Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les ADN-Topoisomérases (Topo) de type I et II sont des enzymes essentielles à la suppression des surenroulements de engendrés par la plupart des transactions de l’ADN. Elles sont des cibles de médicaments anticancéreux très utilisés en clinique. Parmi eux, les inhibiteurs de Topo1 de la famille des camptothécines (CPT) exercent leur cytotoxicité en produisant des cassures double-brin de l’ADN provenant de la collision des fourches de réplications avec les complexes ADN-Topo1 stabilisés par ces inhibiteurs. Les dérivés de CPT sont approuvés pour le traitement des cancers coliques, de l’ovaire et du poumon, mais il existe de multiples mécanismes de résistance à ces agents qui sont à l’origine de l’échec du traitement. Les cancers de la prostate sont réfractaires aux CPT, mais très peu d’études ont été réalisées pour expliquer cette résistance « intrinsèque ». Ce travail de thèse visait à identifier les mécanismes de cette résistance en nous appuyant (1) sur des résultats antérieurs de l’équipe montrant que l’interaction entre la DNA-PKcs, une kinase impliquée dans la réparation de l’ADN par recombinaison non-homologue, et la Topo1 pouvait réguler la sensibilité aux CPT de manière indépendante de la réparation de l’ADN et (2) sur une étude ayant mis en évidence une interaction entre DNA-PKcs et le facteur de transcription ERG dont le gène est remanié dans plus de 50% des tumeurs de prostate. Nos résultats montrent pour la première fois que ERG est effectivement impliqué dans la régulation de la réponse aux CPT dans la lignée VCaP présentant un gène de fusion TMPRSS2-ERG. La répression de ERG dans la lignée VCaP induit une sensibilisation à la CPT mais pas à l’étoposide (un inhibiteur de Topo2) et est accompagnée d’une augmentation du nombre de complexes ADN/Topo1. Ce mécanisme peut-être soit lié à un effet de ERG sur l’interaction DNA-PKcs/Topo1 ou à une régulation transcriptionnelle de gènes impliqués dans la réponse aux CPT incluant la Topo1 elle-même. Nous avons confirmé cette deuxième hypothèse, en démontrant que ERG régule la transcription du micro ARN miR-24 et que l’expression de Topo1 est également sous contrôle de miR-24 dans la lignée VCaP. Des résultats similaires ont été obtenus dans la lignée LNCaP (présentant le gène de fusion TMPRSS2-ETV1) dans laquelle la répression de ETV1 confère aussi une sensibilisation à la CPT. Au cours de notre travail nous avons également recherché des inhibiteurs de l’interaction entre la DNA-PKcs et Topo1 afin de pouvoir utiliser ces composés comme agents de potentialisation des dérivés de CPT en clinique. Les résultats du criblage d’une banque de 320 composés naturels réalisé par la technologie AlphaScreen n’ont malheureusement pu identifier que des inhibiteurs catalytiques de Topo1. Nous avons néanmoins pu montrer que l’un d’entre eux, la mahanimbine, présentait une forte activité cytotoxique vis-à-vis de lignées résistantes aux dérivés de CPT et vis-à-vis de la lignée VCaP ce qui permet d’envisager le développement de nouvelles classes d’inhibiteurs catalytiques Topo1 pouvant contourner la résistance des dérivés de CPT en clinique. / Type I and II DNA Topoisomerases (Top) are essential enzymes involved in the removal of DNA torsional constraints induced by most DNA transactions. They are the targets of various anticancer agents used in the clinic. Among them, Top1 inhibitors from the camptothecins (CPT) family exert their cytotoxicity by producing DNA double-strand breaks that are generated by the collision of advancing replication forks with DNA-Top1 complexes that are stabilized by these inhibitors. CPT derivatives are approved for the treatment of colon, ovary and lung cancers but resistance mechanisms are developed and lead to treatment failure. Prostate cancers are refractory to CPT, but few studies have addressed the mechanisms of such “intrinsic” resistance. This work was aimed at identifying such mechanisms based on (1) previous results from the laboratory showing that interaction of Top1 with DNA-PKcs, a kinase that is essential for non-homologous end-joining, could regulate cell sensitivity to CPT independently of DNA repair and (2) a study that showed an interaction of DNA-PKcs with ERG, a transcription factor from the ETS family which is rearranged in more than 50% of prostate tumors. Our results show for the first time that ERG is indeed involved in the regulation of prostate cancer cell response to CPT as its repression sensitized VCaP cells displaying the TMPRSS2-ERG gene fusion to CPT but not to the Top2 inhibitor etoposide. This effect is accompanied with an increase in Top1-DNA complexes. This could be due to either an effect of ERG on DNA-PKcs/Top1 interaction, or to the transcriptional regulation of genes involved in cell response to CPT, including Top1 itself. We confirmed the latter hypothesis by showing that ERG can regulate the transcription levels of the microRNA miR-24 and that Top1 expression relies, at least in part, on miR24 levels in VCaP cells. We obtained similar results in LNCaP cells (characterized by a TMPRSS2-ETV1 gene fusion), in which ETV1 repression also sensitizes cells to CPT. In parallel, we also searched for inhibitors of DNA-PKcs/Top1 interaction in order to use these compounds to potentiate CPT derivatives in the clinic. We screened a chemical library of 320 natural compounds using the AlphaScreen technology. The results were disappointing as we only identified compounds that are catalytic inhibitors of Top1. Nevertheless, we could show that among them, mahanimbine displayed a potent cytotoxic activity towards CPT-resistant colon cancer cell lines and could efficiently inhibit the growth of VCaP cells that are highly resistant to CPT. This opens new avenues for the development of new classes of Top1 catalytic inhibitors that could be used to circumvent the clinical resistance to CPT derivatives.

Les ADN topoisomérases (Topos) sont des éléments essentiels de la vie cellulaire eucaryote et procaryote. Ces enzymes interviennent lors de la réplication, de la réparation et également lors de la transcription en modulant la topologie de l'ADN. L'ADN gyrase, une Topoisomérase IIA (TopoIIA) bactérienne particulière, est la seule topoisomérase capable de surenrouler l’ADN négativement en présence d’ATP, une activité indispensable au génome bactérien. Les différentes études structurales et fonctionnelles sur ces enzymes ont permis de proposer un mécanisme catalytique de surenroulement très sophistiqué mais la vision morcelée de ces complexes multi-­‐conformationnels laisse aujourd’hui de nombreuses questions mécanistiques en suspens. Ce travail de thèse a combiné une approche structurale et fonctionnelle pour essayer de répondre aux questions fondamentales mécanistiques encore non élucidées à propos des ADN topoisomérases de type II et à la découverte de nouveaux inhibiteurs « anti-­‐Topo » face à l’émergence de populations bactériennes résistantes aux traitements. / Type II DNA topoisomerases (Topo2A) remodel DNA topology during replication, transcription and chromosome segregation. Most TopoIIA are able to perform ATP-­‐dependent DNA relaxation or decatenation but the bacterial DNA gyraseis the sole type II DNA topoisomerase able to introduce negative supercoils. Several biochemical and structural studies haverevealed a highly sophisticated supercoiling catalytic mechanism but despite a wealth of information, the full architectureof Topo2A and the structural basis for DNA supercoiling remain elusive. Due to their physiological roles, topoisomerasesare also important targets for antibiotics targeting the bacterial enzyme but also anti-­‐cancer molecules inhibiting the humanprotein. This presented work has combinedboth structural and functional approach to answer the fundamental mechanisticquestions still unveiled and to discover new inhibitors against the emergence of resistant bacterial population.