Chez les Eucaryotes, les télomères sont indispensables au maintien de la stabilité du génome. Leur structure unique permet à la cellule de différencier entre les extrémités des chromosomes et les cassures doubles brin de l’ADN, prévenant ainsi leurs fusions. Au fil des générations, les télomères subissent un raccourcissement dû aux problèmes de réplication des extrémités, provoquant ainsi l’entrée des cellules en sénescence. Comme chez les mammifères, chez la levure, la télomérase permet la réplication complète de ces extrémités prévenant ainsi un vieillissement prématuré de ces cellules. Lors de la tumorigenèse, dans la plupart des cas, la télomérase est réactivée. Celle-ci permet de rallonger(1) en continu les télomères procurant aux cellules la capacité d’échapper à la sénescence. Dans d’autres cas, la télomérase n’est pas réactivée, les télomères sont maintenus par des mécanismes alternatifs(2). D’autres caractéristiques sont attribuées aux cellules tumorales comme l’inactivation(3) des points de contrôle du cycle cellulaire (IPC) permettant à ces cellules de se diviser anarchiquement en présence de dommage à l’ADN. Plusieurs questions restent en suspens : comment se fait cette inactivation ? Existent-ils d’autres facteurs génétiques qui favorisent cette inactivation ? Comment traiter et/ou arrêter la prolifération anarchique de ces cellules ? Afin de mieux comprendre les événements et les facteurs génétiques qui favorisent l’IPC, nous avons utilisé un modèle précédemment développé dans notre laboratoire chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Ces cellules disposent de télomères entièrement déprotégés et érodés ainsi que de nombreuses caractéristiques (1,2,3) des cellules tumorales. Grâce à des expériences de génétique et de microscopies, nous avons pu d’abord caractériser ces cellules ; ensuite, identifier un groupe de gènes (CDC5, TID1 et PTC2.) impliqués dans l’IPC, via un processus appelé « Adaptation ». De plus, lors de l’adaptation, l’expression de plusieurs autres gènes (MOG1, YMR018W, YFL061W) est modulée. Toutefois, leurs fonctions sont encore à déterminer. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés au rôle de la protéine Cdc13 dans la protection et la réplication des télomères. Cdc13 fait partie d’un complexe (Cdc13/Stn1/Ten1) qui est hautement conservé lors de l’évolution appelée CST (chez l’Homme : hCtc1, hStn1, hTen1). Grâce à l’étude in vivo de différents mutants de Cdc13, par diverses stratégies, nous avons pu mettre en évidence de nouvelles caractéristiques biochimiques telles que la dimérisation ainsi que les interfaces requises pour celle-ci. De plus, à l’aide de techniques de microscopie nous avons pu identifier le rôle fonctionnel de deux des cinq domaines de la protéine Cdc13 dans la localisation subcellulaire. Ces dernières découvertes nous ont permis d’apporter une nouvelle interprétation concernant les défauts de protection relatifs à l’allèle cdc13-1 dans la biologie des télomères. Ces défauts ressemblent étroitement à ceux observés dans des cas de maladies du vieillissement prématuré, associées à des mutations de la protéine hCtc1 humaine.

Dans les cellules eucaryotes, les extrémités des chromosomes linéaires sont protégées par une structure nucléoprotéique, appelée télomère. Un télomère non fonctionnel peut induire des réarrangements de chromosomes et d’instabilité génomique, et ainsi, contribuer au vieillissement ou au développement de cancers. L’instabilité génomique est initiée par une réparation nuisible des extrémités chromosomiques, dont certains aspects sont régulés par la principale kinase du cycle cellulaire, Cdc28 (ou Cdk1 pour Cyclin dependant kinase 1), chez Saccharomyces cerevisiae. Par exemple, la déstabilisation des télomères induite par l’inactivation de la protéine Cdc13, une des protéines de la coiffe protectrice du télomère, conduit à la résection extensive et non contrôlée des extrémités des chromosomes, promue par la kinase Cdc28. La kinase Cdc28 n’est pas en mesure d’accomplir ses fonctions par elle-même; elle est activée à l’aide d’une de ses neuf différentes sous-unités auxiliaires, appelées cyclines. Les cyclines sont non seulement responsables pour activer, mais aussi pour guider la kinase vers de substrats spécifiques lors l’exécution de ses nombreuses tâches. Alors, l’objectif des travaux de maîtrise fut de définir la contribution des sous-unités individuelles de cyclines, dans la dégradation des télomères non fonctionnels. Suite à la déprotection contrôlée des télomères par l’inactivation de la protéine Cdc13, l’effet des délétions de trois groupes de cyclines, cyclines précoces de la phase S, de la phase S ou de la phase M sur la croissance et sur la structure des télomères ont été déterminés. En fonction des résultats obtenus, aucune simple délétion de cyclines de la phase S ne semble avoir un effet sur la dégradation des télomères. En général, les résultats pour les doubles délétions sont cohérents avec les observations faites avec les simples délétions, sauf que certaines doubles délétions de cyclines de la phase S combinée avec l’allèle cdc13-1 ont montrées une croissance détériorée et une accumulation plus élevée d’ADN sb aux télomères que les contrôles pertinents. Pourtant, aucune de ces doubles délétions ne supprime le phénotype de thermosensibilité d’allèle cdc13-1. Cependant, la viabilité des cellules cdc13-1 contenant de triples délétions de S cyclines est gravement compromise par rapport au contrôle, les cellules cdc13-1, à une température semi-permissive, malgré que les niveaux de l’AND sb aux télomères et l’activation de la DDR sont comparables à ceux du contrôle. Il est proposé que ceci pourrait refléter un effet combiné des délétions de cyclines et de Cdc13 sur la réplication ou, encore, une limitation de la technique utilisée pour la détection de l’ADN sb. À l’aide de l’expression contrôlée de Clb5, l’effet d’élimination de toutes les cyclines de la phase S a pu être étudié. Les résultats démontrent que la résection aux télomères et l’activation de la DDR suite à la déprotection ne sont pas réprimées en absence de toutes les cyclines de la phase S. Ces résultats suggèrent que les cyclines mitotiques sont probablement responsables pour l’accumulation d’ADN simple brin observée aux télomères déprotégés, mais l’expérimentation pour confirmer ou écarter cette possibilité n’était pas réalisée durant le terme de cette maîtrise. Un deuxième objectif de mes travaux de maîtrise fut la mise au point dans notre laboratoire d’une technique basée sur la PCR quantitative qui permet de quantifier l’ADN simple brin et de suivre la dynamique de la résection aux télomères non fonctionnels, appelée QAOS (d’anglais Quantitative Amplification of Single-stranded DNA). La technique QAOS qui a été mise au point lors de ma maîtrise nous a permis de confirmer les résultats obtenus par la technique de l’hybridation non dénaturante.

Most cellular proteins retain a stable concentration as cells grow and divide, but there are exceptions. Some cell cycle regulators change in concentration with cell size. In fission yeast, Cdc13 (cyclin B), an important activator of the core cell cycle kinase Cdc2 (CDK1), increases in concentration as cells grow. It has been proposed that the concentration of such cell cycle regulators serves as a proxy for cell size and makes cell cycle progression dependent on cell size, thereby contributing to cell size homeostasis. The underlying mechanisms for the size-dependent scaling of these cell cycle regulators are poorly understood. Here, I show that Cdc13 protein concentration, but not mRNA concentration, increases with cell size. Furthermore, only the nuclear, but not the cytoplasmic, fraction of Cdc13 increases in concentration as cell size increases. Computational modeling along with half-life measurements suggests that stabilization of Cdc13 in the nucleus plays an important role in establishing this pattern. Taken together, my results suggest that Cdc13 scales with time, and therefore only indirectly—not directly—with cell size. This leaves open the possibility that Cdc13 contributes to cell size homeostasis, but in a different way than originally proposed. / Master of Science / Cells maintain their size very efficiently, but how they manage to do so is not well characterized. It has been suggested that cells sense their size by the size-dependent concentration changes of cell cycle proteins. I have investigated how cyclin B may serve as such a proxy for cell size in fission yeast. My data suggest that fission yeast cyclin B indirectly scales with cell size through an unknown time-based mechanism.

Les cassures double-brins d’ADN (CDBs) constituent une menace pour la viabilité cellulaire et l’intégrité du génome puisque l’absence de la réparation d’une CDB pourrait conduire à la mort cellulaire. En plus de la réparation par jonction d’extrémités nonhomologues (NHEJ) en phase G1 et de la recombinaison homologue (RH) en phase S et G2, les CDBs peuvent être réparées par l’ajout de télomères par l’action de la télomérase; un phénomène qui s’appelle l’ajout de télomères de novo. Ce phénomène pourrait mettre en danger la stabilité génomique parce qu’il engendre, dans la plupart des cas, une perte du bras chromosomique du fragment non-centromérique. En conséquence, ceci engendre soit une perte de l’hétérozygotie (LOH) dans les cellules diploïdes ou la mort cellulaire dans les cellules haploïdes. Dans le but d’empêcher la formation de télomères de novo, la cellule possède des mécanismes et des voies qui préviennent l’action inappropriée de la télomérase à des CDBs. Une des principales questions dans le domaine est de comprendre comment la cellule inhibe l’ajout de télomères de novo par la télomérase en favorisant la réparation des CDBs par les autres voies (NHEJ et la RH).Dans ce projet, nous utilisons la technique d’hybridation in situ en fluorescence (FISH) sur le facteur limitant de la télomérase, l’ARN TLC1 de la levure S. cerevisiae. Nous avons pu montrer que l’ARN TLC1 fait un trafic intranucléaire durant le cycle cellulaire des cellules sauvages. En phase G1/S, l’ARN TLC1 adopte une localisation nucléoplasmique avec les télomères, alors qu’il s’accumule au nucléole en phase G2/M. Nous avons fait l’hypothèse que l’accumulation de l’ARN TLC1 au nucléole en G2/M pourrait réduire la compétition entre la RH, qui est exclusivement nucléoplasmique, et la télomérase pour la réparation des CDBs. Pour tester cette hypothèse, nous avons employé la bléomycine (blm), un composé chimique générant des CDBs, pour traiter des cellules sauvages ou déficientes de la RH par la délétion du gène RAD52. Nous avons observé que l’ARN TLC1 conserve une localisation nucléolaire dans les cellules sauvages traitées par la blm en phase G2/M, alors que dans lescellules délétées de RAD52 exposées à la blm, l’ARN TLC1 se localise maintenant au nucléoplasme et s’associe partiellement aux sites de cassures. De plus, nous avons trouvé que l’accumulation nucléoplasmique de l’ARN TLC1 dans les cellules délétéées de RAD52 traitées à la blm, dépend de la voie de dommage à l’ADN (MRX, ATM/Tel1 et ATR/Mec1) et de la sumoylation par la SUMO E3ligase, Siz1. Plus particulièrement, l’association de la télomérase à des CDBs dépend de son interaction avec Cdc13, une protéine qui recrute la télomérase aux télomères. D’une manière surprenante, nous avons observé une accumulation rapide de Cdc13 à des CDBs en absence de Rad52, bien que nos résultats suggèrent que Rad52 empêche l’accumulation de l’ARN TLC1 au nucléoplasme par l’inhibition de l’accumulation de Cdc13 aux sites de cassures. L’ensemble de nos résultats ont mis en évidence que la télomérase est normalement exclue des sites de la réparation d’ADN. Cependant, en absence d’une voie fonctionnelle de la RH, la télomérase se localise du nucléole au nucléoplasme et s’accumule partiellement à des CDBs d’une manière dépendante de Cdc13 et Siz1. / DNA double-strand breaks (DSB) constitute a threat to genome integrity and cell survival if they are not repaired. In addition to canonical DNA repair systems such as nonhomologous end joining (NHEJ) in G1 and homologous recombination (HR) in S and G2 phases, DSBs can also be repaired by addition of new telomeres by telomerase. This phenomenon is referred to as telomere healing or de novo telomere addition. This process threatens genome stability since it results in chromosome arm loss, which could be lethal in haploid cells and lead to loss of heterozygosity (LOH) in diploid cells. Therefore, cells possess mechanisms that prevent the untimely action of telomerase on DSBs. One of the questions driving this field is to understand how telomere addition by telomerase is inhibited and DSBs repair can be efficiently performed by canonical DSB repair (NHEJ and HR). In this project, we used fluorescent in situ hybridization (FISH) to detect the endogenous TLC1 RNA, which is the limiting component of telomerase of the budding yeast. Using this technique, we found that TLC1 RNA traffics inside the nucleus during the cell cycle of wild-type cells. In G1 and S phases, TLC1 RNA adopts a nucleoplasmic localization, which is related to its function in telomere elongation, while it accumulates in the nucleolus in G2/M. We hypothesize that the nucleolar accumulation of TLC1 RNA in G2/M may reduce the possibility that telomerase interferes with HR to repair DNA DSB, since HR is excluded from the nucleolus and occurs only in the nucleoplasm. To test this hypothesis, we treated wild-type and rad52 (HR deficient cells) with bleomycin, a radiomimetic agent that generates preferentially DSBs. Our results show that after induction of DSB with bleomycin, TLC1 RNA remains nucleolar in wild-type cells in G2/M, but accumulates in the nucleoplasm and colocalizes partially with DSBs sites in rad52 cells, suggesting that RAD52 inhibits the nucleoplasmic accumulation of TLC1 RNA in the presence of DSBs. Nucleoplasmic accumulation of TLC1 RNA after DSB induction requires the DNA damage pathway (MRX, ATM/Tel1 and ATR/Mec1), and the SUMO ligase E3 Siz1. Interestingly, association of TLC1 RNA with DSBs depends on the single-strand telomeric binding protein Cdc13, which rapidly accumulates at sites of DNA damage, while Rad52 suppresses this process by inhibiting Cdc13 accumulation at DSBs. These results suggest that telomerase is normally excluded from sites of DNA repair. In the absence of functional homologous recombination, telomerase leaves the nucleolus and accumulates partially at DSB in the nucleoplasm in a Cdc13- and Siz1-dependent manner.