides, ces molécules d’ADN peuvent même être amplifiées jusqu’à cinquante fois par rapport au niveau de l’ADN sauvage et causer un phénotype de variégation. L’étude des mutants des gènes Whirly a mené à la mise au point d’un test de sensibilité à un antibiotique, la ciprofloxacine, qui cause des bris double brin spécifiquement au niveau de l’ADN des organelles. Le mutant d’Arabidopsis ne contenant plus de protéines Whirly dans les plastides est plus sensible à ce stress que la plante sauvage. L’agent chimique induit en effet une augmentation du nombre de réarrangements dans le génome du plastide. Bien qu’un autre mutant ne possédant plus de protéines Whirly dans les mitochondries ne soit pas plus sensible à la ciprofloxacine, on retrouve néanmoins plus de réarrangements dans son ADN mitochondrial que dans celui de la plante sauvage. Ces résultats suggèrent donc une implication pour les protéines Whirly dans la réparation des bris double brin de l’ADN des organelles de plantes. Notre étude de la stabilité des génomes des organelles a ensuite conduit à la famille des protéines homologues des polymérases de l’ADN de type I bactérienne. Plusieurs groupes ont en effet suggéré que ces enzymes étaient responsables de la synthèse de l’ADN dans les plastides et les mitochondries. Nous avons apporté la preuve génétique de ce lien grâce à des mutants des deux gènes PolI d’Arabidopsis, qui encodent des protéines hautement similaires. La mutation simultanée des deux gènes est létale et les simples mutants possèdent moins d’ADN dans les organelles des plantes en bas âge, confirmant leur implication dans la réplication de l’ADN. De plus, les mutants du gène PolIB, mais non ceux de PolIA, sont hypersensibles à la ciprofloxacine, suggérant une fonction dans la réparation des bris de l’ADN. En accord avec ce résultat, la mutation combinée du gène PolIB et des gènes des protéines Whirly du plastide produit des plantes avec un phénotype très sévère. En définitive, l’identification de deux nouveaux facteurs impliqués dans le métabolisme de l’ADN des organelles nous permet de proposer un modèle simple pour le maintien de ces deux génomes. / Compared to the nuclear genome, very little is known about the genomes of the two plant cytoplasmic organelles, the plastid and the mitochondria. Indeed, very few factors involved in either the replication or the repair of these genomes have been identified. Here we show the implication of the Whirly protein family in the maintenance of organellar DNA. Indeed, mutations in Whirly genes lead to DNA rearrangements in both Arabidopsis thaliana and Zea mays plastids. These rearrangements are the product of microhomology-mediated break-induced replication that rarely occurs in wild-type plants but increases in absence of Whirly proteins. In a mutant plant devoid of plastidial Whirly proteins, these new DNA molecules can be amplified up to fifty times the normal DNA level and cause a variegated phenotype. In the course of the study of the Whirly mutant plants, we developed a strategy, based on the use of the antibiotic ciprofloxacin, to induce DNA double-strand breaks specifically in plant organelles. The Arabidopsis mutant plants without Whirly proteins in the plastids are more sensitive to the antibiotic ciprofloxacin than wild-type plants. Accordingly, there is a much larger increase in the number of rearranged DNA molecules in the plastids of the mutant plants than in the control plants. Surprisingly, while the mutant plants devoid of Whirly proteins in the mitochondria do not show increased sensitivity to the drug, they do accumulate more rearrangements in their mitochondrial DNA compared to wild-type plants. These results suggest that the Whirly proteins are involved in the repair of DNA double-strand breaks in the plant organelle genomes. Our study of the plant organelle genome stability has lead us to a family of proteins homologous to the DNA polymerase I in bacteria. This family has been proposed to be responsible for most of the DNA-synthesis activity in the plant organelles. We bring genetic proof to support this hypothesis using mutants of the two PolI genes of Arabidopsis. The combined mutation of both genes is lethal and the single mutations cause a decrease in the relative DNA levels in the organelles, thus confirming the involvement of both genes in DNA replication. Interestingly, mutants of the PolIB but not PolIA gene shows increase sensitivity to ciprofloxacin suggesting a function in DNA repair. In line with these results, a cross between a PolIB mutant and the mutant of plastid Whirly genes resulted in plants with severe growth defects and numerous rearrangements in the plastid DNA. In conclusion, we have identified two factors involved in the metabolism of organelle DNA and proposed a simple model of how these genomes are maintained in the plant cell.

Thesis (M.A.)--Miami University, Dept. of History, 2007. / Title from first page of PDF document. Includes bibliographical references (p. 75-83).

Le maintien de la stabilité du génome est essentiel pour la propagation de l’information génétique et pour la croissance et la survie des cellules. Tous les organismes possèdent des systèmes de prévention des dommages et des réarrangements de l’ADN et nos connaissances sur ces processus découlent principalement de l’étude des génomes bactériens et nucléaires. Comparativement peu de choses sont connues sur les systèmes de protection des génomes d’organelles. Cette étude révèle l’importance des protéines liant l’ADN simple-brin de la famille Whirly dans le maintien de la stabilité du génome des organelles de plantes. Nous rapportons que les Whirlies sont requis pour la stabilité du génome plastidique chez Arabidopsis thaliana et Zea mays. L’absence des Whirlies plastidiques favorise une accumulation de molécules rearrangées produites par recombinaison non-homologue médiée par des régions de microhomologie. Ce mécanisme est similaire au “microhomology-mediated break-induced replication” (MMBIR) retrouvé chez les bactéries, la levure et l’humain. Nous montrons également que les organelles de plantes peuvent réparer les bris double-brin en utilisant une voie semblable au MMBIR. La délétion de différents membres de la famille Whirly entraîne une accumulation importante de réarrangements dans le génome des organelles suite à l’induction de bris double-brin. Ces résultats indiquent que les Whirlies sont aussi importants pour la réparation fidèle des génomes d’organelles. En se basant sur des données biologiques et structurales, nous proposons un modèle où les Whirlies modulent la disponibilité de l’ADN simple-brin, régulant ainsi le choix des voies de réparation et permettant le maintien de la stabilité du génome des organelles. Les divers aspects de ce modèle seront testés au cours d’expériences futures ce qui mènera à une meilleure compréhension du maintien de la stabilité du génome des organelles. / Maintenance of genome stability is essential for the accurate propagation of genetic information and for cell growth and survival. Organisms have therefore developed efficient strategies to prevent DNA lesions and rearrangements. Much of the information concerning these strategies has been obtained through the study of bacterial and nuclear genomes. Comparatively little is known about how organelle genomes maintain a stable structure. This study implicates the single-stranded nucleic acid-binding proteins of the Whirly family in the maintenance of plant organelle genome stability. Here we report that the plastid-localized single-stranded DNA binding proteins of the Whirly family are required for plastid genome stability in Arabidopsis thaliana and Zea mays. Absence of plastidial Whirlies favors the accumulation of rearranged molecules that arise through a non-homologous recombination mechanism mediated by regions of microhomology. This mechanism is similar to the microhomology-mediated break-induced replication (MMBIR) described in bacteria, yeast and humans. Additionally we show that plant organelles can repair double-strand breaks using a MMBIR-like pathway. Plants lacking Whirly proteins accumulate elevated levels of microhomology-mediated DNA rearrangements upon double-strand break induction, indicating that Whirlies also contribute to the accurate repair of plant organelle genomes. Using biological and structural data, we propose a working model in which Whirlies modulate the access of repair proteins and complementary DNA to single-stranded regions, thereby regulating the choice of repair pathways and maintaining plant organelle genome stability. The various aspects of this model will be tested in future experiments which should allow a better understanding of the mechanisms underlying genome stability in plant organelles.

Comparativement au génome contenu dans le noyau de la cellule de plante, nos connaissances des génomes des deux organelles de cette cellule, soit le plastide et la mitochondrie, sont encore très limitées. En effet, un nombre très restreint de facteurs impliqués dans la réplication et la réparation de l’ADN de ces compartiments ont été identifiés à ce jour. Au cours de notre étude, nous avons démontré l’implication de la famille de protéines Whirly dans le maintien de la stabilité des génomes des organelles. Des plantes mutantes pour des gènes Whirly chez Arabidopsis thaliana et Zea mays montrent en effet une augmentation du nombre de molécules d’ADN réarrangées dans les plastides. Ces nouvelles molécules sont le résultat d’une forme de recombinaison illégitime nommée microhomology-mediated break-induced replication qui, en temps normal, se produit rarement dans le plastide. Chez un mutant d’Arabidopsis ne possédant plus de protéines Whirly dans les plastides, ces molécules d’ADN peuvent même être amplifiées jusqu’à cinquante fois par rapport au niveau de l’ADN sauvage et causer un phénotype de variégation. L’étude des mutants des gènes Whirly a mené à la mise au point d’un test de sensibilité à un antibiotique, la ciprofloxacine, qui cause des bris double brin spécifiquement au niveau de l’ADN des organelles. Le mutant d’Arabidopsis ne contenant plus de protéines Whirly dans les plastides est plus sensible à ce stress que la plante sauvage. L’agent chimique induit en effet une augmentation du nombre de réarrangements dans le génome du plastide. Bien qu’un autre mutant ne possédant plus de protéines Whirly dans les mitochondries ne soit pas plus sensible à la ciprofloxacine, on retrouve néanmoins plus de réarrangements dans son ADN mitochondrial que dans celui de la plante sauvage. Ces résultats suggèrent donc une implication pour les protéines Whirly dans la réparation des bris double brin de l’ADN des organelles de plantes. Notre étude de la stabilité des génomes des organelles a ensuite conduit à la famille des protéines homologues des polymérases de l’ADN de type I bactérienne. Plusieurs groupes ont en effet suggéré que ces enzymes étaient responsables de la synthèse de l’ADN dans les plastides et les mitochondries. Nous avons apporté la preuve génétique de ce lien grâce à des mutants des deux gènes PolI d’Arabidopsis, qui encodent des protéines hautement similaires. La mutation simultanée des deux gènes est létale et les simples mutants possèdent moins d’ADN dans les organelles des plantes en bas âge, confirmant leur implication dans la réplication de l’ADN. De plus, les mutants du gène PolIB, mais non ceux de PolIA, sont hypersensibles à la ciprofloxacine, suggérant une fonction dans la réparation des bris de l’ADN. En accord avec ce résultat, la mutation combinée du gène PolIB et des gènes des protéines Whirly du plastide produit des plantes avec un phénotype très sévère. En définitive, l’identification de deux nouveaux facteurs impliqués dans le métabolisme de l’ADN des organelles nous permet de proposer un modèle simple pour le maintien de ces deux génomes. / Compared to the nuclear genome, very little is known about the genomes of the two plant cytoplasmic organelles, the plastid and the mitochondria. Indeed, very few factors involved in either the replication or the repair of these genomes have been identified. Here we show the implication of the Whirly protein family in the maintenance of organellar DNA. Indeed, mutations in Whirly genes lead to DNA rearrangements in both Arabidopsis thaliana and Zea mays plastids. These rearrangements are the product of microhomology-mediated break-induced replication that rarely occurs in wild-type plants but increases in absence of Whirly proteins. In a mutant plant devoid of plastidial Whirly proteins, these new DNA molecules can be amplified up to fifty times the normal DNA level and cause a variegated phenotype. In the course of the study of the Whirly mutant plants, we developed a strategy, based on the use of the antibiotic ciprofloxacin, to induce DNA double-strand breaks specifically in plant organelles. The Arabidopsis mutant plants without Whirly proteins in the plastids are more sensitive to the antibiotic ciprofloxacin than wild-type plants. Accordingly, there is a much larger increase in the number of rearranged DNA molecules in the plastids of the mutant plants than in the control plants. Surprisingly, while the mutant plants devoid of Whirly proteins in the mitochondria do not show increased sensitivity to the drug, they do accumulate more rearrangements in their mitochondrial DNA compared to wild-type plants. These results suggest that the Whirly proteins are involved in the repair of DNA double-strand breaks in the plant organelle genomes. Our study of the plant organelle genome stability has lead us to a family of proteins homologous to the DNA polymerase I in bacteria. This family has been proposed to be responsible for most of the DNA-synthesis activity in the plant organelles. We bring genetic proof to support this hypothesis using mutants of the two PolI genes of Arabidopsis. The combined mutation of both genes is lethal and the single mutations cause a decrease in the relative DNA levels in the organelles, thus confirming the involvement of both genes in DNA replication. Interestingly, mutants of the PolIB but not PolIA gene shows increase sensitivity to ciprofloxacin suggesting a function in DNA repair. In line with these results, a cross between a PolIB mutant and the mutant of plastid Whirly genes resulted in plants with severe growth defects and numerous rearrangements in the plastid DNA. In conclusion, we have identified two factors involved in the metabolism of organelle DNA and proposed a simple model of how these genomes are maintained in the plant cell.

Le mode vie autotrophique des plantes repose entièrement sur l’intégrité du chloroplaste et notamment l’étape de la biogénèse. La transcription des gènes chloroplastiques, assurée par une PEP (ARN polymérase encodée par le chloroplaste) et deux NEPs (ARN polymérase encodée par le noyau), est l’une des étapes primordiales dans le développement d’un chloroplaste photosynthétique. On distingue trois classes de gènes chloroplastiques : les gènes de classe I, transcrit par la PEP exclusivement; les gènes de classe II, transcrits par la PEP ou les NEPs; et les gènes de classe III, transcrits exclusivement par les NEPs. Pour assurer sa fonction, la PEP doit être associée à des facteurs sigmas. L’un de ceux-ci, la protéine SIG6, est un facteur sigma général et, associé à la PEP, assure la transcription de l’ensemble des gènes de classe I et II lors du développement du chloroplaste photosynthétique. Ainsi, le mutant sig6 présente un phénotype de cotylédons pâles, associé à un retard de biogénèse chloroplastique, ainsi qu’une diminution de la transcription des gènes de classe I, provoquant la diminution de la quantité de protéines de classe I. Dans le laboratoire, nous étudions les deux protéines WHIRLY chloroplastiques (WHY1 et WHY3) pour leur rôle dans le maintien de la stabilité génomique chloroplastique. Toutefois, peu de choses sont encore connues sur leur rôle potentiel dans la transcription ou la biogénèse chloroplastique. Par exemple, lorsque l’on tente de purifier la PEP, on obtient un gros complexe transcriptionnel nommé PTAC (Plastid Transcriptionally Active Chromosome) dans lequel sont retrouvées les deux protéines WHIRLY, suggérant qu’elles pourraient être impliquées dans la transcription chloroplastique. De plus, un possible rôle dans la biogénèse chloroplastique leur a été prêté, notamment chez le maïs. Dans cette étude, nous avons donc cherché à vérifier l’implication des protéines WHIRLY dans la biogénèse chloroplastique par une approche génétique de croisements entre les mutants sig6 et why1why3. Pour cela, nous avons isolé des doubles mutants sig6why1 et sig6why3, ainsi qu’un triple mutant sig6why1why3. À l’aide d’une caractérisation phénotypique et de la quantification de quelques protéines chloroplastiques, nous avons remarqué que la perte d’un des WHIRLY permet de complémenter le phénotype de cotylédons pâles du mutant sig6 et favorise l’expression normale de protéines en principe sous-exprimées dans le mutant sig6. Toutefois, la perte des deux WHIRLY ne permet pas de compenser le phénotype de cotylédons pâles et provoque l’apparition d’un phénotype persistant associé à une expression anormale des protéines chloroplastiques. Ces résultats ne peuvent être expliqués par le rôle des WHIRLY dans le maintien de la stabilité génomique chloroplastique étant donné que le triple mutant sig6why1why3 présente moins de réarrangements que le double mutant why1why3. Finalement, nous montrons que les effets de la perte d’un WHIRLY sur le mutant sig6 peuvent être mimés par l’utilisation de la rifampicine, une drogue inhibant l’ARN polymérase chloroplastique de type bactérienne (PEP). Ensemble, ces résultats démontrent donc l’implication des protéines WHIRLY chloroplastiques dans la biogénèse chloroplastique en association avec la protéine SIG6. Nous proposons un modèle selon lequel les deux protéines WHIRLY permettraient de favoriser l’activité de l’ARN polymérase de type bactérienne, notamment lors du développement du chloroplaste photosynthétique. En cas d’absence d’une des deux protéines, cette diminution partielle d’activité de la PEP favoriserait la mise en place d’un mécanisme de complémentation par le NEPs, permettant finalement de rétablir la biogénèse chloroplastique dans un mutant sig6. En l’absence des deux WHIRLY, le mécanisme de complémentation par les NEPs serait incapable de compenser la forte inhibition de la PEP, se traduisant par une aggravation du retard de développement du chloroplaste dans le mutant sig6. / The autotrophic lifestyle of plants relies entirely on the integrity of chloroplasts and particularly on their biogenesis. Chloroplast gene transcription, performed by a Plastid-Encoded Polymerase (PEP) and two Nuclear-Encoded Polymerases (NEPs), is one of the key steps during the development of photosynthetic chloroplast. There are 3 classes of genes, one transcribed by PEP alone (class I), one by both PEP and NEPs (class II), and the third by NEPs alone (class III). To carry out transcription, PEP associates with plastid sigma factors including the general sigma factor SIG6. sig6 mutants have a pale cotyledon phenotype, a severe decrease in class I gene transcription and a reduction in the level of class I proteins. In our laboratory, we study the role of the two plastid WIHRLY proteins (WHY1 and WHY3) in maintaining plastid genome stability. However, little is known about any role these proteins may play in transcription or chloroplast biogenesis. It seems likely they are involved in plastid gene transcription since they are found in the Plastid Transcriptionally Active Chromosome (PTAC). Moreover, they have been implicated in chloroplast biogenesis in maize. In this study, we verified the implication of these proteins in plastid biogenesis using a genetic approach in which we crossed a sig6 mutant with a why1why3 mutant. We isolated sig6why1 and sig6why3 double mutants and a sig6why1why3 triple mutant. Using a phenotypic characterisation and quantification of some plastid proteins, we show that loss of one of the two Why genes complements the sig6 pale cotyledon phenotype and allows a more normal pattern of expression of plastid proteins that are under-expressed in the sig6 mutant. However, we also show that loss of the two Why genes does not alleviate the sig6 phenotype. Moreover, the triple mutant shows a second pale phenotype on true leaves, and the plastid protein expression pattern is abnormal compared to either sig6 or wild type plants. Those results cannot be explained by the role of WHIRLY proteins in plastid genome stability since the triple mutant shows fewer plastid genome rearrangements than the why1why3 mutant. Finally, we show that inhibition of the PEP polymerase using rifampicin elicits the same complementation of the sig6 phenotype as the loss of one of the two WHIRLY. Together, these results show the implication of WHIRLY proteins in plastid biogenesis in association with SIG6. We propose a model in which WHIRLY act as activators of PEP activity, particularly during the chloroplast biogenesis. Therefore, the absence of one of the WHIRLY would cause a weak inhibition of PEP, facilitating the set-up of a rescue mechanism by NEPs and, consequently, allowing the complementation of plastid biogenesis in the sig6 mutant. However, the absence of the two WHIRLY proteins would cause a strong inhibition of PEP, and the inability of the rescue mechanism by NEPs to compensate for this strong inhibition, resulting in a more severe phenotype in the sig6 mutant.

Le mode vie autotrophique des plantes repose entièrement sur l’intégrité du chloroplaste et notamment l’étape de la biogénèse. La transcription des gènes chloroplastiques, assurée par une PEP (ARN polymérase encodée par le chloroplaste) et deux NEPs (ARN polymérase encodée par le noyau), est l’une des étapes primordiales dans le développement d’un chloroplaste photosynthétique. On distingue trois classes de gènes chloroplastiques : les gènes de classe I, transcrit par la PEP exclusivement; les gènes de classe II, transcrits par la PEP ou les NEPs; et les gènes de classe III, transcrits exclusivement par les NEPs. Pour assurer sa fonction, la PEP doit être associée à des facteurs sigmas. L’un de ceux-ci, la protéine SIG6, est un facteur sigma général et, associé à la PEP, assure la transcription de l’ensemble des gènes de classe I et II lors du développement du chloroplaste photosynthétique. Ainsi, le mutant sig6 présente un phénotype de cotylédons pâles, associé à un retard de biogénèse chloroplastique, ainsi qu’une diminution de la transcription des gènes de classe I, provoquant la diminution de la quantité de protéines de classe I. Dans le laboratoire, nous étudions les deux protéines WHIRLY chloroplastiques (WHY1 et WHY3) pour leur rôle dans le maintien de la stabilité génomique chloroplastique. Toutefois, peu de choses sont encore connues sur leur rôle potentiel dans la transcription ou la biogénèse chloroplastique. Par exemple, lorsque l’on tente de purifier la PEP, on obtient un gros complexe transcriptionnel nommé PTAC (Plastid Transcriptionally Active Chromosome) dans lequel sont retrouvées les deux protéines WHIRLY, suggérant qu’elles pourraient être impliquées dans la transcription chloroplastique. De plus, un possible rôle dans la biogénèse chloroplastique leur a été prêté, notamment chez le maïs. Dans cette étude, nous avons donc cherché à vérifier l’implication des protéines WHIRLY dans la biogénèse chloroplastique par une approche génétique de croisements entre les mutants sig6 et why1why3. Pour cela, nous avons isolé des doubles mutants sig6why1 et sig6why3, ainsi qu’un triple mutant sig6why1why3. À l’aide d’une caractérisation phénotypique et de la quantification de quelques protéines chloroplastiques, nous avons remarqué que la perte d’un des WHIRLY permet de complémenter le phénotype de cotylédons pâles du mutant sig6 et favorise l’expression normale de protéines en principe sous-exprimées dans le mutant sig6. Toutefois, la perte des deux WHIRLY ne permet pas de compenser le phénotype de cotylédons pâles et provoque l’apparition d’un phénotype persistant associé à une expression anormale des protéines chloroplastiques. Ces résultats ne peuvent être expliqués par le rôle des WHIRLY dans le maintien de la stabilité génomique chloroplastique étant donné que le triple mutant sig6why1why3 présente moins de réarrangements que le double mutant why1why3. Finalement, nous montrons que les effets de la perte d’un WHIRLY sur le mutant sig6 peuvent être mimés par l’utilisation de la rifampicine, une drogue inhibant l’ARN polymérase chloroplastique de type bactérienne (PEP). Ensemble, ces résultats démontrent donc l’implication des protéines WHIRLY chloroplastiques dans la biogénèse chloroplastique en association avec la protéine SIG6. Nous proposons un modèle selon lequel les deux protéines WHIRLY permettraient de favoriser l’activité de l’ARN polymérase de type bactérienne, notamment lors du développement du chloroplaste photosynthétique. En cas d’absence d’une des deux protéines, cette diminution partielle d’activité de la PEP favoriserait la mise en place d’un mécanisme de complémentation par le NEPs, permettant finalement de rétablir la biogénèse chloroplastique dans un mutant sig6. En l’absence des deux WHIRLY, le mécanisme de complémentation par les NEPs serait incapable de compenser la forte inhibition de la PEP, se traduisant par une aggravation du retard de développement du chloroplaste dans le mutant sig6. / The autotrophic lifestyle of plants relies entirely on the integrity of chloroplasts and particularly on their biogenesis. Chloroplast gene transcription, performed by a Plastid-Encoded Polymerase (PEP) and two Nuclear-Encoded Polymerases (NEPs), is one of the key steps during the development of photosynthetic chloroplast. There are 3 classes of genes, one transcribed by PEP alone (class I), one by both PEP and NEPs (class II), and the third by NEPs alone (class III). To carry out transcription, PEP associates with plastid sigma factors including the general sigma factor SIG6. sig6 mutants have a pale cotyledon phenotype, a severe decrease in class I gene transcription and a reduction in the level of class I proteins. In our laboratory, we study the role of the two plastid WIHRLY proteins (WHY1 and WHY3) in maintaining plastid genome stability. However, little is known about any role these proteins may play in transcription or chloroplast biogenesis. It seems likely they are involved in plastid gene transcription since they are found in the Plastid Transcriptionally Active Chromosome (PTAC). Moreover, they have been implicated in chloroplast biogenesis in maize. In this study, we verified the implication of these proteins in plastid biogenesis using a genetic approach in which we crossed a sig6 mutant with a why1why3 mutant. We isolated sig6why1 and sig6why3 double mutants and a sig6why1why3 triple mutant. Using a phenotypic characterisation and quantification of some plastid proteins, we show that loss of one of the two Why genes complements the sig6 pale cotyledon phenotype and allows a more normal pattern of expression of plastid proteins that are under-expressed in the sig6 mutant. However, we also show that loss of the two Why genes does not alleviate the sig6 phenotype. Moreover, the triple mutant shows a second pale phenotype on true leaves, and the plastid protein expression pattern is abnormal compared to either sig6 or wild type plants. Those results cannot be explained by the role of WHIRLY proteins in plastid genome stability since the triple mutant shows fewer plastid genome rearrangements than the why1why3 mutant. Finally, we show that inhibition of the PEP polymerase using rifampicin elicits the same complementation of the sig6 phenotype as the loss of one of the two WHIRLY. Together, these results show the implication of WHIRLY proteins in plastid biogenesis in association with SIG6. We propose a model in which WHIRLY act as activators of PEP activity, particularly during the chloroplast biogenesis. Therefore, the absence of one of the WHIRLY would cause a weak inhibition of PEP, facilitating the set-up of a rescue mechanism by NEPs and, consequently, allowing the complementation of plastid biogenesis in the sig6 mutant. However, the absence of the two WHIRLY proteins would cause a strong inhibition of PEP, and the inability of the rescue mechanism by NEPs to compensate for this strong inhibition, resulting in a more severe phenotype in the sig6 mutant.

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Contrairement à la plupart des eucaryotes non-photosynthétiques, les végétaux doivent assurer la stabilité d’un génome additionnel contenu dans le plastide, un organite d’origine endosymbiotique. Malgré la taille modeste de ce génome et le faible nombre de gènes qu’il encode, celui-ci est absolument essentiel au processus de photosynthèse. Pourtant, même si ce génome est d’une importance cruciale pour le développement de la plante, les principales menaces à son intégrité, ainsi que les conséquences d’une déstabilisation généralisée de sa séquence d’ADN, demeurent largement inconnues. Dans l’objectif d’élucider les conséquences de l’instabilité génomique chloroplastique, nous avons utilisé le mutant why1why3polIb d’Arabidopsis thaliana, qui présente d’importants niveaux de réarrangements génomiques chloroplastiques, ainsi que la ciprofloxacine, un composé induisant des brisures double-brins dans l’ADN des organites. Ceci nous a permis d’établir qu’une quantité importante de réarrangements génomiques provoque une déstabilisation de la chaîne de transport des électrons photosynthétique et un grave stress oxydatif associé au processus de photosynthèse. Étonnamment, chez why1why3polIb, ces hautes concentrations d’espèces oxygénées réactives ne mènent ni à la perte de fonction des chloroplastes affectés, ni à la mort cellulaire des tissus. Bien au contraire, ce déséquilibre rédox semble être à l’origine d’une reprogrammation génique nucléaire permettant de faire face à ce stress photosynthétique et conférant une tolérance aux stress oxydatifs subséquents. Grâce à une nouvelle méthode d’analyse des données de séquençage de nouvelle génération, nous montrons également qu’un type particulier d’instabilité génomique, demeuré peu caractérisé jusqu’à maintenant, constitue une des principales menaces au maintien de l’intégrité génomique des organites, et ce, tant chez Arabidopsis que chez l’humain. Ce type d’instabilité génomique est dénommé réarrangement de type U-turn et est vraisemblablement associé au processus de réplication. Par une approche génétique, nous démontrons que les protéines chloroplastiques WHY1, WHY3 et RECA1 empêchent la formation de ce type d’instabilité génomique, probablement en favorisant la stabilisation et le redémarrage des fourches de réplication bloquées. Une forte accumulation de réarrangements de type U-turn semble d’ailleurs être à l’origine d’un sévère trouble développemental chez le mutant why1why3reca1. Ceci soulève de nombreuses questions quant à l’implication de ce type d’instabilité génomique dans de nombreux troubles et pathologies possédant une composante mitochondriale. / In contrast to most non-photosynthetic eukaryotes, plants must ensure the stability of an additional genome contained within the plastid organelle. Despite the small size of the plastid genome and its low gene content, this genome is nevertheless absolutely essential for photosynthesis and plant energy metabolism. In spite of this, the main threats this genome encounters and their underlying consequences remain poorly understood. To evaluate the consequences of generalized plastid genome instability, we use the why1why3polIb Arabidopsis thaliana mutant line, which exhibits elevated levels of plastid genome rearrangements, and ciprofloxacin, a compound that induces double strand-breaks within organelle DNA. We demonstrated that high levels of plastid genome rearrangements lead to a decrease in photosynthetic electron transport chain efficiency and to a severe photosynthesis-associated oxidative stress. Surprisingly, these high levels of reactive oxygen species are neither associated to a loss of chloroplast function, nor to cell death. Instead, this redox imbalance seems to initiate a nuclear genetic expression remodelling that allows adaptation to this photosynthetic stress and confers tolerance to subsequent oxidative stresses. Using a novel approach for the analysis of next-generation sequencing data, we have also shown that a poorly characterized type of genomic instability constitutes one of the main threats to organelle genomic integrity, both in Arabidopsis and human. We demonstrate that this particular type of genomic instability, named U-turn-like DNA rearrangement, is most probably associated to errors during the replication process. Also, a genetic approach revealed that the chloroplast-localized proteins WHY1, WHY3 and RECA1 all act to repress this type of genomic instability, probably by stabilizing and stimulating the accurate restart of collapsed replication forks. A strong accumulation of U-turn-like rearrangements is notably associated to severe developmental defects in the why1why3reca1 mutant line. This raises the question of whether this type of genomic instability could be involved in the appearance of several mitochondria-associated pathologies.