Des cellules de levures dont les chromosomes se finissent par des répétitions télomériques humaines, peuvent être conçues en remplaçant simplement la séquence matrice ARN originale de la télomérase (TLC1) par une séquence matrice humaine (tlc1h). Dans ces levures dites « humanisées », les télomères sont courts mais stables avec une extension télomérique humaine 3' simple brin. Néanmoins, ces séquences humaines inhabituelles au niveau des télomères de Saccharomyces cerevisiae engendrent différentes réponses cellulaires. Après la substitution initiale de la séquence matrice de TLC1, les répétitions télomériques levures sont graduellement remplacées par les répétitions humaines qui sont reconnues comme un dommage par la cellule : la protéine Rad53p est phosphorylée. Cette activation de Rad53p est synonyme d'activation des points de contrôle du cycle cellulaire et en effet un délai en phase G2/M du cycle cellulaire est observé. L'accumulation en G2/M augmente avec le degré d'humanisation des télomères, et le phénotype terminal observé aux générations les plus avancées est un réarrangement chromosomique suite aux fusions entre télomères. La réintroduction d'une copie originale de TLC1 comme unique matrice ARN dans une levure qui était précédemment humanisée montrerait que le bloc télomérique humain distal, et plus précisément le simple brin télomérique humain T[indice inférieur 2]AG[indice inférieur 3], serait le signal responsable de la phosphorylation de Rad53p, tandis qu'un bloc [T[indice inférieur 2]AG[indice inférieur 3]/C[indice inférieur 3]TA[indice inférieur 2]] à un site interne ne déclenche ni l'activation de Rad53p, ni les points de contrôle du cycle cellulaire. Tandis que les phénotypes associés à l'activation des points de contrôles du cycle cellulaire n'apparaissent seulement qu'aux générations avancées, la télomérase devient essentielle aussitôt que la cellule de levure contient tlc1h comme matrice ARN unique. L'abolition de l'expression de tlc1h ou l'expression d'un mutant catalytique de la télomérase mène à une perte immédiate de la viabilité sans sénescence. Cela suggère une augmentation dramatique de la fréquence des évènements de raccourcissements critiques des télomères qui doivent être surmontés par une télomérase active. Nous nous sommes dès lors demandé si les répétitions télomériques humaines causaient des problèmes pour la machinerie de réplication de l'ADN chez la levure. En effet, les analyses de gel à deux dimensions ont révélé des intermédiaires de réplication non conventionnels indiquant qu'un télomère humanisé cause une pause au niveau de la fourche de réplication. En accord avec cette observation, la mutation de certains gènes impliqués dans la stabilité ou la progression des fourches cause une augmentation de la sensibilité des levures humanisées aux agents endommageant l'ADN. Ces derniers résultats expliqueraient le rôle obligatoire de la télomérase chez la levure humanisée qui viendrait compenser la perte des répétitions télomériques suite à la pause voire l'écroulement de la fourche de réplication.

Chez les Eucaryotes, les télomères sont indispensables au maintien de la stabilité du génome. Leur structure unique permet à la cellule de différencier entre les extrémités des chromosomes et les cassures doubles brin de l’ADN, prévenant ainsi leurs fusions. Au fil des générations, les télomères subissent un raccourcissement dû aux problèmes de réplication des extrémités, provoquant ainsi l’entrée des cellules en sénescence. Comme chez les mammifères, chez la levure, la télomérase permet la réplication complète de ces extrémités prévenant ainsi un vieillissement prématuré de ces cellules. Lors de la tumorigenèse, dans la plupart des cas, la télomérase est réactivée. Celle-ci permet de rallonger(1) en continu les télomères procurant aux cellules la capacité d’échapper à la sénescence. Dans d’autres cas, la télomérase n’est pas réactivée, les télomères sont maintenus par des mécanismes alternatifs(2). D’autres caractéristiques sont attribuées aux cellules tumorales comme l’inactivation(3) des points de contrôle du cycle cellulaire (IPC) permettant à ces cellules de se diviser anarchiquement en présence de dommage à l’ADN. Plusieurs questions restent en suspens : comment se fait cette inactivation ? Existent-ils d’autres facteurs génétiques qui favorisent cette inactivation ? Comment traiter et/ou arrêter la prolifération anarchique de ces cellules ? Afin de mieux comprendre les événements et les facteurs génétiques qui favorisent l’IPC, nous avons utilisé un modèle précédemment développé dans notre laboratoire chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Ces cellules disposent de télomères entièrement déprotégés et érodés ainsi que de nombreuses caractéristiques (1,2,3) des cellules tumorales. Grâce à des expériences de génétique et de microscopies, nous avons pu d’abord caractériser ces cellules ; ensuite, identifier un groupe de gènes (CDC5, TID1 et PTC2.) impliqués dans l’IPC, via un processus appelé « Adaptation ». De plus, lors de l’adaptation, l’expression de plusieurs autres gènes (MOG1, YMR018W, YFL061W) est modulée. Toutefois, leurs fonctions sont encore à déterminer. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés au rôle de la protéine Cdc13 dans la protection et la réplication des télomères. Cdc13 fait partie d’un complexe (Cdc13/Stn1/Ten1) qui est hautement conservé lors de l’évolution appelée CST (chez l’Homme : hCtc1, hStn1, hTen1). Grâce à l’étude in vivo de différents mutants de Cdc13, par diverses stratégies, nous avons pu mettre en évidence de nouvelles caractéristiques biochimiques telles que la dimérisation ainsi que les interfaces requises pour celle-ci. De plus, à l’aide de techniques de microscopie nous avons pu identifier le rôle fonctionnel de deux des cinq domaines de la protéine Cdc13 dans la localisation subcellulaire. Ces dernières découvertes nous ont permis d’apporter une nouvelle interprétation concernant les défauts de protection relatifs à l’allèle cdc13-1 dans la biologie des télomères. Ces défauts ressemblent étroitement à ceux observés dans des cas de maladies du vieillissement prématuré, associées à des mutations de la protéine hCtc1 humaine.

Les maladies à Prions sont des maladies neurodégénératives fatales, touchant l'homme et l'animal. Même si le risque de transmission de la maladie de la vache folle à l'homme semble maîtrisé, il persiste actuellement un risque de santé publique lié à la transmission iatrogène de cette forme, notamment par transfusion sanguine. Pour contrôler cette transmission, il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de réplication et de dissémination des Prions. Ces mécanismes de réplication se produisent à des échelles de temps et de taille difficilement accessibles expérimentalement, et ont ainsi fait l'objet de nombreuses modélisations théoriques utiles pour aider à la compréhension des mécanismes. L'objectif de cette thèse est de compléter ces modèles mathématiques, afin d'étudier plus spécifiquement les conséquences dynamiques sur la réplication des Prions, des propriétés de réplication taille-dépendante d'une part, et de l'hétérogénéité des cellules impliquées dans la réplication d'autre part. Dans un premier temps, nous avons généralisé un modèle de polymérisation nucléée pour prendre en compte un taux d'élongation des fibrilles dépendant de leur taille. Nous avons principalement déduit de cette étude que la distribution en taille des agrégats semble une donnée expérimentale très informative sur les mécanismes élémentaires de réplication, au contraire du profil cinétique d'accumulation de la PrPres peu sensibles aux propriétés de réplication taille-dépendantes. Dans un second temps, après une caractérisation expérimentale de l'hétérogénéité cellulaire de réplication, nous avons intégré le mécanisme de réplication intracellulaire à un modèle multicellulaire par automate cellulaire continu stochastique. De manière appliquée, cette étude nous a permis d'identifier des étapes du processus de culture cellulaire critiques pour l'établissement d'une infection chronique, et nous a permis de proposer plusieurs protocoles pour augmenter la sensibilité des cultures cellulaires aux infections à Prions.

L'entrée en sénescence, considérée comme un arrêt irréversible du cycle, se caractérise par une modification de l'organisation de la chromatine formant de véritables foyers d' hétérochromatine spécifiques (SAHF) coordonnée à une modification d'expression génique et à un déclin progressif de la compétence à répliquer le génome. Ainsi, au cours de ma thèse, j'ai voulu comprendre en quoi ces changements d'organisation du génome pouvaient influer sur la distribution et l'activation des origines d e réplication lors de l'entrée en sénescence réplicative ou déclenchée de façon prématurée par l'inhibition d'un modulateur de chromatine, la protéine à activité Histone AcétylTransférase p300. Pour étudier ces régulations, j'ai utilisé le peignage moléculaire d'ADN réplicatif qui permet de suivre les fourches de réplication et d'évaluer la distribution moyenne des origines. De plus, à l'aide de la purification de brins naissants aux origines de réplication couplée à un séquençage haut débit, nous avons cartographié la position de ces origines sur l'ensemble du génome humain et étudier un ensemble de facteurs pouvant intervenir dans ce déterminisme. Grâce à cette étude, nous avons pu suivre finement les modifications d'activité des origines associées à l'entrée en sénescence. De plus, afin de mieux comprendre les mécanismes d'activation des origines de réplication, nous avons étudié en collaboration avec l'équipe du Dr Fisher, le rôle de Cdk1 et de Cdk2 dans l'activation des origines dans le modèle Xénope. / Senescence entry, considered as an irreversible cell cycle arrest, is characterized by modifications of chromatin organization forming specific heterochromatin foci (SAHF) coordinated to modification of gene expression and the progressive loss of capacity to replicate the genome. During my PhD, we investigated whether these changes in genome organization might induce modifications in the distribution and the activity of replication origins during replicative senescence entry and in prematurely induced senescence by inhibition of a chromatin modulator, the Histone AcetylTransferase p300. To study these regulations, we used the replicating DNA combing allowing to follow the progression of replication forks and to evaluate the mean distribution of origins. By using the nascent strand purification assay coupled to deep sequencing, we mapped the position of replication origins in the whole human genome and studied some factors which could be involve d with this determinism. Thanks to this study, we followed finely the modifications of activity of replication origins associated to senescence entry. Moreover, in order to better understand the mechanisms of activation of origins, we studied in collaboration with Dr Fisher's team, the role of Cdk1 and Cdk2, in the activity of replication origins in the Xenopus model.

Le cancer est une maladie majeure ayant un taux de mortalité élevé dans le monde et au Canada. C'est pourquoi notre équipe de recherche développe de nouvelles classes d'agents anticancéreux, notamment les phényl 4-(2-oxoimidazolidin-1-yl)benzènesulfonates (PIB-SOs) et les N-phényl ureidobenzènesulfonates (PUB-SOs). Les PIB-SOs et les PUB-SOs sont constitués de deux cycles aromatiques identifiés A et B reliés entre eux par un pont sulfonate. Les PIB-SOs sont principalement caractérisés par un groupement imidazolidin-2-one sur le cycle aromatique A alors que les PUB-SOs possèdent un groupement 2-chloroéthylurée ou éthylurée sur ce cycle. D'un côté, les PIB-SOs montrent une activité antiproliférative sur des cellules cancéreuses de l'ordre du nanomolaire, arrêtent le cycle cellulaire en phase G2/M et ciblent les microtubules dans le site de liaison de la colchicine (C-BS). D'un autre côté, les PUB-SOs ont une activité antiproliférative de l'ordre du bas micromolaire sur des lignées cellulaires cancéreuses. Selon leur structure, ils peuvent soit arrêter le cycle cellulaire en phase G2/M et cibler le C-BS des microtubules lorsqu'ils sont substitués en position 3, 4 et/ou 5 sur le cycle aromatique B ou soit arrêter le cycle cellulaire en phase S et cibler les mécanismes de réparation et de réplication de l'ADN lorsque le cycle aromatique B est substitué en position 2 par des halogènes ou de courtes chaînes alkyles. Les travaux de mon doctorat avaient pour objectif général d'optimiser les propriétés physicochimiques, pharmacologiques et pharmacocinétiques des PIB-SOs et des PUB-SOs. À cet effet, 187 nouveaux dérivés et analogues des PIB-SOs et des PUB-SOs ont été préparés, purifiés, caractérisés et évalués biologiquement. Les nouveaux dérivés et analogues des PIB-SOs sont divisés en neuf familles principales caractérisées par la substitution du groupement imidazolidin-2-one par un groupement lactame, imidazolidin-2,4-dione, imidazolidin-2,5-dione, éthyl 2-uréidoacétate, butyramide, éthylurée, 2-chloroéthylurée, éthylthiourée ou phénylurée. L'activité antiproliférative des familles peuvent être divisée en trois catégories : (1) très active (ordre du nanomolaire), (2) modérément active (ordre du micromolaire) et (3) peu ou non active (supérieure à 100 μM). Les familles de composés possédant le groupement lactame, imidazolidin-2,4-dione ou imidazolidin-2-one intègrent la catégorie très active. Les familles de composés ayant les groupements butyramide, éthylurée, 2-chloroéthylurée, éthylthiourée ou phénylurée sont dans la catégorie modérément active et finalement, ceux portant les groupements imidazolidin-2,5-dione ou éthyl 2-uréidoacétate sont dans la catégorie peu ou non active. Les composés les plus puissants des familles très actives et modérément actives arrêtent la progression du cycle cellulaire en phase G2/M, inhibent la polymérisation des microtubules et perturbent le cytosquelette en se liant au C-BS. Ils sont aussi actifs sur des lignées cellulaires résistantes au paclitaxel, à la vinblastine et sur une lignée cellulaire surexprimant la glycoprotéine P. Ils ne sont pas ou seulement faiblement toxiques sur le modèle d'embryons de poulet et ils montrent des propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques théoriques prometteuses en plus de respecter les filtres de biodisponibilité per os. Les dérivés et analogues des PUB-SOs sont divisés en deux familles principales en remplaçant le groupement 2-chloroéthylurée soit par différents groupements amides ou soit par différents groupements urées. L'activité antiproliférative de ces nouveaux dérivés et analogues des PUB-SOs est généralement plus puissante avec les groupements urées qu'avec les groupements amides et elle se situe entre la centaine de nanomolaire et le bas micromolaire. Les relations structure-activité des composés les plus puissants montrent que l'arrêt de la progression du cycle cellulaire en phase S survient seulement lorsque le cycle aromatique B est substitué en position 2 par des halogènes ou de courtes chaînes alkyles ; les composés ayant un autre patron de substitution sur le cycle aromatique B arrêtent la progression du cycle cellulaire en phase G2/M et perturbent les microtubules. Les composés les plus puissants arrêtant le cycle cellulaire en phase S induisent la phosphorylation de l'histone 2AX, un marqueur de stress réplicatifs. Des essais de cinétique d'alkylation démontrent que leur activité biologique n'est pas causée par leur potentiel alkylant. Les nouveaux analogues ne sont pas ou seulement faiblement toxiques sur le modèle d'embryons de poulet et ont également des propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques théoriques prometteuses tout en respectant les filtres biodisponibilité per os. Les dérivés et analogues des PIB-SOs et des PUB-SOs composent donc de nouvelles familles d'agents anticancéreux prometteurs pour des études précliniques plus poussées. / Cancer is a major disease leading to a high mortality rate worldwide and in Canada. As a result, our research team develops new anticancer agent classes notably phenyl 4-(2-oxoimidazolidin-1-yl)benzenesulfonates (PIB-SOs) and phenyl ureidobenzenesulfonates (PUB-SOs). PIB-SOs and PUB-SOs consist of two aromatic rings named A and B connected together by a sulfonate bridge. PIB-SOs are mainly characterized by an imidazolidin-2-one moiety on the aromatic ring A while PUB-SOs bear a 2-chloroethylurea or an ethylurea on this ring. On the one hand, PIB-SOs show antiproliferative activity in the nanomolar range towards cancer cells, block cell cycle progression in G2/M phase and target microtubules in the colchicine-binding site (C-BS). On the other hand, PUB-SOs exhibit antiproliferative activity in the low micromolar on cancer cell lines. Depending on their structures, they either stop the cell cycle progression in the G2/M phase and target the C-BS of microtubules when they bear substituents at position 3, 4 and/or 5 on the aromatic ring B or they arrest the cell cycle progression in the S phase and target the DNA repair and replication mechanisms when they bear halogens or short alkyl chains at position 2 on the aromatic ring B. The general objective of my doctoral work was to optimize the physicochemical, pharmacological and pharmacokinetic properties of PIB-SOs and PUB-SOs. To this end, 187 new derivatives and analogues of PIB-SOs and PUB-SOs were prepared, purified, characterized and biologically evaluated. New PIB-SOs are divided into nine families of compounds characterized by the replacement of the imidazolidin-2-one moiety by lactam, imidazolidin-2,4-dione, imidazolidin-2,5-dione, ethyl 2-ureidoacetate, butyramide, ethylurea, 2-chloroethylurea, thioethylurea or phenylurea group. The antiproliferative activity of these families can be divided into 3 categories: (1) very active (nanomolar range), (2) moderately active (micromolar range) and (3) weakly or not active (over 100 μM). Families of compounds having a lactam, an imidazolidin-2,4-dione or an imidazolidin-2-one are in the very active category. Families bearing a butyramide, an ethylurea, a 2-chloroethylurea, a thioethylurea or a phenylurea group are in the moderately active category while those bearing an imidazolidin-2,5-dione or an ethyl 2-ureidoacetate are in the weakly or not active category. The most potent compounds of the most and moderately active families arrest the cell cycle progression in G2/M phase, inhibit microtubule polymerization and disrupt the cytoskeleton by binding to the C-BS. They are also active in paclitaxel- and vinblastine-resistant cell lines and on a cell line overexpressing the P-glycoprotein. Moreover, they are not or only weakly toxic on the chick embryos model and they exhibit promising theoretical physicochemical and pharmacokinetic properties in addition to respecting oral bioavailability filters. Derivatives and analogues of PUB-SOs are divided into two main families by replacing the 2-chloroethylurea moiety either by various amide groups or by different urea moieties. The antiproliferative activity of these new derivatives and analogues of PUB-SOs is generally more potent when they are substituted with a urea group than by an amide group and is between the hundred nanomolar to low micromolar. The structure-activity relationships with the most potent derivatives show that the arrest of the cell cycle progression in S phase occurs only when the aromatic ring B is substituted at position 2 by halogens or short alkyl chains; compounds bearing other substitution patterns on the aromatic ring B arrest the cell cycle progression in G2/M phase and disrupt microtubules. Moreover, the most potent compounds blocking the cell cycle progression in S phase induce the phosphorylation of the histone 2AX, a marker of the replicative stress. Alkylation kinetic assays show that their biological activity is not related to their alkylating potency. Moreover, they are not or only weakly toxic on the chick embryos model and they exhibit promising theoretical physicochemical and pharmacokinetic properties in addition to complying oral bioavailability filters. The derivatives and analogues of PIB-SOs and PUB-SO constitute new families of anticancer agents promising for further preclinical studies.

Dans Escherichia coli la Dam Methyl Transferase (DamMT) est responsable du transfert d’un groupement méthyle sur les adénosines situés au cœur du tétranucléotide GATC; il s’agit donc d’une activité post réplicative. Ainsi, après le passage de la fourche de réplication, le brin d’ADN nouvellement synthétisé est non méthylé – l’ADN est dit hémimethylé. L’ADN reste hémimethylé pendent une brève période - de l’ordre de la minute - avant d’être reméthylé par la DamMT. L’hypothèse de l’implication de la méthylation de l’ADN dans le contrôle général du programme de maintenance de l’ADN repose essentiellement sur cette observation, puisque l’ADN hemimethyle – exception faite de l’origine de réplication et de la région promotrice du gène dnaA – est diagnostique du passage récent de la fourche de réplication. Cette hypothèse, et le criblage phylogénomique qui en a découlé a conduit a l’identification de plusieurs gènes dont les produits sont supposes être impliqués dans la maintenance de l’ADN. yjaG est l’un de ces gènes. Il a été renomme cycC en raison des dérèglements de la progression du cycle cellulaire associés a un mutant nul de ce gène. L’étude effectuée au cours de ma thèse s’attachera à expliquer l’état actuel de nos connaissances sur la protéine CycC et de son implication dans le processus de réplication de l’ADN. Nos résultats montrent que la protéine CycC est impliquée dans la processivité de la réplication lorsqu’il y a un dommage au niveau de l’ADN. CycC spécifie une activité qui conduit à freiner les fourches de réplication, afin de prévenir des avortements des réplisomes. La surexpression de CycC bloque l’initiation de la réplication entre l’ouverture de la molécule d’ADN et le chargement de l’hélicase réplicative. Nous proposons que CycC interagisse avec le complexe réplicative et ralentit les fourches de réplication. Ce ralentissement prévient de nouvelles collisions lorsque les cellules sont dans des conditions de stress-qui cause des arrêts de la réplication. / In Escherichia coli the Dam Methyl Transferase (DamMT) is responsible for the transfer of a methyl group on the adenosine located in tetranucleotide GATC, so this is a post-replicative activity. Thus, after the passage of the replication fork, the newly synthesized DNA strand is unmethylated - DNA is called hemimethylated. DNA remains hemimethylated in a brief period - about a minute - before being reméthylé by DamMT. The hypothesis of the involvement of DNA methylation in the general control of the maintenance program of the DNA is essentially on this observation, since the hemimethylated DNA - except the origin of replication and the region dnaA gene promoter - is diagnostic of the recent passage of the replication fork. This assumption and phylogenomics screening has led to the identification of several genes whose protein are supposed to be involved in the maintenance of DNA. yjaG is one of these genes. It was renamed cycC, the cell cycle progression is deregulated with a null mutant of this gene. The study in my thesis will focus on explaining the current state of our knowledge of the cycC protein and its involvement in the process of DNA replication. Our results show that the CycC protein is involved in the processivity of replication when there is damage into the DNA. CycC specifies an activity that leads to slow replication forks to prevent abortions of replisomes. CycC overexpression blocks the initiation of replication between the open complex of the DNA at oriC and the loading of the replicative helicase. We propose that CycC interacts with the replicative complex and slows replication forks. This slowdown replication prevents new collisions when cells are under stress, causing replication stops.

Dans cette thèse, nous présentons un système de réplication optimiste pour les applications collaboratives asynchrones. Dans notre modèle, les réplicas travaillent de façon autonome et se synchronisent deux à deux afin d'assurer la propagation épidémique des écritures et la cohérence globale à terme des données. Nous avons conçu pour cela un protocole qui garantit des échanges incrémentaux. Il optimise la consommation de bande passante et simplifie la détection des mises-à-jour à intégrer. Il repose sur un mécanisme de journalisation des écritures. Ce mode de persistance offre de bonnes performances, une grande robustesse et un support simple pour l'évolution de schéma. Lorsque deux réplicas se synchronisent, des conflits peuvent apparaître. Pour y faire face, nous proposons un mécanisme d'horloge logique qui définit un ordre total sur les écritures, cohérent avec l'ordre temporel. Il permet de résoudre les mises-à-jour conflictuelles par un ordonnancement conforme à l'intuition pour les utilisateurs. D'autres types de conflits propres à l'application et à l'intégrité des données peuvent survenir. Le développeur d'applications dispose d'une interface de programmation pour définir des procédures de résolution spécifiques. Par ailleurs, nous présentons deux extensions au protocole de propagation épidémique pour le rendre exploitable à large échelle : le contrôle de la vitesse de convergence et la réplication partielle. En complément de la réplication des données, nous proposons un "framework" pour le déploiement dynamique des mises-à-jour du code et des ressources de l'application. Enfin, l'ensemble du système de réplication est illustré sur une application collaborative asynchrone, Pharos, qui permet le partage de recommandations dans des communautés d'intérêt.

Dans Escherichia coli la Dam Methyl Transferase (DamMT) est responsable du transfert d'un groupement méthyle sur les adénosines situés au cœur du tétranucléotide GATC; il s'agit donc d'une activité post réplicative. Ainsi, après le passage de la fourche de réplication, le brin d'ADN nouvellement synthétisé est non méthylé - l'ADN est dit hémimethylé. L'ADN reste hémimethylé pendent une brève période - de l'ordre de la minute - avant d'être reméthylé par la DamMT. L'hypothèse de l'implication de la méthylation de l'ADN dans le contrôle général du programme de maintenance de l'ADN repose essentiellement sur cette observation, puisque l'ADN hemimethyle - exception faite de l'origine de réplication et de la région promotrice du gène dnaA - est diagnostique du passage récent de la fourche de réplication. Cette hypothèse, et le criblage phylogénomique qui en a découlé a conduit a l'identification de plusieurs gènes dont les produits sont supposes être impliqués dans la maintenance de l'ADN. yjaG est l'un de ces gènes. Il a été renomme cycC en raison des dérèglements de la progression du cycle cellulaire associés a un mutant nul de ce gène. L'étude effectuée au cours de ma thèse s'attachera à expliquer l'état actuel de nos connaissances sur la protéine CycC et de son implication dans le processus de réplication de l'ADN. Nos résultats montrent que la protéine CycC est impliquée dans la processivité de la réplication lorsqu'il y a un dommage au niveau de l'ADN. CycC spécifie une activité qui conduit à freiner les fourches de réplication, afin de prévenir des avortements des réplisomes. La surexpression de CycC bloque l'initiation de la réplication entre l'ouverture de la molécule d'ADN et le chargement de l'hélicase réplicative. Nous proposons que CycC interagisse avec le complexe réplicative et ralentit les fourches de réplication. Ce ralentissement prévient de nouvelles collisions lorsque les cellules sont dans des conditions de stress-qui cause des arrêts de la réplication.

Les sites fragiles communs (SFC) sont des loci instables en cas de stress réplicatif et des lieux préférentiels de réarrangements dans les tumeurs. Les SFC sont associés aux plus grands gènes du génome et il a été proposé que la transcription de ces gènes soit à l'origine de cassures de l'ADN. Cependant, de nombreux grands gènes transcrits ne sont pas fragiles. Un second modèle, celui de notre laboratoire, associe la fragilité des SFC à un programme de réplication particulier, combinant pauvreté en événements d'initiation et réplication tardive. Il serait alors possible que la transcription soit liée à leur programme de réplication, ce qui conduirait à la fragilité. Pour mieux comprendre ces relations, j'ai modifié la transcription de deux grands gènes et analysé les conséquences sur leur réplication et leur fragilité. Ces manipulations génétiques sont réalisées dans le modèle aviaire DT40, qui permet la modification ciblée d'ADN par recombinaison homologue avec une grande efficacité. De façon surprenante, j'ai observé que la fragilité d'un grand gène est diminuée aussi bien en abolissant sa transcription qu'en l'augmentant. J'ai étudié la densité en événements d'initiation par peignage moléculaire au locus et le programme temporel de réplication dans des clones présentant des niveaux différents de transcription. J'ai ainsi pu montrer que la surexpression massive de deux grands gènes avance le programme temporel de la réplication, les préservant de la fragilité. Au cours de ma thèse, j'ai donc montré que la transcription exerce des effets antagonistes sur la stabilité du génome, bénéfiques ou délétères, selon le niveau d'expression des grands gènes associés aux SFC. / Common Fragile Sites (CFSs) are loci displaying instability upon replicative stress, which localization correlates with chromosomal rearrangements in tumours. CFSs are associated with the largest genes of the genome and it has been proposed that their transcription leads to DNA breaks. However, many transcribed large genes are not fragile. Our laboratory proposed an alternative model in which CFS instability results from a specific replication program, combining late replication with paucity in initiation events. To reconcile the two models, we hypothesized that transcription impacts the replication programs. In order to characterize those potential relationships, I manipulated the transcription of two large genes associated with CFSs and determined the consequences of these manipulations on replication and fragility. I used chicken DT40 cells to perform these analyses because this cellular model allows efficient engineering of specific DNA sequences by homologous recombination. Surprisingly, I observed that increasing or suppressing transcription of large gene both lead to a decrease fragility. I then analyzed clones displaying variable transcription levels. I determined the distribution and density of initiation event, using molecular combing at two loci, as well as the profiles of replication timing along the genes. I showed that a massive overexpression of two large genes led to an earlier replication timing. Overall, my results highlight the opposite effects of transcription on genome stability, which range from beneficial to deleterious depending on the expression level of large genes associated with CFSs.

La duplication de l'ADN au cours de la phase S est initiée à partir de l'activation de plusieurs dizaines de milliers d'origines de réplication. La mise en place des origines a lieu au cours de la phase G1 sous la forme de complexe de pré-réplication (pré-RC) et leur activation est orchestrée par un programme spatio-temporel. La régulation spatiale détermine les origines qui seront activées et la régulation temporelle, ou timing de réplication, détermine le moment de leur activation. En effet, toutes ces origines ne sont pas activées en même temps durant la phase S : certaines origines seront activées en début de phase S, d'autre en milieu, ou d'autre à la fin. Ce programme est établi en tout début de phase G1, au " point de décision du timing ". C'est un programme très robuste qui signe l'identité d'une cellule, son état de différenciation et le type cellulaire à laquelle elle appartient. Il a aussi été montré qu'il est altéré dans des situations pathologiques, en particulier le cancer, sans qu'on ne comprenne très bien les raisons mécanistiques. De manière générale, les mécanismes moléculaires qui régulent le timing de réplication sont méconnus. Le premier volet de ma thèse a permis l'identification d'un nouveau régulateur du timing de réplication : il s'agit de l'ADN polymérase spécialisée Thêta. Recrutée à la chromatine très tôt en phase G1, elle interagit avec des composants du pré-RC, et régule le recrutement des hélicases réplicatives à la chromatine. Enfin, sa déplétion ou sa surexpression entraîne une modification du timing de réplication à l'échelle du génome. Dans la deuxième partie de ma thèse, j'ai exploré les mécanismes qui régulent ce programme temporel d'activation des origines suite à un stress réplicatif. J'ai identifié un mécanisme de régulation transgénérationnel inédit : la modification du timing de réplication de domaines chromosomiques ayant subi un stress réplicatif au cycle cellulaire précédent. Des cellules-filles issues d'une cellule ayant subi des problèmes de réplication dans des domaines fragiles (riches en AT, et donc potentiellement structurés, et pauvres en origines) présentent un timing plus précoce de l'activation des origines au niveau de ces domaines. Ce nouveau processus biologique d'adaptation est particulièrement intéressant dans un contexte tumoral de haut stress réplicatif chronique car ce pourrait être un moyen pour la cellule tumorale de survivre à son propre stress réplicatif mais aussi aux thérapies antitumorales qui sont nombreuses à cibler la réplication de l'ADN. / DNA duplication in S phase starts from thousands of initiation sites called DNA replication origins. These replication origins are set in G1 as pre-replication complexes (pre-RC) and fired in S phase following a spatio-temporal program of activation. This program determines which origins will be fired and when. Indeed, all the origins are not fired in the same time and we can distinguish early, middle and late replication origins. This temporal regulation is called "replication timing" and is determined at the "timing decision point" (TDP) in early G1. It's a robust program, which participates to the definition of cell identity, in term of differentiation state or cell type. However, the precise molecular mechanisms involved are poorly understood. Defective timing program has been evidenced in pathological contexts, in particular in cancers, but the mechanisms of this deregulation remain unclear. In the first part of my PhD, I contributed to the discovery of a new regulator of the origin timing program: the specialized DNA polymerase Theta (Pol Theta). Pol Theta is loaded onto chromatin in early G1, coimmunoprecipitates with pre-RC components and modulates the recruitment of Mcm helicases at TDP. Moreover, depletion or overexpression of Pol Theta modifies the timing of replication at a fraction of chromosomal domains. The second part of my work aimed at exploring the mechanisms that regulates replication timing after a replicative stress. I identified a totally new transgenerational adaptive mechanism of DNA replication timing regulation: the modification of the timing of origin activation at chromosomal domains that have suffered from a replicative stress during the previous cell cycle. Daughter cells from a cell that has experienced replication stress at particular domains (late replicating domains, AT rich so they can form structured DNA, and poor in origin density) shows advanced origin activation within these regions. This new biological process in response to replicative stress could be of particular interest in the context of cancer since, tumor cells are characterized by high level of intrinsic chronic replicative stress. This new mechanism may favor cancer cell survival despite replication stress, particularly upon treatments with anti-tumor agents that target DNA.