Les Archaea sont des micro-organismes rencontrés dans tous les écosystèmes, mais qui apparaissent comme majoritaires dans les environnements dits extrêmes. Les archaea hyperthermophiles, comme Pyrococcus abyssi sont en permanence exposées à des températures qui peuvent augmenter le taux de dommages de l'ADN, pourtant, le taux de mutations spontanés chez ces micro-organismes est similaire à celui des espèces modèles mésophiles. Il est ainsi probable que les hyperthermophiles possèdent des systèmes particulièrement efficaces pour dupliquer, maintenir et stabiliser leur génome. L'objectif de ce projet était d'explorer le réseau d'interaction impliqué dans les processus de réplication et de réparation de l'ADN. L'approche méthodologique mise en oeuvre a consisté à coupler la capture de partenaires d'interaction par pull-down avec leur identification par spectrométrie de masse. J'ai pu ainsi mettre en évidence, au sein l'extrait cellulaire de P. abyssi, un réseau préliminaire reliant des protéines de la maintenance génomique. Nous avons non seulement mis en évidence de nouvelles protéines impliquées probablement dans des mécanismes de réparation, mais également des nouvelles interactions non suspectées entre des composants déjà caractérisés. Les principaux résultats sont les suivants : (1) La nucléase Pab2263, partenaire du PCNA, est un nouvel acteur du métabolisme de l'ADN. (2) Le PCNA forme un macrocomplexe avec les protéines ubiquitaires Mre11 et Rad50 suggérant un rôle de ce complexe dans la réparation des cassures double brin de l'ADN lors de la réplication. (3) Les protéines Fen1 et l'ADN primase interagissent physiquement et peuvent collaborer in vitro pour résoudre une étape intermédiaire de la voie de réparation par excision de base. Ces résultats enrichissent notre compréhension des processus de réparation de l'ADN chez les archées.

L'organisation de la chromatine a une importance fonctionnelle pour contrôler le programme d'expression des gènes. Par contre, les liens qui l'unissent au déroulement de la réplication de l'ADN sont beaucoup moins connus. Grâce à des approches basées sur la capture d'interactions chromosomiques et sur l'imagerie cellulaire, nous avons étudié les liens entre le repliement à grande échelle de la chromatine et le timing de réplication. Cette analyse, effectuée dans des cellules humaines lymphoblastoïdes, des cellules mononucléées du sang (PBMC) et des cellules issues d'une leucémie myéloïde à caractère érythrocytaire, a permis l'identification de domaines structuraux du noyau. Ces domaines sont relativement isolés les uns des autres et leurs frontières coïncident avec les zones d'initiation précoce. De plus, notre étude montre que ces zones d'initiation précoce interagissent préférentiellement, aussi bien entre voisins immédiats (séparation génomique de l'ordre de la mégabase) que le long du chromosome entier. Les loci répliqués tardivement interagissent eux-aussi avec leurs homologues, conduisant, dans l'espace nucléaire, à une ségrégation des loci en fonction de leur timing de réplication. Ces résultats sont soutenus par des mesures de distances sur des hybridations in-situ qui montrent que les loci répliqués en début de phase S sont plus proches qu'attendus. Nos travaux révèlent enfin que l'organisation de la chromatine est similaire dans des cellules en phase G0 (PBMC dormantes), démontrant qu'elle n'est pas spécifique des cellules en phase S. Pris ensemble, ces résultats apportent des preuves directes d'une organisation robuste de la chromatine, partagée par les cellules en cycle et dormantes, et corrélée au timing de réplication à différentes échelles.

Au cours de ma thèse au sein du laboratoire du Professeur Michelle Debatisse, je me suis intéressé aux mécanismes maintenant la stabilité du génome et contrôlant la dynamique de réplication dans les cellules de mammifères. J'ai étudié le rôle des kinases ATR (" Ataxia Telangectasia and Rad3 related ") et Chk1 (" Checkpoint Kinase 1 "), du point de contrôle intra-S (" checkpoint "), dans le contrôle de la dynamique de réplication. Cette première étude m'a amené à étudier la relation entre les dommages à l'ADN et la dynamique de réplication, dans des modèles cellulaires déficients pour des facteurs de la réponse aux dommages à l'ADN (DDR), appartenant soit au " checkpoint ", soit à la voie de réparation par recombinaison homologue (HR), tels que Rad51 et BRCA2. Je montre ici, que le ralentissement des fourches de réplication et l'augmentation de la densité d'événements d'initiation, observés dans des cellules déficientes pour Chk1 ou Rad51, sont la conséquence indirecte des lésions apparaissant spontanément dans de telles cellules. Le ralentissement des fourches dans ces cellules dépend d'une perturbation de la disponibilité en précurseurs de nucléotides qui dépend de la sur-expression et/ou de la re-localisation de la sous-unité p53R2 de la ribonucléotide réductase (RNR). De plus, contrairement à ce qui était proposé, je montre que Chk1 n'a pas de rôle actif dans la répression des origines latentes, mais que c'est la vitesse des fourches qui détermine l'espacement entre les origines actives, par un mécanisme de compensation découvert auparavant au laboratoire (Anglana, 2003 ; Courbet, 2008). L'ensemble de mes résultats permet de proposer un mécanisme général de communication entre la réplication et la réparation. Ce mécanisme confère un avantage aux cellules, puisque le ralentissement des fourches stabilise la machinerie de réplication qui voyage sur une matrice endommagée, et l'activation d'origines latentes procure une source de sauvetage pour les fourches bloquées.

La réplication de l’ADN est un processus essentiel qui doit avoir lieu une seule fois par cycle cellulaire. Ce processus hautement régulé et très conservé chez les eucaryotes, assure une complète duplication et donc une totale transmission de l’information génétique. Des changements dans le programme de réplication, qui est définit par le moment d’activation et la fréquence d’utilisation de l’ensemble des origines, ont été observés lors du développement, après induction de la différenciation chez des cellules souches embryonnaires de souris, ainsi que dans un grand nombre de cancers. La régulation de la réplication de l’ADN est donc un processus essentiel pour le maintien de l’intégrité du génome et le programme de réplication pourrait y contribuer de manière importante. Cependant, en dépit d’un grand nombre de travaux sur les différentes protéines et modifications impliquées dans la sélection des origines, les principaux déterminants ainsi que leur interdépendance restent étonnement méconnus. Mon projet de thèse se focalise sur l’identification des paramètres clés qui régulent le programme de réplication, en utilisant comme modèle la levure de fission, Schizosaccharomyces pombe. Premièrement, je me suis intéressé au rôle de la dynamique de l’activité des CDKs lors de la phase G1 ainsi que de leur niveau d’activité à la frontière G1/S dans la sélection des origines. J’ai démontré que changer la longueur de la phase G1 à travers la modulation de l’activité des CDKs se traduit par une modification du profil de réplication tout au long du génome. Plus précisément, les origines inefficaces sont utilisées plus fréquemment alors que les origines efficaces ont une activité réduite. D’un autre coté, nous avons également montré que le nombre d’origines actives pour une phase S donnée, dépend du niveau d’activité des CDKs lors de l’entrée en phase S, suggérant ainsi que cette activité est un facteur limitant dans la régulation de l’initiation de la réplication. Dans un second temps, j’ai utilisé une approche dans laquelle les cellules établissent un programme de réplication de novo après la sortie de quiescence, afin d’étudier les premières étapes de la sélection des origines de réplication, en se focalisant sur l’importance du recrutement de ORC (Origin Recognition Complex) aux origines. L’analyse du profil de liaison de ORC révèle une forte corrélation entre le niveau de liaison de ORC aux origines et l’efficacité de ces dernières, démontrant pour la première fois que ORC n’est pas simplement un marqueur des sites d’initiation potentiels mais plutôt un déterminant crucial dans l’établissement du programme de réplication. Finalement, j’ai observé que les origines efficaces ont tendance à être organisées en groupes tout au long du génome, suggérant que l’organisation chromosomique pourrait être importante dans la sélection des origines de réplication. Afin d’étudier cela, j’ai généré des souches contenant différents réarrangements chromosomiques. Nos résultats indiquent que la position relative d’une origines par rapport à son contexte chromosomique, joue un rôle important dans la régulation de son efficacité et que des régions distinctes peuvent avoir des effets opposés sur la sélection des origines en étant soit activatrices ou inhibitrices. / DNA replication is an essential process that occurs only once in a cell cycle before cell division. Replication is highly regulated through conserved mechanisms to ensure the faithful duplication and transmission of genetic information. Interestingly, changes in the replication program, defined by the temporal and spatial pattern of replication origin activation, have been observed during development in distinct cell types, after induction of differentiation in mouse embryonic stem cells, and in various cancers. The regulation of DNA replication is therefore essential for ensuring the integrity of the genome, and the program of origin activation may be an important contributor to this process. However, despite a large body of work on the many enzymes and modifications involved in origin selection, the critical determinants as well as their interdependence remain surprisingly unknown. My thesis project focuses on identifying the key parameters that regulate the replication program, taking advantage of unique approaches using the fission yeast Schizosaccharomyces pombe as a model system. First, we investigated the qualitative and quantitative aspects of the role of CDK activity in determining the program of DNA replication. We demonstrated that changing the length of G1 phase through modulation of CDK activity has an impact on the profile of replication initiation along the chromosome. More specifically, inefficient origins show increases in their usage, while efficient origins have reduced activities. Moreover, we have shown that cells are highly sensitive to differences in CDK activity levels at the G1/S transition, which result in genome-wide changes in replication initiation across the entire spectrum of efficiencies. This suggests that CDK activity is a dose-dependent, limiting factor in the regulation of origin usage. Thus, our study establishes the integration of both temporal and quantitative regulation of CDK activity as a key determinant in defining the program of genome duplication. Second, using an approach in which cells establish a replication program de novo after exit from quiescence, we investigated the critical first steps of origin selection. We focused on the importance of the essential Origin Recognition Complex, whose recruitment to origins is required for the subsequent assembly of replication complexes. Our analysis reveals a strong correspondence between the level of ORC binding at origins and the efficiency of these origins in both cells exiting quiescence as well as those in vegetative growth conditions. Therefore, we demonstrate for the first time that ORC is not simply a marker of potential initiation sites but rather a crucial determinant in the program of origin usage.Finally, our observation that efficient origins are organized in distinct clusters in the de novo replication program suggested that chromosomal organization may be important for origin selection. To address this question, we have generated strains containing a series of distinct chromosomal rearrangements and assessed their origin efficiency profiles. Our findings indicate that the localization of an origin with respect to its chromosomal context plays an important role in regulating its efficiency. Moreover, distinct regions may have different effects on origin selection by being permissive or inhibitory for origin activity. Those observations could indicate a role for the spatial organization of the genome in origin selection and thus led us to study chromosome and nuclear organization in conditions where the replication program is different.

La mitochondrie est une organelle essentielle possédant son propre ADN circulaire. Cet ADN peut présenter des mutations et/ou des délétions, consécutives à l’exposition à différents types de dommages ou en raison de protéines mutées. Ces mutations ou délétions sont impliquées dans de nombreuses pathologies, dont les cancers, et le vieillissement. Leur apparition peut survenir notamment lors de la réplication ou de la réparation. A ce jour, la réplication et la réparation mitochondriales ne sont pas encore bien élucidées. L’objectif de ce projet est donc de mieux en appréhender les mécanismes et de mieux comprendre l’émergence d’anomalies en nous intéressant plus particulièrement à une délétion appelée « Common Deletion ». Ce travail reposait sur l’hypothèse que cette délétion put résulter d’une mauvaise réparation de cassure(s) double-brin et/ou d’une erreur durant la réplication de l’ADN mitochondrial. L’analyse de ces résultats révèle que la formation de la « Common Deletion » ne nécessite qu’une seule cassure double-brin proche des séquences répétées entourant cette dernière et implique les protéines de la réplication de l’ADN mitochondrial. Ainsi, ce travail permet de mieux saisir les mécanismes de réplication et de réparation assurant la stabilité de l’ADN mitochondrial. Un second projet a été de proposer un modèle d’étude in vitro des topoisomérases en utilisant des minicercles d’ADN permettant la visualisation du complexe covalent, étape clef de la réaction de relaxation de ces enzymes. / Mitochondria is an essential organelle with its own circular DNA. This DNA may exhibit mutations and/or deletions, as a result of exposure to different types of damage or due to mutated proteins. These mutations or deletions are involved in many pathologies, including cancers, and aging. They may occur during replication or repair. For now, mitochondrial replication and repair have not yet been fully elucidated. The objective of this project is therefore to better understand the mechanisms and the emergence of anomalies by focusing on a deletion called "Common Deletion". This work was based on the assumption that this deletion could result from poor repair of double-strand break(s) and/or error during mitochondrial DNA replication. Analysis of these results reveals that the formation of the "Common Deletion" requires only a single double-strand break close to the repeated sequences surrounding the latter and involves the proteins of mitochondrial DNA replication. Thus, this work makes it possible to better understand the mechanisms of replication and repair ensuring the stability of mitochondrial DNA. A second project was to propose an in vitro model for topoisomerases using DNA minicircles allowing visualization of the covalent complex, a key step in the relaxation reaction of these enzymes.

L’objectif de cette thèse a été de comprendre deux caractéristiques majeures des divisions méiotiques chez la femelle: le blocage en prophase de 1ère division méiotique qui permet à l’ovocyte d’accumuler des réserves énergétiques et des déterminants nécessaires au développement embryonnaire ; et l’absence de phase-S entre les deux divisions méiotiques ce qui permet de former des cellules haploïdes aptes à la fécondation. Pour cela, j’ai choisi comme modèle d’étude l’ovocyte de Xénope qui permet de suivre ces processus in vitro en réponse à la progestérone. L’ovocyte subit les deux divisions méiotiques grâce à l’activation du facteur universel de la division cellulaire, le MPF, et se bloque en métaphase de 2ème division méiotique dans l’attente d’être fécondé. Chez tous les vertébrés, le 1er arrêt en prophase dépend de l’activité de la protéine kinase dépendante de l’AMPc, PKA, dont l’inactivation est nécessaire pour la reprise de la méiose. Le substrat de PKA dans l’ovocyte était resté inconnu. Nous avons découvert que la protéine Arpp19, jusqu’alors connue pour son rôle positif dans l’activation du MPF, est phosphorylée par PKA de cette phosphorylation bloque l’activation du MPF nécessaire pour la levée du blocage en prophase. ARPP19 possède donc un double rôle, le 1er exercé comme substrat de PKA et responsable de l’arrêt en prophase, le second dans l’activation du MPF suite à un changement dans sa phosphorylation. Dans un second temps, nous avons étudié la protéine Cdc6, un acteur majeur de la réplication de l’ADN. Absente en prophase, Cdc6 s’accumule entre les deux divisions méiotiques ce qui permet à l’ovocyte d’acquérir la compétence à répliquer l’ADN. Cette compétence ne s’exprime pas ce qui permet de réduire de moitié la ploïdie. Nous avons montré que Cdc6 est un inhibiteur puissant du MPF capable de bloquer les divisions méiotiques et d’induire la réplication de l’ADN. Pour éviter ces effets délétères l’accumulation de Cdc6 est strictement régulée lors des deux divisions méiotiques, ce qui est absolument requis pour assurer l’enchainement des deux divisions cellulaires sans phase-S intercalaire. / The goal of my PhD project was to understand two main features of the female meiotic division: the arrest in prophase of the 1st meiotic division that allows the accumulation of nutrients and determinants necessary for the embryonic cell cycles; and the absence of S-phase between the two meiotic divisions in order to produce haploid gametes. For this purpose, I studied Xenopus oocytes, a powerful model system that allows the biochemical analysis of these two processes in vitro. In ovary, oocytes are arrested in prophase I and resume meiosis in response to progesterone. The oocytes then proceed through the 1st and the 2nd meiotic divisions and halt at metaphase II, awaiting for fertilization. These two consecutive divisions are controlled by two waves of Cdk1 activation, the universal factor responsible for the entry into mitosis. I analysed the mechanisms responsible for arresting the oocyte in prophase I. In all vertebrates, this arrest depends on a high activity of the cAMP-dependent protein kinase, PKA, whose downregulation is required for the release of the prophase block. The substrate of PKA had never been identified up to date. I discovered that the small protein Arpp19, already known for positively regulating entry into M-phase, is phosphorylated by PKA in prophase I and is dephosphorylated upon progesterone addition, an event required for Cdk1 activation. Hence, Arpp19 has a dual function, responsible of the prophase arrest as a PKA substrate, and then converted into an activator of Cdk1 by changes of its phosphorylation pattern. The second part of my thesis has been dedicated to understanding the role and the regulation of the Cdc6 protein during meiotic divisions. This protein is essential for DNA replication in somatic cells. It is accumulated between the two oocyte meiotic divisions and restores the competence to replicate DNA in oocyte. However, this competence is repressed before fertilization, allowing formation of haploid cells. I found that the accumulation of Cdc6 is tightly controlled during meiotic maturation by the Cyclin B accumulation and the Mos/MAPK pathway. I further demonstrated that Cdc6 is a strong inhibitor of Cdk1 in Xenopus oocytes and that the timely accumulation of Cdc6 is required to coordinate the two meiotic divisions with no intercaling S-phase.

L’implantation retardée ou diapause embryonnaire décrit l'arrêt ou le retardement pendant l'embryogenèse. Chez le vison, la diapause est corrélée avec une sécrétion pituitaire insuffisante de la prolactine, ayant pour résultat la différentiation incomplète du corpus luteum et réduction de la progestérone. Des études antérieures suggèrent que le blastocyste de vison en diapause demeure dans un état de quiescence ou se développe lentement. Pour élucider ceci, la réplication de l'ADN a été étudiée. Les résultats démontrent synthèse de l’ADN et prolifération cellulaire dans les embryons au stade de morula, avant la diapause et dans les blastocystes après la réactivation. La réplication de l'ADN a été également détectée dans des blastocystes en diapause et en diapause prolongée. L'implantation est considérée comme une interaction bidirectionnelle entre le blastocyste et l'utérus. Il a été montré que les prostaglandines sont importantes pour la vascularisation de l’utérus au moment de l’implantation et peuvent réactiver l'utérus des visons après la diapause. La concentration protéinique et la localisation de la phospholipase citosolique A2 (CPLA2) et de la cyclooxygenase 2 (COX2) ont été étudiées dans l'utérus de vison. L’expression de la CPLA2 et COX2 étaient sur-régulées au moment de l'implantation. Il est connu que la prolactine active les corpus luteum des visons. L'idée de un lien entre la prolactine et la voie de signalisation des prostaglandines a été testée en mesurant les récepteurs de prolactine. Les résultats montrent une augmentation de l’expression des récepteurs de prolactine à l'implantation suggérant que la prolactine pourrait activer la voie de prostaglandine à l'utérus par son propre récepteur. La conclusion, les embryons pendant la diapause ne sont pas arrêtées complètement et les protéines liées à la voie de prostaglandine sont implique dans la réactivation de l'utérus. / Delayed implantation or diapause describes arrest or retardation during embryogenesis. In mink, diapause is related to insufficient pituitary prolactin secretion, resulting in incomplete differentiation of the corpus luteum with reduced progesterone concentration. The mink blastocyst at diapause was believed to be totally quiescent or expanding at a low rate. To explore this, DNA replication was studied. Results showed synthesis of DNA, and thus cell proliferation at the morulae stage before diapause and at the blastocyst following activation. DNA replication was detected not only at diapause but also at extended diapause. Furthermore, implantation is considered as a two-way interaction between the blastocyst and the uterus. It has been shown that prostaglandins are important for vascularization of the uterus and products of the prostaglandin pathway could reactivate the mink uterus following diapause. Protein concentration and localization was studied for cytosolic phospholipase A2 (CPLA2) and cyclooxygenase 2 (COX2) in mink uterus. Expression of CPLA2 and COX2 was up regulated at implantation. It is know that prolactin is the factor that activates the mink corpus luteum. The idea of a link between prolactin and prostaglandin pathway was investigated by quantifying the prolactin receptors in the uterus. Results showed an increase of prolactin receptors at implantation suggesting that prolactin could activate the prostaglandin pathway at the uterus through its own receptor. In conclusion, embryos during diapause are not completely arrested, and proteins related to the prostaglandin pathway are implicated in reactivation of the uterus.

La réplication de l'ADN chez les eucaryotes commence lorsque le complexe de reconnaissance de l'origine (ORC) se lie à l'ADN puis recrute les facteurs nécessaires à la duplication du génome. Bien que les mécanismes biochimiques et les facteurs impliqués dans l'initiation de la réplication semblent être conservés, les séquences d'ADN (les origines de réplication) sur lesquelles ces événements ont lieu ne le sont pas. L'ensemble des données connues suggèrent fortement un rôle prépondérant de la mise en place des origines de réplication dans la structuration du génome et l'organisation des autres processus cellulaires lors de la différenciation. Comprendre la coordination de ces processus in vivo et au cours du développement est primordial pour déchiffrer la régulation cellulaire dans son contexte réel. Le modèle du développement embryonnaire du nématode C.elegans constitue un outil génétique de premier choix pour l'étude de la mise en place des origines de réplication au cours du développement. Au cours de ma thèse, j'ai dû premièrement développer une technique de culture de C.elegans synchronisée en grosse échelle, afin d'obtenir le matériel nécessaire pour identifier les origines de réplication. Cette technique nous a aussi permis de caractériser, pour la première fois, la croissance synchronisée en bioréacteur d'un métazoaire. D'autre part, l'étude des origines de réplication a révélé une distribution hétérogène des origines de réplication dans les chromosomes qui corrèle avec des domaines de certaines marques épigénétiques, une corrélation avec des séquences d'ADN capables de former des structures cruciformes de l'ADN, ainsi comme une confirmation de la corrélation avec la transcription. Nous avons aussi vu que la corrélation de origines de réplication avec des CpG, est fortement établie après le début de la gastrulation, et que l'association avec des éléments fonctionnels spécifiques du génome, comme les operons, est perdu une fois la transcription embryonnaire deviens nécessaire après la gastrulation. L'ensemble de résultats suggèrent fortement un changement dans l'organisation des origines de réplication après gastrulation, qui corrèle avec des éléments fonctionnels du génome. / Eukaryotic DNA replication begins when the origin recognition complexes (ORC) binds to DNA and recruits the necessary factors for genome duplication. Even though, biochemical mechanisms as well as the factors involved seem to be well conserved, the DNA sequences (replication origins) where these events take place are not. The known data strongly suggest that replication origins establishment may play an important role in genome structuring as well as in the organization of other cellular processes during cell differentiation. To understand how these processes are coordinated in vivo and during development, is essential for deciphering cellular regulation in its real context. C.elegans embryonic development is a genetic tool of first choice for studying replication origins in vivo and their correlation with other genome features and processes during development.During my thesis and with the aim of obtaining enough material for the replication origins identification method, I've had to develop a new technique of synchronized high-scale liquid culture of the nematode C.elegans. This technique has allowed the characterization for the first time of the synchronize growth of a metazoan in bioreactor. Furthermore, the study of replication origins has revealed a heterogenic distribution of replication origins along chromosomes that correlates with specific epigenetic marks. Moreover, replication origins are strongly associated with specific DNA structures able to form cruciforms, and we have confirmed the correlation of replication origins and transcription. This study also show that the association of replication origins with CpGs is greatly increased after gastrulation, and that the association with some genetic elements, such as operons, is reduced after gastrulation begins. Taken together these results show a change of replication origins before and after cell differentiation during embryonic development that correlate with functional genome elements.

L’ubiquitylation est une modification post-transcriptionelle qui est nécessaire pour la dégradation des protéines mais aussi pour la régulation et la localisation de nombreux facteurs. Un grand nombre de protéines impliquées dans la réplication de l’ADN et dans la réponse aux lésions de l’ADN sont ubiquitylées. L’ubiquitylation durant la réponse aux dommages de l’ADN dépend de l’enzyme d’activation de l’ubiquitine UBA1 qui est située au sommet de la cascade d’ubiquitination. Durant ma thèse, j’ai mis à jour le mécanisme de recrutement d’UBA1 au niveau de l’ADN endommagé ainsi qu’un rôle majeur de l’ubiquitylation dans la voie de signalisation ATR.A l’aide d’une approche in vitro qui mime la voie de signalisation ATR, j’ai montré qu’UBA1 est recrutée au niveau de molécules d’ADN linéaire et qu’elle est nécessaire à l’ubiquitylation des protéines recrutées sur ce substrat. J’ai également découvert que l’ubiquitylation et le recrutement d’UBA1 in vitro sont dépendants de la kinase DNA-PKcs et de la poly(ADP-ribose) polymérase PARP1, deux senseurs majeurs des lésions de l’ADN. Il apparait que PARP1 régule le recrutement d’UBA1 via la formation de chaines de poly(ADP)-ribose (PAR). De plus, j’ai montré qu’UBA1 est capable de se lier aux chaines PAR. J’ai identifié la région d’UBA1 capable d’interagir avec les chaines PAR : il apparait que cette région est désorganisée et riche en acide aminés hydrophobes. La comparaison de la protéine UBA1 de levure et la protéine UBA6 humaine qui ne lient pas PAR nous a permis d’identifier les acides aminées hydrophobes nécessaires pour la lésion à PAR.J’ai aussi démontré qu’UBA1 est nécessaire pour la réponse aux lésions de l’ADN. En effet, l’inhibition ou la déplétion d’UBA1 conduit à une perte de la phosphorylation de Chk1 dans notre système in vitro. De même, le traitement avec des molécules induisant des lésions de l’ADN telles que le CPT, le MMS et la bléocine conduit à une phosphorylation moindre de Chk1 lorsqu’UBA1 est inhibée. Afin de démontrer que la liaison d’UBA1 aux chaines PAR est cruciale pour la réponse aux dommages, j’ai mis en place un système in vivo permettant d’exprimer des mutants d’UBA1 incapable de lier les chaines PAR.Globalement mes résultats indiquent qu’UBA1 est recrutée au niveau de l’ADN endommagé à l’aide de PARP1 et DNA-PKcs. Plus précisément, il apparait que la liaison avec les chaines PAR et l’ubiquitylation de protéines spécifiques est nécessaire pour la mise en place de la voie de signalisation ATR. L’importance d’UBA1 dans le processus est soulignée par le fait que son inhibition ou son inactivation conduit à une phosphorylation moindre de Chk1. Il est raisonnable de penser que des inhibiteurs d’UBA1 puissent être utilisés pour cibler la voie ATR dans les cellules cancéreuses. Finalement, cette étude devrait permettre de mieux comprendre comment les interactions entre les processus d’ubiquitylation et de PARylation permettent de réguler la réponse aux dommages. / Ubiquitylation is an important posttranslational modification that is necessary for protein degradation as well as for the regulation and the localization of many cellular factors. A number of proteins implicated in DNA replication and DNA damage response are ubiquitylated. Ubiquitylation during the DNA damage response is selectively dependent on the ubiquitin-activating enzyme UBA1, which functions at the apex of the ubiquitylation cascade. In this thesis, I describe the mechanism of UBA1 recruited at damaged sites and uncover the role of ubiquitylation in ATR signaling.Using a cell free system developed in the lab that recapitulates ATR kinase-signaling pathway, I present evidence that, UBA1 is recruited to linear DNA substrates and mediate ubiquitylation of DNA-bound proteins. I found that protein ubiquitylation and the recruitment of UBA1 to DNA in cell-free extracts was dependent on the kinase DNA-PKcs and on the poly ADP-ribose polymerase PARP1, two sensors of DNA lesions. PARP1 regulates UBA1 recruitment in large part through poly (ADP)-ribose (PAR) chain formation. UBA1 exhibited affinity for PARP1 and for PAR chains. Furthermore, we have identified minimal region on UBA1 which is prominently hydrophobic and disordered region of UBA1 which are required for its PAR binding activity. Through comparison with yeast UBA1 and human UBA6 which failed to bind with PAR chains, we identified hydrophobic amino acid residues which are critical for PAR binding.I also show evidence that UBA1 is required for efficient DNA damage signaling. In a cell free system, chemical inhibition or siRNA depletion of UBA1 led to the loss of ChK1 phosphorylation, suggesting that UBA1 activity is required for efficient DNA damage response. Consistent with these observations, when cells were treated with DNA lesion inducing drugs like CPT, MMS and Bleocin, we observed less efficient Chk1 phosphorylation. I have developed UBA1 replacement system to demonstrate functional significance of mutation in PAR binding residues of UBA in DNA damage response.Collectively, these results indicate that UBA1 is recruited to DNA damaged sites in a DNA-PKcs and PARP1 dependent-manner, in a larger part through its interaction with PAR chains and that protein ubiquitylation on DNA damages is necessary for the assembly of a productive ATR signaling complex. The importance of role of UBA1 in DNA damage response is underscored by the finding that UBA1 inhibition leads to inefficient Chk1 phosphorylation which is required for efficient DNA damage response. Thus, UBA1 inhibitors could be used to target ATR signaling in cancer cells. This study should eventually lead us to provide more insights on how cell maintains genome integrity through crosstalk between posttranslational modifications including ubiquitylation and PARylation.

Les organismes cellulaires appartiennent à l'un des trois domaines du vivant : Archaea, Bacteria, Eucarya. Les Archaea sont des organismes unicellulaires avec un phénotype bactérien mais qui possèdent de nombreux caractères moléculaires eucaryotes. En particulier, la machinerie de réplication archéenne est une version homologue et simplifiée de celle des eucaryotes. Au cours de cette thèse, j'ai étudié la réplication de l'ADN chez les Archaea en combinant des approches in vitro et in silico.<br />Premièrement, j'ai essayé de purifier la protéine initiatrice de la réplication Cdc6/Orc1, sous une forme native, dans l'espoir de mettre au point le premier système de réplication de l'ADN in vitro chez les Archaea. Malheureusement, cette approche a été infructueuse en raison de l'instabilité et des propriétés d'agrégation de la protéine.<br />Deuxièmement, j'ai réalisé une analyse comparative du contexte génomique des gènes de réplication dans les génomes d'Archaea. Cette analyse nous a permis d'identifier une association très conservée entre des gènes de la réplication et des gènes liés au ribosome. Cette organisation suggère l'existence d'un mécanisme de couplage entre la réplication de l'ADN et la traduction. De manière remarquable, des données expérimentales obtenues chez des modèles bactériens et eucaryotes appuient cette idée. J'ai ensuite mis au point des outils expérimentaux qui permettront d'éprouver la pertinence biologique de certaines des prédictions effectuées.<br />Finalement, j'ai examiné la distribution taxonomique des gènes de la réplication dans les génomes d'Archaea afin de prédire la composition probable de la machinerie de réplication de l'ADN chez le dernier ancêtre commun des Archaea. Dans leur ensemble, les profils phylétiques des gènes de la réplication suggèrent que la machinerie ancestrale était plus complexe que celle des organismes archéens contemporains.