La protéine SC35 appartient à la famille des protéines SR (Ser/Arg-rich) connues pour être des régulateurs cruciaux de l'épissage alternatif et constitutif. L'activité de ces protéines est largement régulée par phosphorylation. Alors que plusieurs études ont mis en évidence une dérégulation de l'expression des protéines SR au cours du processus de carcinogenèse, peu de données existent à ce jour concernant les voies de signalisation cellulaire qui contrôlent l'expression et/ou l'activité de ces protéines dans les cellules cancéreuses. Pour la première fois, nous démontrons que SC35 est une protéine acétylée. Cette modification post-traductionnelle met en jeu l'acétyltransférase Tip60 et la déacétylase HDAC6. Nos données mettent aussi en évidence une connexion étroite entre la phosphorylation et l'acétylation de SC35 pour le contrôle de son niveau d'expression et de son activité. Nous démontrons enfin que ces modifications post-traductionnelles de SC35 sont critiques pour l'induction de l'apoptose en réponse aux agents génotoxiques et pour la mise en place d'un phénomène de sénescence en réponse au sodium butyrate, un inhibiteur d'histones déacétylases, dans différentes lignées cellulaires dérivées de carcinomes pulmonaires humains. La protéine E2F1 est un facteur de transcription qui participe au contrôle de la prolifération cellulaire en stimulant le passage des cellules en phase S du cycle cellulaire et est aussi capable d'induire l'apoptose. Au laboratoire, nous avons identifié la protéine SC35 comme une nouvelle cible transcriptionnelle directe de E2F1 et montré que les deux protéines coopèrent pour induire l'apoptose en réponse aux agents génotoxiques. Nous démontrons dans ce travail que SC35 gouverne aussi l'entrée et la progression en phase S en contrôlant certains gènes cibles de E2F1 impliqués dans ce contexte, tels que la cycline E. Nous mettons en évidence que la voie de signalisation cellulaire PI3K/AKT est impliquée dans le contrôle de l'expression de la cycline E médié par les deux protéines E2F1 et SC35, notamment via la phosphorylation de SC35. Finalement, nous décrivons une corrélation directe entre le niveau d'expression protéique de la cycline E et de P-SC35 dans une série de tumeurs pulmonaires neuroendocrines. L'ensemble de ces travaux identifie donc de nouvelles voies de signalisation contrôlant les fonctions cellulaires de SC35 et ouvre des perspectives quant aux conséquences biologiques découlant de la dérégulation de l'expression de SC35 dans les cancers bronchiques.

La peau étant le premier tissu exposé aux diverses agressions de l’environnement extérieur, les cellules qui la composent doivent disposer de mécanismes de protection vis-à-vis de ces agressions, afin d’assurer le maintien de l’homéostasie tissulaire. Les cellules souches de l’épiderme assurant le renouvellement du compartiment épithélial pendant toute la vie de l’individu, la préservation de l’intégrité de leur génome est essentielle à la fonctionnalité pérenne de la peau. Mon doctorat avait pour objectif d’explorer les mécanismes mis en œuvre par les cellules souches de l’épiderme interfolliculaire afin de se protéger de deux stress génotoxiques radiatifs, à savoir : les rayonnements gamma et les rayonnements ultraviolets B (UVB). Durant mon doctorat, j’ai tout d’abord participé à la démonstration des mécanismes de protection mis en œuvre par les cellules souches des kératinocytes après irradiation ionisante. En effet, il a été montré que ces cellules sont capables de réparer très rapidement l’ensemble des dommages de l’ADN radio-induits, et que cette réparation était activée par le facteur de croissance FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2). Afin de savoir si ce mécanisme de protection était aussi opérant dans les cellules souches de carcinome cutané, nous l’avons recherché dans la sous-population de cellules souches qui peut être isolée d’une lignée de carcinome cutané humain. Comme dans le cas des cellules souches normales, nous avons montré que les cellules souches de cancer présentent une réparation très rapide des dommages de l’ADN radio-induits. De plus, le facteur de croissance FGF2 participe à cette réparation, notamment par la présence d’isoformes de ce facteur dans le noyau cellulaire. Le second projet de mon doctorat avait pour objectif l’étude de la réponse des cellules souches et des progéniteurs de l’épiderme humain aux rayonnements UVB. Une fois mises en place les conditions de tri en cytométrie de flux et d’irradiation par les UVB, la toxicité de ces rayonnements a été évaluée dans un modèle cellulaire primaire. Nous avons caractérisé les effets des photons UVB sur la viabilité et la prolifération cellulaire et étudié la réparation des dommages de l’ADN. Cette étude nous a permis de mettre en évidence des réponses aux UVB différentes entre les cellules souches et leur descendance immédiate, les kératinocytes progéniteurs, notamment au niveau de l’activité de réparation des dommages de l’ADN. Par ailleurs, une étude du transcriptome des cellules irradiées a été réalisée, qui permet d’analyser les mécanismes globaux communs et spécifiques de réponse au stress dans les deux populations. L’ensemble des données obtenues nous permet de proposer plusieurs mécanismes de protection, communs et spécifiques, mis en œuvre par les cellules souches de l’épiderme en réponse aux stress radiatifs UVB et gamma. / Human skin is the first organ exposed to various environmental stresses, which requires the development by skin stem cells of specific mechanisms to protect themselves and to ensure tissue homeostasis. As stem cells are responsible for the maintenance of epidermis during individual lifetime, the preservation of genomic integrity in these cells is essential. My PhD aimed at exploring the mechanisms set up by epidermal stem cells in order to protect themselves from two genotoxic stresses, ionizing radiation ( Gamma Rays) and ultraviolet radiation (UVB). To begin my PhD, I have taken part of the demonstration of protective mechanisms used by keratinocyte stem cells after ionizing radiation. It has been shown that these cells are able to rapidly repair most types of radiation-induced DNA damage. Furthermore, we demonstrated that this repair is activated by the fibroblast growth factor 2 (FGF2). In order to know if this protective mechanism is also operating in cutaneous carcinoma stem cells, we investigated the response to gamma Rays of carcinoma stem cells isolated from a human carcinoma cell line. As in normal keratinocyte stem cells, we demonstrated that cancer stem cells could rapidly repair radio-induced DNA damage. Furthermore, fibroblast growth factor 2 also mediates this repair, notably thanks to its nuclear isoforms. The second project of my PhD was to study human epidermal stem cells and progenitors responses to UVB radiation. Once cytometry and irradiation conditions were set up, the toxicity of UVB radiation has been evaluate in the primary cell model. We then characterized UVB photons effects on cell viability, proliferation and repair of DNA damage. This study allowed us to bring out that responses of stem cells and their progeny to UVB are different, notably at the level of part of their repair activity of DNA damage. Moreover, progenitors and stem cells transcriptomic responses after UVB irradiation have been study in order to analyze the global mechanisms of stress response in the two cell populations. Taken together, data obtained during my PhD allowed us to show that stem cells respond differently than keratinocyte progenitors to radiation stress, and that they developed both intrinsic and radiation-induced strategies allowing a better protection. When comparing gamma Rays and UVB, we found that, although their toxic effects on skin share many similarities, the mechanisms set up by human epidermal stem cells to protect themselves vary according to the type of radiation stress.

Asf1 est une protéine chaperon d’histone, qui participe à l’assemblage et au désassemblage des histones H3/H4 sur l’ADN. Asf1 n’est pas essentiel pour la viabilité cellulaire chez S. cerevisiae, mais les voies de surveillance des dommages à l’ADN sont activées de façon constitutive dans les cellules dépourvues d’Asf1 et celles-ci sont hypersensibles à plusieurs types de stress génotoxiques. Chez S. cerevisiae, Asf1 forme un complexe stable avec Rad53 en absence de stress génotoxique. Nos résultats suggèrent qu’au moins trois surfaces d’interaction sont impliquées dans le complexe Asf1-Rad53. Le domaine FHA1 de Rad53 fixe Asf1 phosphorylé sur T270, l’extrémité C-terminale de Rad53 fixe la même surface d’Asf1 impliquée dans la fixation des co-chaperones HirA/CAF-1, et un troisième site putative est constituée de la surface d’Asf1 impliquée dans la fixation de l’histone H3 avec le domaine kinase de Rad53. Lors des stress génotoxiques, Rad53 est phosphorylée et activée. Mes résultats montrent une dissociation totale du complexe Rad53-Asf1 après traitement HU, mais la préservation du complexe après traitement des cellules avec une gamme de concentration de MMS. Nous pensons que la régulation du complexe traduisent des réponses cellulaires distinctes adaptées à des stress génotoxiques spécifiques. Par ailleurs, grâce à la structure du complexe formé par un peptide C-terminal de Rad53 et le domaine N-terminal d’Asf1, nous avons isolé une mutation rad53_A806R-L808R. Nous avons constaté que cette mutation déstabilise l’interaction entre Asf1 et Rad53 et augmente la viabilité des mutants rad9 et rad24 aux stress génotoxiquex. Ce mutant rad53_A806R-L808R semble retourne plus vite dans le cycle cellulaire et/ou traverse plus vite la phase S par rapport à Rad53-WT, et augmente la réparation de l’ADN ou l’adaptation aux dommages du simple mutant rad24Δ. / Asf1 is a histone chaperone, which participates in the assembly and disassembly of histones H3/H4 on DNA. Asf1 is not essential for cell viability in yeast, but the DNA damage checkpoints are constitutively activated in cells lacking Asf1 and they are hypersensitive to several types of genotoxic stress. In yeast, Asf1 forms a stable complex with Rad53 in the absence of genotoxic stress. Our results suggest that this complex involves at Ieast three interaction surfaces. One site involves the H3-binding surface of Asf1 with an as yet undefined surface of Rad53, probably reside in the kinase domain of Rad53. A second site is formed by the Rad53-FHA1 domain binding to Asf1-T270. The third site involves the C-terminal 21 aa of Rad53 bound to the conserved Asf1 N-terminal domain, where Rad53 competes with histone H3/H4 and co-chaperones HirA/CAF-1 for binding to the same surface of Asf1. Rad53 is phosphorylated and activated upon genotoxic stress. The Asf1-Rad53 complex dissociated when cells were treated with hydroxyurea but not methyl methane sulfonate, suggesting a regulation of the complex as a function of the stress.In addition to these results, we also found that the rad53-A806R+L808R mutation at the C-terminus of Rad53 destabilized the Asf1-Rad53 interaction and increased the viability of rad9 and rad24 mutants to genotoxic stress. The rad53-ALRR mutant also appeared to re-enter the cell cycle and/or traverse S-phase more rapidly than wild type and increased repair or adaptation when combined with the rad24 mutant.

Asf1 est une protéine chaperon d'histone, qui participe à l'assemblage et au désassemblage des histones H3/H4 sur l'ADN. Asf1 n'est pas essentiel pour la viabilité cellulaire chez S. cerevisiae, mais les voies de surveillance des dommages à l'ADN sont activées de façon constitutive dans les cellules dépourvues d'Asf1 et celles-ci sont hypersensibles à plusieurs types de stress génotoxiques. Chez S. cerevisiae, Asf1 forme un complexe stable avec Rad53 en absence de stress génotoxique. Nos résultats suggèrent qu'au moins trois surfaces d'interaction sont impliquées dans le complexe Asf1-Rad53. Le domaine FHA1 de Rad53 fixe Asf1 phosphorylé sur T270, l'extrémité C-terminale de Rad53 fixe la même surface d'Asf1 impliquée dans la fixation des co-chaperones HirA/CAF-1, et un troisième site putative est constituée de la surface d'Asf1 impliquée dans la fixation de l'histone H3 avec le domaine kinase de Rad53. Lors des stress génotoxiques, Rad53 est phosphorylée et activée. Mes résultats montrent une dissociation totale du complexe Rad53-Asf1 après traitement HU, mais la préservation du complexe après traitement des cellules avec une gamme de concentration de MMS. Nous pensons que la régulation du complexe traduisent des réponses cellulaires distinctes adaptées à des stress génotoxiques spécifiques. Par ailleurs, grâce à la structure du complexe formé par un peptide C-terminal de Rad53 et le domaine N-terminal d'Asf1, nous avons isolé une mutation rad53_A806R-L808R. Nous avons constaté que cette mutation déstabilise l'interaction entre Asf1 et Rad53 et augmente la viabilité des mutants rad9 et rad24 aux stress génotoxiquex. Ce mutant rad53_A806R-L808R semble retourne plus vite dans le cycle cellulaire et/ou traverse plus vite la phase S par rapport à Rad53-WT, et augmente la réparation de l'ADN ou l'adaptation aux dommages du simple mutant rad24Δ.

Les facteurs de transcription STAT3 sont activés et impliqués dans le développement tumoral par leurs effets sur la prolifération et la survie cellulaire. Lorsque STAT3 est phosphorylé sur la tyrosine 705, il semble impliqué dans la transformation cellulaire et dans l'échappement aux traitements classiques de chimiothérapie. Un second site de phosphorylation sur la sérine 727 a été décrit mais son implication dans la régulation de l'activité de STAT3 en réponse aux traitements a été peu étudiée. Nous nous sommes donc intéressés au rôle de la phosphorylation de la sérine 727 de STAT3 dans la réponse de lignées cellulaires colorectales aux agents génotoxiques et plus particulièrement aux inhibiteurs de topoisomérases de type I. Le traitement entraine une perte de la transcription de la cycline D1 et de myc, gènes cibles de STAT3 phosphorylée sur tyrosine 705 et une activation de la kinase cdk5. Cette dernière va phosphoryler STAT3 sur son résidu sérine 727 ce qui va lui permettre de se fixer sur le promoteur du gène de la protéine de réparation Eme1, pour activer sa transcription. Ceci permet la réparation des dommages de l'ADN induits par le Sn38 et entraine une diminution de la sensibilité au traitement. D'autre part, l'inhibition des topoisomérases entraine une perte de la protéine myc normalement liée au promoteur d'Aurora A en phase G2/M et qui, associée au recrutement des répresseurs mad et miz aboutit à l'inhibition de la transcription de la kinase Aurora A. Une inhibition de la séparation des centrosomes est alors observée et entraine un arrêt en phase G2/M. En plus de la régulation de l'activité transcriptionnelle de STAT3 phosphorylée sur la sérine, nous nous sommes intéressés aux partenaires protéiques du facteur de transcription en réponse à sa phosphorylation. Par l'intermédiaire de la technique du double hybride et de la spectrométrie de masse, nous avons pu mettre en évidence deux nouveaux partenaires potentiels de STAT3. D'abord DDB2, protéine impliquée dans l'entrée en sénescence et dans la méthylation de l'ADN. Puis, ASPP2, une protéine qui confère à p53 une meilleure affinité de fixation à certains de ses promoteurs. Nous pensons que la phosphorylation de STAT3 sur la sérine 727 pourrait être impliquée dans l'induction de la sénescence et dans la réparation des dommages de l'ADN et que la cellule tumorale détournerait ces processus de protection pour réparer son ADN afin de résister au traitement. Les cellules pourraient alors proliférer avec un matériel génétique abimé, ce qui rendrait ces cellules instables sur le plan génomique. La détection de cette phosphorylation de STAT3 pourrait etre utilisée comme un marqueur de résistance aux inhibiteurs de topoisomérase. Ceci pourrait ainsi permettre de mieux prédire la réponse des patients à ce traitement.

La réponse au stress génotoxique met en jeu de nombreux facteurs cellulaires impliqués dans un réseau complexe de mécanismes visant à assurer le maintien de l'intégrité génétique de l'organisme. Ces mécanismes incluent la détection et la réparation des lésions de l'ADN, la régulation de la transcription et de la réplication et le déclenchement éventuel de la mort cellulaire. Parmi les protéines nucléaires participant à cette réponse, les protéines kin17 sont des protéines à doigt de zinc conservées au cours de l'évolution et activées par les ultraviolets (UV) et les radiations ionisantes (RI). Nous avons montré que la protéine kin17 humaine (HSAkin17) est présente dans la cellule sous une forme soluble et sous une forme ancrée aux structures nucléaires. Une fraction de la protéine HSAkin17 est directement associée à la chromatine. La protéine HSAkin17 est recrutée sur les structures nucléaires 24 heures après traitement par différents agents induisant des cassures double-brin de l'ADN (DSB) et/ou un blocage des fourches de réplication. Par ailleurs, la réduction du niveau total de protéine HSAkin17 sensibilise les cellules RKO aux RI. Nous présentons également des résultats impliquant la protéine HSAkin17 dans la réplication de l'ADN. Cette hypothèse a été confirmée par la démonstration biochimique de son appartenance au complexe de réplication. La protéine HSAkin17 pourrait donc assurer le lien entre réplication et réparation de l'ADN, un défaut de la voie HSAkin17 entraînant une augmentation de la radiosensibilité. Dans un deuxième temps, nous avons étudié les interactions entre deux mécanismes de réparation de l'ADN : la réparation par excision de nucléotides (NER) et la recombinaison non homologue (NHEJ). Le NER prend en charge une grande variété de lésions provoquant une distortion de la double hélice d'ADN dont les dimères de pyrimidines induits par les UV. Le NHEJ assure la réparation des DSB par jonction directe des extrémités d'ADN. Nous avons utilisé un modèle syngénique de défaut de la réparation basé sur l'interférence ARN développé au laboratoire. En effet, les vecteurs dérivés du virus d'Epstein-Barr (pEBV) permettent l'expression à long terme de siRNA et l'extinction spécifique du gène cible. La réduction de l'expression de gènes impliqués dans le NER (XPA et XPC) ou le NHEJ (DNA-PKcs et XRCC4) entraîne les phénotypes attendus. Nous avons montré que la réduction du niveau de protéine XPC sensibilise les cellules HeLa à l'étoposide, un inhibiteur de la topoisomérase II qui induit des DBS, et affecte leur activité NHEJ in vitro. Ces résultats suggèrent que la protéine XPC pourrait être requise pour la réparation de certains types de cassures ou participer à un système global de régulation de la réponse cellulaire aux lésions de l'ADN. Notre modèle ouvre donc des perspectives intéressantes pour l'étude des relations entre les différentes voies de réparation de l'ADN dans des cellules humaines.

Les facteurs de transcription STAT3 sont activés dans de nombreuses tumeurs et leurs effets sur la prolifération et la survie suggéraient fortement que ces protéines puissent être impliquées à la fois dans la transformation cellulaire et dans l'échappement aux traitements classiques de chimiothérapie.<br />Nous nous sommes donc intéressés aux différents aspects impliquant STAT3 dans la réponse de lignées cellulaires aux agents génotoxiques de chimiothérapie, et plus particulièrement aux inhibiteurs de topoisomérase. Durant ces traitements, STAT3 interagit avec le répresseur transcriptionnel Rb et l'inhibiteur du cycle cellulaire p21. Ces deux protéines inhibent son activité transcriptionnelle, notamment sur les gènes c-myc et cdc25A, et permettent la mise en place de la sénescence induite par les dommages de l'ADN et la catastrophe mitotique. Cependant, en présence d'une activité constitutive de STAT3 induite par l'oncogène v-src, STAT3 empêche l'activation de Rb et de p21, favorise la résistance des cellules aux inhibiteurs de topoisomérase II, et génère de l'instabilité génomique. Finalement,<br />deux inhibiteurs de STAT3, le cetuximab, un anticorps monoclonal dirigé contre l'EGFR, et un inhibiteur de la tyrosine kinase c-src, sensibilisent des cellules colorectales aux inhibiteurs de topoisomérase I. L'inhibition de STAT3 empêche l'activation du gène Eme1 qui induit l'expression d'une protéine de réparation de l'ADN.<br />STAT3 est donc un facteur de résistance aux inhibiteurs de topoisomérase. Sa détection pourrait ainsi permettre de mieux prédire la réponse des patients à ces inhibiteurs, et son inhibition, dans les tumeurs où il est actif, pourrait permettre de les sensibiliser aux inhibiteurs de topoisomérase.

Nous avons identifié une nouvelle forme de phospho-S27-S33-Ku70 constitutivement surexprimée dans des cellules issues de la leucémie lymphocytaire chronique résistante à la chimiothérapie basée sur des agents alkylants de l’ADN et/ou analogues nucléotidiques. La protéine Ku70 est une protéine essentielle du maintien de la stabilité génomique par son rôle dans la réparation non-homologue (système NHEJ) des cassures double brin de l’ADN (CDB) et par sa fonction télomérique. Le laboratoire d’accueil a déjà démontré, in vitro et in vivo, dans les cellules LLC résistantes une altération de la réparation par le système NHEJ et un dysfonctionnement télomérique. Le travail de thèse a porté sur la caractérisation fonctionnelle de cette nouvelle forme phospho-S27-S33-Ku70. Pour ceci, nous avons utilisé des vecteurs d’expression permettant simultanément d’inhiber l’expression du Ku70 endogène (shRNA) et d’exprimer de façon épisomale différentes formes de Ku70 exogène. Ainsi, nous avons démontré : i) une stricte colocalisation de pS27-pS33-Ku70 avec les foyers γ-H2AX; ii) des cassures double brin (DSB) induisent la phosphorylation de S27-S33-Ku70 sous forme hétérodimère avec Ku80. Cette phosphorylation a lieu quelques minutes après le stress génotoxique et implique l'activité et l'interaction physique avec pS2056-DNA-PKcs, reliant ainsi pS27-pS33-Ku70 au système NHEJ ; iii) les cellules exprimant la forme sauvage exogène S27-S33-Ku70 ou la forme phosphomimétique E27-E33-Ku70 présentent une cinétique de réparation de l’ADN plus rapide que celle des cellules exprimant la forme mutée A27-A33-Ku70. Cependant, iv) la forme sauvage de Ku70 contribue à un niveau plus élevé d'aberrations structurales chromosomiques après la première division cellulaire suite à un stress génotoxique indiquant une infidélité lors de la réparation des dommages de l’ADN. En outre, les cellules exprimant A27-A33-Ku70 possèdent un index cellulaire plus élevé qui est corrélé avec une activation de la voie β-caténine. En adéquation avec sa surexpression dans la forme résistante de la LLC, l’ensemble de ces résultats suggère un rôle oncogénique de la forme phosphorylée de Ku70. Nous avons ensuite testé l’effet des nanodiamants hydrogénés (ND-H) dans des lignées exprimant différentes formes de Ku70. Grâce à leurs propriétés physico-chimiques les ND-H sont capables de potentialiser sous irradiation la production intracellulaire des espèces réactives de l’oxygène (ROS) et ainsi augmenter le taux des cassures (simple et double brin de l’ADN) et solliciter d’avantage le système de réparation de l’ADN. Nous observons que indépendamment de la forme exprimée de Ku70, ce double traitement induisait la sénescence cellulaire ; une découverte d’un intérêt à la fois fondamental (compréhension des voies apoptotiques vs senescence) et d’utilité pharmacologique potentielle. / We have identified a new form of phospho-S27-S33-Ku70 constitutively overexpressed in a subset of chronic lymphocytic leukemia (CLL) B cells resistant to apoptosis induced by DNA double strand breaks (DSB). Ku70 is one of the essential proteins involved in the maintenance of genomic stability through its role in DNA double strand break repair (non-homologous end-joining, NHEJ) and in telomeric protection.Laboratory previously established that resistant CLL cells disclose an upregulated NHEJ DNA repair and an impaired structure of telomeres. The goal of this thesis was to characterize the biological function(s) of this new form of Ku70. For this purpose we have constructed specific EBV-based vectors (siRNA / cDNA) enabling a simultaneous inhibition of endogenous Ku70 and an expression of different forms (mutated, wild, phosphomimetic at ser27-33) of Ku70 resistant to siRNA. Thus, we showed: i) a strict colocalisation of phospho-Ku70 with γ-H2AX foci; ii) that DSB induces the phosphorylation of Ku70 within minutes after genotoxic stress in heterodimer complex Ku70/Ku80. This phosphorylation necessitates both the physical interaction and the activity of pS2056-DNA-PKcs and/or ATM, linking phospho-Ku70 to NHEJ-mediated DNA DSB repair; iii) cells expressing mutated A27-A33-Ku70 exhibit a delayed G2/M cell cycle arrest, slower kinetic of DNA repair, lower level of genotoxic stress-induced chromosomal aberrations, and a higher cellular impedance correlated with translocation of transcriptional factor β-catenin from cytoplasmic membrane to the nucleus. Together, these data unveil an involvement of phospho-Ku70 in fast and inaccurate DNA repair; new paradigm for NHEJ regulation and to the control of resistance and maintenance of malignant cells.In parallel, we have initiated experimental approaches to explore other potential roles of phospho-Ku70. Especially, we were interested to determine whether it could play a role in an initiation of cell senescence induced by combined cells’ treatment by hydrogenated nanodiamonds (H-NDs) particles and ionizing irradiation. H-NDs exhibit positive surface charge in aqueous solutions allowing, when irradiated by photons, electrons’ emission and the release of reactive oxygen species (ROS) causing DNA damage. Effectively, we have established an intracellular increase of ROS that drive cell cycle arrest in G1/S in addition to the G2 arrest activated by irradiation alone. Finally, cells underwent the senescence process characterized byγ-galactosidaze activity, persistent large γ-H2AX foci and senescence-associated heterochromatinisation. Noteworthy, the senescence induced in this way occurred independently of Ku70 (ser27-ser33) status and irrespectively of cell resistance to genotoxic agents administrated alone; a finding of potential use in clinical trials.