Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La mitochondrie est une organelle essentielle possédant son propre ADN circulaire. Cet ADN peut présenter des mutations et/ou des délétions, consécutives à l’exposition à différents types de dommages ou en raison de protéines mutées. Ces mutations ou délétions sont impliquées dans de nombreuses pathologies, dont les cancers, et le vieillissement. Leur apparition peut survenir notamment lors de la réplication ou de la réparation. A ce jour, la réplication et la réparation mitochondriales ne sont pas encore bien élucidées. L’objectif de ce projet est donc de mieux en appréhender les mécanismes et de mieux comprendre l’émergence d’anomalies en nous intéressant plus particulièrement à une délétion appelée « Common Deletion ». Ce travail reposait sur l’hypothèse que cette délétion put résulter d’une mauvaise réparation de cassure(s) double-brin et/ou d’une erreur durant la réplication de l’ADN mitochondrial. L’analyse de ces résultats révèle que la formation de la « Common Deletion » ne nécessite qu’une seule cassure double-brin proche des séquences répétées entourant cette dernière et implique les protéines de la réplication de l’ADN mitochondrial. Ainsi, ce travail permet de mieux saisir les mécanismes de réplication et de réparation assurant la stabilité de l’ADN mitochondrial. Un second projet a été de proposer un modèle d’étude in vitro des topoisomérases en utilisant des minicercles d’ADN permettant la visualisation du complexe covalent, étape clef de la réaction de relaxation de ces enzymes. / Mitochondria is an essential organelle with its own circular DNA. This DNA may exhibit mutations and/or deletions, as a result of exposure to different types of damage or due to mutated proteins. These mutations or deletions are involved in many pathologies, including cancers, and aging. They may occur during replication or repair. For now, mitochondrial replication and repair have not yet been fully elucidated. The objective of this project is therefore to better understand the mechanisms and the emergence of anomalies by focusing on a deletion called "Common Deletion". This work was based on the assumption that this deletion could result from poor repair of double-strand break(s) and/or error during mitochondrial DNA replication. Analysis of these results reveals that the formation of the "Common Deletion" requires only a single double-strand break close to the repeated sequences surrounding the latter and involves the proteins of mitochondrial DNA replication. Thus, this work makes it possible to better understand the mechanisms of replication and repair ensuring the stability of mitochondrial DNA. A second project was to propose an in vitro model for topoisomerases using DNA minicircles allowing visualization of the covalent complex, a key step in the relaxation reaction of these enzymes.

Les petites molécules bioactives sont des acteurs clés dans la recherche biomédicale et les études de chimie biologiques, pour leur application potentielle comme sondes moléculaires pour enquêter les systèmes biologiques, et la possibilité de développer de nouveaux traitements puissants et sélectifs. Dans ce travail, nous avons exploré l'utilisation de plusieurs classes de petites molécules capables d'interférer avec des cibles biologiquement significatives, comme les acides nucléiques et les lysosomes, et déclencher des réponses biologiques. A partir de l'étoposide, l'un des agents anti-néoplasiques le plus employé en clinique, nous avons développé une nouvelle classe de petites molécules actives capables de cibler différemment les deux isoformes humaines de la topoisomérase II, TOP2A et TOP2B, qui jouent des rôles différents dans l'inhibition de la croissance des cellules cancéreuses, et le développement de tumeurs malignes secondaires. Dans un autre projet, nous avons utilisé une stratégie d'étiquetage « click in situ » pour enquêter sur la localisation subcellulaire d'un nouvel inhibiteur de la réaction d'échange nucléotidique des protéines Arf, un outil potentiel pour l'étude du trafic cellulaire et la signalisation liés a ces protéines. Enfin, nous avons étudié l'origine de l'efficacité d'un nouveau agent de ciblage du compartiment lysosomal: l'artesumycin, un hybride moléculaire des petites molécules bioactives la marmycine A et l'artésunate, qui possède une activité antiproliferative accrue en comparaison avec les deux produits naturels utilisés indépendamment. Nos résultats fournissent une précieuse contribution dans ces domaines de recherche. / Bioactive small molecules are key players in biomedical research and chemical biology studies given their potential application as molecular probes to investigate biological system, together with the possibility to develop new potent and selective therapeutics. In this work, we explored the use of several classes of small molecules able to interfere with therapeutically relevant targets, from nucleic acids to lysosomes, and evaluate ensuing biological responses. Starting from etoposide, one of the most clinically employed anti-neoplastic agents, we developed a new class of active small molecules able to differentially target the two human topoisomerase II isoforms, TOP2A and TOP2B, which have been shown to play different roles in inhibiting cancer cell growth and initiating secondary malignancies. In a separate project, we aimed to use an in situ click labelling strategies to investigate the subcellular localization of a new inhibitor of the nucleotide exchange reaction of Arf proteins, a potential tool for the study of Arf-related cellular trafficking and signalling. Finally, we studied the origins of the synergy displayed by the new lysosome targeting agent artesumycin, a molecular hybrid of the bioactive small molecules marmycin A and artesunate, which has been shown to possess enhanced antiproliferative activity in comparison to the two natural product used independently. Our results provide valuable contributions for future advances in these research areas.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les travaux réalisés au cours de cette Thèse avaient pour but de caractériser au niveau fonctionnel la protéine FAM110B, identifiée au laboratoire il y a plusieurs années par une méthode de sélection d’éléments génétiques suppresseurs destinée à rechercher de nouveaux gènes impliqués dans la sensibilité à un inhibiteur de Topoisomérase II, la 9-hydroxyéllipticine. Localisée au niveau cytoplasmique et très conservée chez les mammifères, FAM110B est essentielle à la survie comme le montre le blocage en phase S des cellules dans lesquelles son expression est transitoirement diminuée. Sa répression conduit d’ailleurs à l’inhibition de plusieurs voies impliquées dans la prolifération cellulaire comme les voies Wnt, Notch ou TGF-. Les résultats que nous avons obtenus suggèrent que ce rôle dans la prolifération peut être régulé par l’interaction de FAM110B avec la β-caténine. Cette interaction régule le niveau d’expression de la β-caténine et/ou sa localisation, ce qui a pour conséquence directe de moduler l’expression de ses gènes cibles impliqués dans la prolifération cellulaire. Nous avons également démontré que FAM110B intervient dans les processus de migration cellulaire en régulant directement ou indirectement l’expression de la E-cadhérine par la modulation sélective de l’expression d’un de ses répresseurs, Slug. L’augmentation de l’expression de la E-cadhérine dans des cellules sousexprimant FAM110B est accompagnée d’une diminution de l’expression de la N-cadhérine, un phénomène qui est fréquemment observé lors de la reverse EMT, passage d’un stade mésenchymateux à un stade épithélial au cours duquel, des cellules à caractère invasif et métastatique acquièrent des propriétés adhésives associées à une perte de leur propriétés de migration et d’invasion. Enfin, nous avons pu démontrer que FAM110B est également impliquée dans la sensibilité cellulaire à divers agents anticancéreux. Sa répression induit une sensibilisation à la camptothécine et au cisplatine alors qu’elle confère une résistance aux poisons de tubuline (taxol et vincritine) et aux inhibiteurs de Topoisomérases II par diminution du nombre de complexes de clivage ADN-enzyme associée à une réduction du niveau de Topo2 dont on ne connait pas encore l’origine. L’ensemble de nos résultats confirment l’importance de FAM110B dans la migration et la prolifération cellulaire ainsi que dans la réponse aux stress induits par diverses classes d’agents anticancéreux. De ce fait, FAM110B peut être considérée comme une nouvelle cible potentielle en cancérologie et son inhibition être utilisée pour potentialiser l’action de thérapeutiques existantes tels que les dérivés de la camptothécine ou les dérivés du platine qui sont largement utilisés en clinique. / FAM110B is a new protein that was identified several years ago in our laboratory by a functional screen, the selection of genetic suppressor elements (GSEs), which goal was to identify new genes involved in the cellular sensitivity to the topoisomerase II inhibitor 9-hydroxyellipticine. FAM110B is localized in the cytoplasm and is extremely conserved across mammals. We found that FAM110B is essential for cell survival, as its transient repression induces a blockage in the S phase of the cell cycle. Its repression also induces the inhibition of various pathways involved in the regulation of cell proliferation, such as Wnt, Notch or TGF-. Our results suggest that its role in cell proliferation relies on FAM110B interaction with β-catenin. This interaction regulates β-catenin expression and its subcellular localization, which directly impacts on the expression of its target genes involved in cell proliferation. We have also demonstrated that FAM110B is involved in cell migration by regulating the expression of E-cadherin via the specific modulation of one of its repressors, Slug. Increase in E-cadherin expression in cells with downregulated FAM110B is accompanied by a decrease in N-cadherin expression, a phenomenon which is reminiscent of a reverse EMT i.e. a mesenchymal to epithelial transition which is characterized by a loss of invasiveness and metastatic potential. Finally, we also showed that FAM110B is involved in the regulation of the cellular sensitivity to various anticancer agents. Transient repression of FAM110B sensitizes cells to camptothecin and cisplatin, whereas it confers a resistant phenotype to tubuline poisons (taxol and vincristine) and Top2 inhibitors. This latter effect is accompanied by a reduction in DNA-Topo2 cleavage complexes due to a reduction in Topo2 levels by a mechanism which is not fully elucidated. Together, our results confirm the importance of FAM110B in essential processes such as migration, cell proliferation, and cell response to various stresses induced by chemotherapeutic agents. Therefore, FAM110B can be considered as a new potential target for cancer treatment and its inhibition can also be used to potentiate existing treatments such as camptothecin derivatives and platinum compounds that are widely used in the clinic.

Les ADN-Topoisomérases (Topo) de type I et II sont des enzymes essentielles à la suppression des surenroulements de engendrés par la plupart des transactions de l’ADN. Elles sont des cibles de médicaments anticancéreux très utilisés en clinique. Parmi eux, les inhibiteurs de Topo1 de la famille des camptothécines (CPT) exercent leur cytotoxicité en produisant des cassures double-brin de l’ADN provenant de la collision des fourches de réplications avec les complexes ADN-Topo1 stabilisés par ces inhibiteurs. Les dérivés de CPT sont approuvés pour le traitement des cancers coliques, de l’ovaire et du poumon, mais il existe de multiples mécanismes de résistance à ces agents qui sont à l’origine de l’échec du traitement. Les cancers de la prostate sont réfractaires aux CPT, mais très peu d’études ont été réalisées pour expliquer cette résistance « intrinsèque ». Ce travail de thèse visait à identifier les mécanismes de cette résistance en nous appuyant (1) sur des résultats antérieurs de l’équipe montrant que l’interaction entre la DNA-PKcs, une kinase impliquée dans la réparation de l’ADN par recombinaison non-homologue, et la Topo1 pouvait réguler la sensibilité aux CPT de manière indépendante de la réparation de l’ADN et (2) sur une étude ayant mis en évidence une interaction entre DNA-PKcs et le facteur de transcription ERG dont le gène est remanié dans plus de 50% des tumeurs de prostate. Nos résultats montrent pour la première fois que ERG est effectivement impliqué dans la régulation de la réponse aux CPT dans la lignée VCaP présentant un gène de fusion TMPRSS2-ERG. La répression de ERG dans la lignée VCaP induit une sensibilisation à la CPT mais pas à l’étoposide (un inhibiteur de Topo2) et est accompagnée d’une augmentation du nombre de complexes ADN/Topo1. Ce mécanisme peut-être soit lié à un effet de ERG sur l’interaction DNA-PKcs/Topo1 ou à une régulation transcriptionnelle de gènes impliqués dans la réponse aux CPT incluant la Topo1 elle-même. Nous avons confirmé cette deuxième hypothèse, en démontrant que ERG régule la transcription du micro ARN miR-24 et que l’expression de Topo1 est également sous contrôle de miR-24 dans la lignée VCaP. Des résultats similaires ont été obtenus dans la lignée LNCaP (présentant le gène de fusion TMPRSS2-ETV1) dans laquelle la répression de ETV1 confère aussi une sensibilisation à la CPT. Au cours de notre travail nous avons également recherché des inhibiteurs de l’interaction entre la DNA-PKcs et Topo1 afin de pouvoir utiliser ces composés comme agents de potentialisation des dérivés de CPT en clinique. Les résultats du criblage d’une banque de 320 composés naturels réalisé par la technologie AlphaScreen n’ont malheureusement pu identifier que des inhibiteurs catalytiques de Topo1. Nous avons néanmoins pu montrer que l’un d’entre eux, la mahanimbine, présentait une forte activité cytotoxique vis-à-vis de lignées résistantes aux dérivés de CPT et vis-à-vis de la lignée VCaP ce qui permet d’envisager le développement de nouvelles classes d’inhibiteurs catalytiques Topo1 pouvant contourner la résistance des dérivés de CPT en clinique. / Type I and II DNA Topoisomerases (Top) are essential enzymes involved in the removal of DNA torsional constraints induced by most DNA transactions. They are the targets of various anticancer agents used in the clinic. Among them, Top1 inhibitors from the camptothecins (CPT) family exert their cytotoxicity by producing DNA double-strand breaks that are generated by the collision of advancing replication forks with DNA-Top1 complexes that are stabilized by these inhibitors. CPT derivatives are approved for the treatment of colon, ovary and lung cancers but resistance mechanisms are developed and lead to treatment failure. Prostate cancers are refractory to CPT, but few studies have addressed the mechanisms of such “intrinsic” resistance. This work was aimed at identifying such mechanisms based on (1) previous results from the laboratory showing that interaction of Top1 with DNA-PKcs, a kinase that is essential for non-homologous end-joining, could regulate cell sensitivity to CPT independently of DNA repair and (2) a study that showed an interaction of DNA-PKcs with ERG, a transcription factor from the ETS family which is rearranged in more than 50% of prostate tumors. Our results show for the first time that ERG is indeed involved in the regulation of prostate cancer cell response to CPT as its repression sensitized VCaP cells displaying the TMPRSS2-ERG gene fusion to CPT but not to the Top2 inhibitor etoposide. This effect is accompanied with an increase in Top1-DNA complexes. This could be due to either an effect of ERG on DNA-PKcs/Top1 interaction, or to the transcriptional regulation of genes involved in cell response to CPT, including Top1 itself. We confirmed the latter hypothesis by showing that ERG can regulate the transcription levels of the microRNA miR-24 and that Top1 expression relies, at least in part, on miR24 levels in VCaP cells. We obtained similar results in LNCaP cells (characterized by a TMPRSS2-ETV1 gene fusion), in which ETV1 repression also sensitizes cells to CPT. In parallel, we also searched for inhibitors of DNA-PKcs/Top1 interaction in order to use these compounds to potentiate CPT derivatives in the clinic. We screened a chemical library of 320 natural compounds using the AlphaScreen technology. The results were disappointing as we only identified compounds that are catalytic inhibitors of Top1. Nevertheless, we could show that among them, mahanimbine displayed a potent cytotoxic activity towards CPT-resistant colon cancer cell lines and could efficiently inhibit the growth of VCaP cells that are highly resistant to CPT. This opens new avenues for the development of new classes of Top1 catalytic inhibitors that could be used to circumvent the clinical resistance to CPT derivatives.

Les facteurs de transcription STAT3 sont activés et impliqués dans le développement tumoral par leurs effets sur la prolifération et la survie cellulaire. Lorsque STAT3 est phosphorylé sur la tyrosine 705, il semble impliqué dans la transformation cellulaire et dans l'échappement aux traitements classiques de chimiothérapie. Un second site de phosphorylation sur la sérine 727 a été décrit mais son implication dans la régulation de l'activité de STAT3 en réponse aux traitements a été peu étudiée. Nous nous sommes donc intéressés au rôle de la phosphorylation de la sérine 727 de STAT3 dans la réponse de lignées cellulaires colorectales aux agents génotoxiques et plus particulièrement aux inhibiteurs de topoisomérases de type I. Le traitement entraine une perte de la transcription de la cycline D1 et de myc, gènes cibles de STAT3 phosphorylée sur tyrosine 705 et une activation de la kinase cdk5. Cette dernière va phosphoryler STAT3 sur son résidu sérine 727 ce qui va lui permettre de se fixer sur le promoteur du gène de la protéine de réparation Eme1, pour activer sa transcription. Ceci permet la réparation des dommages de l'ADN induits par le Sn38 et entraine une diminution de la sensibilité au traitement. D'autre part, l'inhibition des topoisomérases entraine une perte de la protéine myc normalement liée au promoteur d'Aurora A en phase G2/M et qui, associée au recrutement des répresseurs mad et miz aboutit à l'inhibition de la transcription de la kinase Aurora A. Une inhibition de la séparation des centrosomes est alors observée et entraine un arrêt en phase G2/M. En plus de la régulation de l'activité transcriptionnelle de STAT3 phosphorylée sur la sérine, nous nous sommes intéressés aux partenaires protéiques du facteur de transcription en réponse à sa phosphorylation. Par l'intermédiaire de la technique du double hybride et de la spectrométrie de masse, nous avons pu mettre en évidence deux nouveaux partenaires potentiels de STAT3. D'abord DDB2, protéine impliquée dans l'entrée en sénescence et dans la méthylation de l'ADN. Puis, ASPP2, une protéine qui confère à p53 une meilleure affinité de fixation à certains de ses promoteurs. Nous pensons que la phosphorylation de STAT3 sur la sérine 727 pourrait être impliquée dans l'induction de la sénescence et dans la réparation des dommages de l'ADN et que la cellule tumorale détournerait ces processus de protection pour réparer son ADN afin de résister au traitement. Les cellules pourraient alors proliférer avec un matériel génétique abimé, ce qui rendrait ces cellules instables sur le plan génomique. La détection de cette phosphorylation de STAT3 pourrait etre utilisée comme un marqueur de résistance aux inhibiteurs de topoisomérase. Ceci pourrait ainsi permettre de mieux prédire la réponse des patients à ce traitement.

Les ADN topoisomérases (Topos) sont des éléments essentiels de la vie cellulaire eucaryote et procaryote. Ces enzymes interviennent lors de la réplication, de la réparation et également lors de la transcription en modulant la topologie de l'ADN. L'ADN gyrase, une Topoisomérase IIA (TopoIIA) bactérienne particulière, est la seule topoisomérase capable de surenrouler l’ADN négativement en présence d’ATP, une activité indispensable au génome bactérien. Les différentes études structurales et fonctionnelles sur ces enzymes ont permis de proposer un mécanisme catalytique de surenroulement très sophistiqué mais la vision morcelée de ces complexes multi-­‐conformationnels laisse aujourd’hui de nombreuses questions mécanistiques en suspens. Ce travail de thèse a combiné une approche structurale et fonctionnelle pour essayer de répondre aux questions fondamentales mécanistiques encore non élucidées à propos des ADN topoisomérases de type II et à la découverte de nouveaux inhibiteurs « anti-­‐Topo » face à l’émergence de populations bactériennes résistantes aux traitements. / Type II DNA topoisomerases (Topo2A) remodel DNA topology during replication, transcription and chromosome segregation. Most TopoIIA are able to perform ATP-­‐dependent DNA relaxation or decatenation but the bacterial DNA gyraseis the sole type II DNA topoisomerase able to introduce negative supercoils. Several biochemical and structural studies haverevealed a highly sophisticated supercoiling catalytic mechanism but despite a wealth of information, the full architectureof Topo2A and the structural basis for DNA supercoiling remain elusive. Due to their physiological roles, topoisomerasesare also important targets for antibiotics targeting the bacterial enzyme but also anti-­‐cancer molecules inhibiting the humanprotein. This presented work has combinedboth structural and functional approach to answer the fundamental mechanisticquestions still unveiled and to discover new inhibitors against the emergence of resistant bacterial population.

Le surenroulement de l’ADN est important pour tous les processus cellulaires qui requièrent la séparation des brins de l’ADN. Il est régulé par l’activité enzymatique des topoisomérases. La gyrase (gyrA et gyrB) utilise l’ATP pour introduire des supertours négatifs dans l’ADN, alors que la topoisomérase I (topA) et la topoisomérase IV (parC et parE) les éliminent. Les cellules déficientes pour la topoisomérase I sont viables si elles ont des mutations compensatoires dans un des gènes codant pour une sous-unité de la gyrase. Ces mutations réduisent le niveau de surenroulement négatif du chromosome et permettent la croissance bactérienne. Une de ces mutations engendre la production d'une gyrase thermosensible. L’activité de surenroulement de la gyrase en absence de la topoisomérase I cause l’accumulation d’ADN hyper-surenroulé négativement à cause de la formation de R-loops. La surproduction de la RNase HI (rnhA), une enzyme qui dégrade l’ARN des R-loops, permet de prévenir l’accumulation d’un excès de surenroulement négatif. En absence de RNase HI, des R-loops sont aussi formés et peuvent être utilisés pour déclencher la réplication de l’ADN indépendamment du système normal oriC/DnaA, un phénomène connu sous le nom de « constitutive stable DNA replication » (cSDR). Pour mieux comprendre le lien entre la formation de R-loops et l’excès de surenroulement négatif, nous avons construit un mutant conditionnel topA rnhA gyrB(Ts) avec l’expression inductible de la RNase HI à partir d’un plasmide. Nous avons trouvé que l’ADN des cellules de ce mutant était excessivement relâché au lieu d'être hypersurenroulé négativement en conditions de pénurie de RNase HI. La relaxation de l’ADN a été montrée comme étant indépendante de l'activité de la topoisomérase IV. Les cellules du triple mutant topA rnhA gyrB(Ts) forment de très longs filaments remplis d’ADN, montrant ainsi un défaut de ségrégation des chromosomes. La surproduction de la topoisomérase III (topB), une enzyme qui peut effectuer la décaténation de l’ADN, a corrigé les problèmes de ségrégation sans toutefois restaurer le niveau de surenroulement de l’ADN. Nous avons constaté que des extraits protéiques du mutant topA rnhA gyrB(Ts) pouvaient inhiber l’activité de surenroulement négatif de la gyrase dans des extraits d’une souche sauvage, suggérant ainsi que la pénurie de RNase HI avait déclenché une réponse cellulaire d’inhibition de cette activité de la gyrase. De plus, des expériences in vivo et in vitro ont montré qu’en absence de RNase HI, l’activité ATP-dépendante de surenroulement négatif de la gyrase était inhibée, alors que l’activité ATP-indépendante de cette enzyme demeurait intacte. Des suppresseurs extragéniques du défaut de croissance du triple mutant topA rnhA gyrB(Ts) qui corrigent également les problèmes de surenroulement et de ségrégation des chromosomes ont pour la plupart été cartographiés dans des gènes impliqués dans la réplication de l’ADN, le métabolisme des R-loops, ou la formation de fimbriae. La deuxième partie de ce projet avait pour but de comprendre les rôles des topoisomérases de type IA (topoisomérase I et topoisomérase III) dans la ségrégation et la stabilité du génome de Escherichia coli. Pour étudier ces rôles, nous avons utilisé des approches de génétique combinées avec la cytométrie en flux, l’analyse de type Western blot et la microscopie. Nous avons constaté que le phénotype Par- et les défauts de ségrégation des chromosomes d’un mutant gyrB(Ts) avaient été corrigés en inactivant topA, mais uniquement en présence du gène topB. En outre, nous avons démontré que la surproduction de la topoisomérase III pouvait corriger le phénotype Par- du mutant gyrB(Ts) sans toutefois corriger les défauts de croissance de ce dernier. La surproduction de topoisomérase IV, enzyme responsable de la décaténation des chromosomes chez E. coli, ne pouvait pas remplacer la topoisomérase III. Nos résultats suggèrent que les topoisomérases de type IA jouent un rôle important dans la ségrégation des chromosomes lorsque la gyrase est inefficace. Pour étudier le rôle des topoisomérases de type IA dans la stabilité du génome, la troisième partie du projet, nous avons utilisé des approches génétiques combinées avec des tests de « spot » et la microscopie. Nous avons constaté que les cellules déficientes en topoisomérase I avaient des défauts de ségrégation de chromosomes et de croissance liés à un excès de surenroulement négatif, et que ces défauts pouvaient être corrigés en inactivant recQ, recA ou par la surproduction de la topoisomérase III. Le suppresseur extragénique oriC15::aph isolé dans la première partie du projet pouvait également corriger ces problèmes. Les cellules déficientes en topoisomérases de type IA formaient des très longs filaments remplis d’ADN d’apparence diffuse et réparti inégalement dans la cellule. Ces phénotypes pouvaient être partiellement corrigés par la surproduction de la RNase HI ou en inactivant recA, ou encore par des suppresseurs isolés dans la première partie du projet et impliques dans le cSDR (dnaT18::aph et rne59::aph). Donc, dans E. coli, les topoisomérases de type IA jouent un rôle dans la stabilité du génome en inhibant la réplication inappropriée à partir de oriC et de R-loops, et en empêchant les défauts de ségrégation liés à la recombinaison RecA-dépendante, par leur action avec RecQ. Les travaux rapportés ici révèlent que la réplication inappropriée et dérégulée est une source majeure de l’instabilité génomique. Empêcher la réplication inappropriée permet la ségrégation des chromosomes et le maintien d’un génome stable. La RNase HI et les topoisomérases de type IA jouent un rôle majeur dans la prévention de la réplication inappropriée. La RNase HI réalise cette tâche en modulant l’activité de surenroulement ATP-dependante de la gyrase, et en empêchant la réplication à partir des R-loops. Les topoisomérases de type IA assurent le maintien de la stabilité du génome en empêchant la réplication inappropriée à partir de oriC et des R-loops et en agissant avec RecQ pour résoudre des intermédiaires de recombinaison RecA-dépendants afin de permettre la ségrégation des chromosomes. / DNA supercoiling is important for all cellular processes that require strand separation and is regulated by the opposing enzymatic effects of DNA topoisomerases. Gyrase uses ATP to introduce negative supercoils while topoisomerase I (topA) and topoisomerase IV relax negative supercoils. Cells lacking topoisomerase I are only viable if they have compensatory mutations in gyrase genes that reduce the negative supercoiling level of the chromosome to allow bacterial growth. One such mutation leads to the production of a thermosensitive gyrase (gyrB(Ts)). Gyrase driven supercoiling during transcription in the absence of topoisomerase I causes the accumulation of hypernegatively supercoiled plasmid DNAs due to the formation of R-loops. Overproducing RNase HI (rnhA), an enzyme that degrades the RNA moiety of R-loops, prevents the accumulation of hypernegative supercoils. In the absence of RNase HI alone, R-loops are equally formed and can be used to prime DNA replication independently of oriC/DnaA, a phenomenon known as constitutive stable DNA replication (cSDR). To better understand the link between R-loop formation and hypernegative supercoiling, we constructed a conditional topA rnhA gyrB(Ts) mutant with RNase HI being conditionally expressed from a plasmid borne gene. We found that the DNA of topA rnhA gyrB(Ts) cells was extensively relaxed instead of being hypernegatively supercoiled following the depletion of RNase HI. Relaxation was found to be unrelated to the activity of topoisomerase IV. Cells of topA rnhA gyrB(Ts) formed long filaments full of DNA, consistent with segregation defect. Overproducing topoisomerase III (topB), an enzyme that can perform decatenation, corrected the segregation problems without restoring supercoiling. We found that extracts of topA rnhA gyrB(Ts) cells inhibited gyrase supercoiling activity of wild type cells extracts in vitro, suggesting that the depletion of RNase HI triggered a cell response that inhibited the supercoiling activity of gyrase. Gyrase supercoiling assays in vivo as well as in crude cell extracts revealed that the ATP dependent supercoiling reaction of gyrase was inhibited while the ATP independent relaxation reaction was unaffected. Genetic suppressors of a triple topA rnhA gyrB(Ts) strain that restored supercoiling and corrected the chromosome segregation defects mostly mapped to genes that affected DNA replication, R-loop metabolism and fimbriae formation. The second part of this project aimed at understanding the roles of type IA DNA topoisomerases (topoisomerase I and topoisomerase III) in chromosome segregation and genome maintenance in E. coli. To investigate the role of type IA DNA topoisomerases in chromosome segregation we employed genetic approaches combined with flow cytometry, Western blot analysis and microscopy (for the examination of cell morphology). We found that the Par- phenotypes (formation of large unsegregated nucleoid in midcell) and chromosome segregation defects of a gyrB(Ts) mutant at the nonpermissive temperature were corrected by deleting topA only in the presence of topB. Moreover, overproducing topoisomerase III was shown to correct the Par- phenotype without correcting the growth defect, but overproducing topoisomerase IV, the major cellular decatenase, failed to correct the defects. Our results suggest that type IA topoisomerases play a role in chromosome segregation when gyrase is inefficient. To investigate the role of type IA DNA topoisomerases in genome maintenance, in the third part of the project, we employed genetic approaches combined with suppressor screens, spot assays and microscopy. We found that cells lacking topoisomerase I suffered from supercoiling-dependent growth defects and chromosome segregation defects that could be corrected by deleting recQ, recA or overproducing topoisomerase III and by an oriC15::aph suppressor mutation isolated in the first part of the project. Cells lacking both type 1A topoisomerases formed very long filaments packed with diffuse and unsegregated DNA. Such phenotypes could be partially corrected by overproducing RNase HI or deleting recA, or by suppressor mutations isolated in the first part of the project, that affected cSDR (dnaT18::aph and rne59::aph). Thus, in E. coli, type IA DNA topoisomerases play a role in genome maintenance by inhibiting inappropriate replication from oriC and R-loops and by preventing RecA-dependent chromosome segregation defect through their action with RecQ. The work reported here reveals that inappropriate and unregulated replication is a major source of genome instability. Preventing such replication will ensures proper chromosome segregation leading to a stable genome. RNase HI and type IA DNA topoisomerases play a leading role in preventing unregulated replication. RNase HI achieves this role by modulating ATP dependent gyrase activity and by preventing replication from R-loops (cSDR). Type IA DNA topoisomerases ensure the maintenance of a stable genome by preventing inappropriate replication from oriC and R-loops and by acting with RecQ to prevent RecA dependent-chromosome segregation defects.

Le surenroulement de l’ADN est important pour tous les processus cellulaires qui requièrent la séparation des brins de l’ADN. Il est régulé par l’activité enzymatique des topoisomérases. La gyrase (gyrA et gyrB) utilise l’ATP pour introduire des supertours négatifs dans l’ADN, alors que la topoisomérase I (topA) et la topoisomérase IV (parC et parE) les éliminent. Les cellules déficientes pour la topoisomérase I sont viables si elles ont des mutations compensatoires dans un des gènes codant pour une sous-unité de la gyrase. Ces mutations réduisent le niveau de surenroulement négatif du chromosome et permettent la croissance bactérienne. Une de ces mutations engendre la production d'une gyrase thermosensible. L’activité de surenroulement de la gyrase en absence de la topoisomérase I cause l’accumulation d’ADN hyper-surenroulé négativement à cause de la formation de R-loops. La surproduction de la RNase HI (rnhA), une enzyme qui dégrade l’ARN des R-loops, permet de prévenir l’accumulation d’un excès de surenroulement négatif. En absence de RNase HI, des R-loops sont aussi formés et peuvent être utilisés pour déclencher la réplication de l’ADN indépendamment du système normal oriC/DnaA, un phénomène connu sous le nom de « constitutive stable DNA replication » (cSDR). Pour mieux comprendre le lien entre la formation de R-loops et l’excès de surenroulement négatif, nous avons construit un mutant conditionnel topA rnhA gyrB(Ts) avec l’expression inductible de la RNase HI à partir d’un plasmide. Nous avons trouvé que l’ADN des cellules de ce mutant était excessivement relâché au lieu d'être hypersurenroulé négativement en conditions de pénurie de RNase HI. La relaxation de l’ADN a été montrée comme étant indépendante de l'activité de la topoisomérase IV. Les cellules du triple mutant topA rnhA gyrB(Ts) forment de très longs filaments remplis d’ADN, montrant ainsi un défaut de ségrégation des chromosomes. La surproduction de la topoisomérase III (topB), une enzyme qui peut effectuer la décaténation de l’ADN, a corrigé les problèmes de ségrégation sans toutefois restaurer le niveau de surenroulement de l’ADN. Nous avons constaté que des extraits protéiques du mutant topA rnhA gyrB(Ts) pouvaient inhiber l’activité de surenroulement négatif de la gyrase dans des extraits d’une souche sauvage, suggérant ainsi que la pénurie de RNase HI avait déclenché une réponse cellulaire d’inhibition de cette activité de la gyrase. De plus, des expériences in vivo et in vitro ont montré qu’en absence de RNase HI, l’activité ATP-dépendante de surenroulement négatif de la gyrase était inhibée, alors que l’activité ATP-indépendante de cette enzyme demeurait intacte. Des suppresseurs extragéniques du défaut de croissance du triple mutant topA rnhA gyrB(Ts) qui corrigent également les problèmes de surenroulement et de ségrégation des chromosomes ont pour la plupart été cartographiés dans des gènes impliqués dans la réplication de l’ADN, le métabolisme des R-loops, ou la formation de fimbriae. La deuxième partie de ce projet avait pour but de comprendre les rôles des topoisomérases de type IA (topoisomérase I et topoisomérase III) dans la ségrégation et la stabilité du génome de Escherichia coli. Pour étudier ces rôles, nous avons utilisé des approches de génétique combinées avec la cytométrie en flux, l’analyse de type Western blot et la microscopie. Nous avons constaté que le phénotype Par- et les défauts de ségrégation des chromosomes d’un mutant gyrB(Ts) avaient été corrigés en inactivant topA, mais uniquement en présence du gène topB. En outre, nous avons démontré que la surproduction de la topoisomérase III pouvait corriger le phénotype Par- du mutant gyrB(Ts) sans toutefois corriger les défauts de croissance de ce dernier. La surproduction de topoisomérase IV, enzyme responsable de la décaténation des chromosomes chez E. coli, ne pouvait pas remplacer la topoisomérase III. Nos résultats suggèrent que les topoisomérases de type IA jouent un rôle important dans la ségrégation des chromosomes lorsque la gyrase est inefficace. Pour étudier le rôle des topoisomérases de type IA dans la stabilité du génome, la troisième partie du projet, nous avons utilisé des approches génétiques combinées avec des tests de « spot » et la microscopie. Nous avons constaté que les cellules déficientes en topoisomérase I avaient des défauts de ségrégation de chromosomes et de croissance liés à un excès de surenroulement négatif, et que ces défauts pouvaient être corrigés en inactivant recQ, recA ou par la surproduction de la topoisomérase III. Le suppresseur extragénique oriC15::aph isolé dans la première partie du projet pouvait également corriger ces problèmes. Les cellules déficientes en topoisomérases de type IA formaient des très longs filaments remplis d’ADN d’apparence diffuse et réparti inégalement dans la cellule. Ces phénotypes pouvaient être partiellement corrigés par la surproduction de la RNase HI ou en inactivant recA, ou encore par des suppresseurs isolés dans la première partie du projet et impliques dans le cSDR (dnaT18::aph et rne59::aph). Donc, dans E. coli, les topoisomérases de type IA jouent un rôle dans la stabilité du génome en inhibant la réplication inappropriée à partir de oriC et de R-loops, et en empêchant les défauts de ségrégation liés à la recombinaison RecA-dépendante, par leur action avec RecQ. Les travaux rapportés ici révèlent que la réplication inappropriée et dérégulée est une source majeure de l’instabilité génomique. Empêcher la réplication inappropriée permet la ségrégation des chromosomes et le maintien d’un génome stable. La RNase HI et les topoisomérases de type IA jouent un rôle majeur dans la prévention de la réplication inappropriée. La RNase HI réalise cette tâche en modulant l’activité de surenroulement ATP-dependante de la gyrase, et en empêchant la réplication à partir des R-loops. Les topoisomérases de type IA assurent le maintien de la stabilité du génome en empêchant la réplication inappropriée à partir de oriC et des R-loops et en agissant avec RecQ pour résoudre des intermédiaires de recombinaison RecA-dépendants afin de permettre la ségrégation des chromosomes. / DNA supercoiling is important for all cellular processes that require strand separation and is regulated by the opposing enzymatic effects of DNA topoisomerases. Gyrase uses ATP to introduce negative supercoils while topoisomerase I (topA) and topoisomerase IV relax negative supercoils. Cells lacking topoisomerase I are only viable if they have compensatory mutations in gyrase genes that reduce the negative supercoiling level of the chromosome to allow bacterial growth. One such mutation leads to the production of a thermosensitive gyrase (gyrB(Ts)). Gyrase driven supercoiling during transcription in the absence of topoisomerase I causes the accumulation of hypernegatively supercoiled plasmid DNAs due to the formation of R-loops. Overproducing RNase HI (rnhA), an enzyme that degrades the RNA moiety of R-loops, prevents the accumulation of hypernegative supercoils. In the absence of RNase HI alone, R-loops are equally formed and can be used to prime DNA replication independently of oriC/DnaA, a phenomenon known as constitutive stable DNA replication (cSDR). To better understand the link between R-loop formation and hypernegative supercoiling, we constructed a conditional topA rnhA gyrB(Ts) mutant with RNase HI being conditionally expressed from a plasmid borne gene. We found that the DNA of topA rnhA gyrB(Ts) cells was extensively relaxed instead of being hypernegatively supercoiled following the depletion of RNase HI. Relaxation was found to be unrelated to the activity of topoisomerase IV. Cells of topA rnhA gyrB(Ts) formed long filaments full of DNA, consistent with segregation defect. Overproducing topoisomerase III (topB), an enzyme that can perform decatenation, corrected the segregation problems without restoring supercoiling. We found that extracts of topA rnhA gyrB(Ts) cells inhibited gyrase supercoiling activity of wild type cells extracts in vitro, suggesting that the depletion of RNase HI triggered a cell response that inhibited the supercoiling activity of gyrase. Gyrase supercoiling assays in vivo as well as in crude cell extracts revealed that the ATP dependent supercoiling reaction of gyrase was inhibited while the ATP independent relaxation reaction was unaffected. Genetic suppressors of a triple topA rnhA gyrB(Ts) strain that restored supercoiling and corrected the chromosome segregation defects mostly mapped to genes that affected DNA replication, R-loop metabolism and fimbriae formation. The second part of this project aimed at understanding the roles of type IA DNA topoisomerases (topoisomerase I and topoisomerase III) in chromosome segregation and genome maintenance in E. coli. To investigate the role of type IA DNA topoisomerases in chromosome segregation we employed genetic approaches combined with flow cytometry, Western blot analysis and microscopy (for the examination of cell morphology). We found that the Par- phenotypes (formation of large unsegregated nucleoid in midcell) and chromosome segregation defects of a gyrB(Ts) mutant at the nonpermissive temperature were corrected by deleting topA only in the presence of topB. Moreover, overproducing topoisomerase III was shown to correct the Par- phenotype without correcting the growth defect, but overproducing topoisomerase IV, the major cellular decatenase, failed to correct the defects. Our results suggest that type IA topoisomerases play a role in chromosome segregation when gyrase is inefficient. To investigate the role of type IA DNA topoisomerases in genome maintenance, in the third part of the project, we employed genetic approaches combined with suppressor screens, spot assays and microscopy. We found that cells lacking topoisomerase I suffered from supercoiling-dependent growth defects and chromosome segregation defects that could be corrected by deleting recQ, recA or overproducing topoisomerase III and by an oriC15::aph suppressor mutation isolated in the first part of the project. Cells lacking both type 1A topoisomerases formed very long filaments packed with diffuse and unsegregated DNA. Such phenotypes could be partially corrected by overproducing RNase HI or deleting recA, or by suppressor mutations isolated in the first part of the project, that affected cSDR (dnaT18::aph and rne59::aph). Thus, in E. coli, type IA DNA topoisomerases play a role in genome maintenance by inhibiting inappropriate replication from oriC and R-loops and by preventing RecA-dependent chromosome segregation defect through their action with RecQ. The work reported here reveals that inappropriate and unregulated replication is a major source of genome instability. Preventing such replication will ensures proper chromosome segregation leading to a stable genome. RNase HI and type IA DNA topoisomerases play a leading role in preventing unregulated replication. RNase HI achieves this role by modulating ATP dependent gyrase activity and by preventing replication from R-loops (cSDR). Type IA DNA topoisomerases ensure the maintenance of a stable genome by preventing inappropriate replication from oriC and R-loops and by acting with RecQ to prevent RecA dependent-chromosome segregation defects.