L'interférence à l'ARN est un phénomène impliqué dans plusieurs processus biologiques, notamment dans l'intégrité génomique et le développement, qui est conservé dans l'évolution. Ce phénomène est induit par la présence d'un long ARNdb qui mène à la production de siARN (short-interfering ARN) d'environ 22 nucléotides de long qui sont parfaitement complémentaires à un ARNm cible. Ces siARN servent de guide aux protéines Argonautes qui utilisent leur activité catalytique pour cliver l'ARNm et ainsi diminuer son expression. Chez plusieurs organismes, notamment Caenorhabditis elegans, l'exposition à de l'ARN double-brin exogène permet la production de siARN. Par la suite, le signal de dégradation de l'ARNm ciblé se transmet de générations en générations sans que ces dernières n'aient été exposées à la molécule initiatrice par un mécanisme peu compris. Différentes études antérieures ont tenté de déterminer quels sont les facteurs physiques qui sont transmis aux générations subséquentes, mais ces études utilisent des transgènes comme cibles, ces derniers ayant été démontrés comme étant réprimés par des mécanismes indépendants de l'interférence à l'ARN induit par de l'ARN double-brin exogène. Le but du projet est donc de développer une méthode qui permet d'étudier ce phénomène dans un contexte endogène et de l'utiliser afin de déterminer quels facteurs moléculaires peuvent être transmis à la descendance selon le type de gamète (mâle ou femelle) et le type de tissu (somatique ou germinal) touché. En utilisant la méthode développée qui utilise comme cible un ARNm endogène qui possède une délétion silencieuse, l'étude a permis de déterminer que l'ARNm cible a besoin d'être présent chez le géniteur pour induire le processus de transmission de l'interférence à l'ARN à la descendance. De plus, l'étude a permis de déterminer qu'une accumulation de siARN double-brin chez le parent peut mener à une transmission à la descendance du signal de dégradation de l'ARNm et que cette transmission ne peut s'effectuer que si le parent hermaphrodite est exposé à la molécule d'ARN double-brin. En bref, cette étude a permis d'améliorer la compréhension de ce mécanisme épigénétique qu'est la transmission entre générations de l'interférence à l'ARN. / RNA interference is a phenomenon implicated in many biological processes, including genomic integrity and development, and it is conserved in evolution. This phenomenon is induced by the presence of double stranded RNA leading to the production of siRNAs (short-interfering RNAs) of about 22 nucleotides long that are perfectly complementary to a target mRNA. Those siRNAs guide Argonaute proteins to the target mRNA and use their catalytic activity to cleave the target and decrease its expression. In many organisms, including Caenorhabditis elegans, production of siRNAs by exposing cells to exogenous dsRNA induce a transmission of RNAi signal between generation without exposing progeny to initiator molecules by a poorly understood mechanism. Different studies have already tried to determine which physical factors can be transmitted to the next generation, but these studies have used transgenes as a mRNA target, who have been shown to be also repressed by a mechanism independent of RNA interference induced by a double-stranded RNA. Therefore the main purpose of the project is to develop a method who can be used to study this phenomenon in an endogenous context and to determine which molecular factors can be transmitted between generations depending on the gamete type (male or female) and the tissue type (somatic or germline tissue) targeted. Using the developed method which uses a mRNA that carries a silenced deletion mutation, the study has determined that the target mRNA must be present in the parent to induce transmission of RNA interference through generations. Also, the data has shown that a double-stranded RNA accumulation can lead to a transmission to the progeny of the mRNA degradation signal, but this transmission can only occur if the hermaphrodite parent is exposed to the double-stranded RNA. In short, this study helped to increase the understanding of this epigenetic mechanism that is the transmission between generations of RNA interference.

L'interférence à l'ARN est un phénomène impliqué dans plusieurs processus biologiques, notamment dans l'intégrité génomique et le développement, qui est conservé dans l'évolution. Ce phénomène est induit par la présence d'un long ARNdb qui mène à la production de siARN (short-interfering ARN) d'environ 22 nucléotides de long qui sont parfaitement complémentaires à un ARNm cible. Ces siARN servent de guide aux protéines Argonautes qui utilisent leur activité catalytique pour cliver l'ARNm et ainsi diminuer son expression. Chez plusieurs organismes, notamment Caenorhabditis elegans, l'exposition à de l'ARN double-brin exogène permet la production de siARN. Par la suite, le signal de dégradation de l'ARNm ciblé se transmet de générations en générations sans que ces dernières n'aient été exposées à la molécule initiatrice par un mécanisme peu compris. Différentes études antérieures ont tenté de déterminer quels sont les facteurs physiques qui sont transmis aux générations subséquentes, mais ces études utilisent des transgènes comme cibles, ces derniers ayant été démontrés comme étant réprimés par des mécanismes indépendants de l'interférence à l'ARN induit par de l'ARN double-brin exogène. Le but du projet est donc de développer une méthode qui permet d'étudier ce phénomène dans un contexte endogène et de l'utiliser afin de déterminer quels facteurs moléculaires peuvent être transmis à la descendance selon le type de gamète (mâle ou femelle) et le type de tissu (somatique ou germinal) touché. En utilisant la méthode développée qui utilise comme cible un ARNm endogène qui possède une délétion silencieuse, l'étude a permis de déterminer que l'ARNm cible a besoin d'être présent chez le géniteur pour induire le processus de transmission de l'interférence à l'ARN à la descendance. De plus, l'étude a permis de déterminer qu'une accumulation de siARN double-brin chez le parent peut mener à une transmission à la descendance du signal de dégradation de l'ARNm et que cette transmission ne peut s'effectuer que si le parent hermaphrodite est exposé à la molécule d'ARN double-brin. En bref, cette étude a permis d'améliorer la compréhension de ce mécanisme épigénétique qu'est la transmission entre générations de l'interférence à l'ARN. / RNA interference is a phenomenon implicated in many biological processes, including genomic integrity and development, and it is conserved in evolution. This phenomenon is induced by the presence of double stranded RNA leading to the production of siRNAs (short-interfering RNAs) of about 22 nucleotides long that are perfectly complementary to a target mRNA. Those siRNAs guide Argonaute proteins to the target mRNA and use their catalytic activity to cleave the target and decrease its expression. In many organisms, including Caenorhabditis elegans, production of siRNAs by exposing cells to exogenous dsRNA induce a transmission of RNAi signal between generation without exposing progeny to initiator molecules by a poorly understood mechanism. Different studies have already tried to determine which physical factors can be transmitted to the next generation, but these studies have used transgenes as a mRNA target, who have been shown to be also repressed by a mechanism independent of RNA interference induced by a double-stranded RNA. Therefore the main purpose of the project is to develop a method who can be used to study this phenomenon in an endogenous context and to determine which molecular factors can be transmitted between generations depending on the gamete type (male or female) and the tissue type (somatic or germline tissue) targeted. Using the developed method which uses a mRNA that carries a silenced deletion mutation, the study has determined that the target mRNA must be present in the parent to induce transmission of RNA interference through generations. Also, the data has shown that a double-stranded RNA accumulation can lead to a transmission to the progeny of the mRNA degradation signal, but this transmission can only occur if the hermaphrodite parent is exposed to the double-stranded RNA. In short, this study helped to increase the understanding of this epigenetic mechanism that is the transmission between generations of RNA interference.

Les protéines d'interférence par l'ARN (RNAi) chez S. pombe sont responsables de la formation dliétérochromatine aux centromeres durant la mitose via le complexe RTTS -spChpl spTas3 spAgol-. De façon intéressante, la mutation d'une des protéines de RNAi, soit spAgol, spDcrl ou spRdpl, conduit à des aberrations de ségrégation chromosomique en méiose. Bien que ce phénotype puisse être dû à un défaut des centromeres, nous nous sommes intéressés à identifier une possible implication des protéines du RNAi dans un autre mécanisme primordial en méiose : la recombinaison homologue. Nous avons étudié les interactions potentielles entre les protéines de RNAi et les protéines de recombinaison homologue. Nous avons inclus également spArbl, spArb2, spChpl et spTas3, quatre protéines impliquées dans la formation dliétérochromatine aux centromeres via le RNAi. Nous avons ainsi démontré par double-hybride la présence d'interaction entre la protéine méiotique spRecl5 et spRdpl, spArbl et spChpl d'une part, et spRec7 avec spTas3 d'autre part. La deletion de ces gènes conduit à de graves défauts dans la formation des spores, soulignant leur importance dans le processus méiotique. spRec7 et spRecl5 sont deux protéines peu connues, impliquées dans les étapes précoces de la formation des cassures double brin par Spol 1 (spRecl2) à l'origine de la recombinaison homologue. Nous avons analysé par immunoprecipitations de chromatine et par immunofluorescence l'effet des mutations de spChpl et spTas3 sur les étapes précoces de recombinaison homologue, et les résultats préliminaires obtenus à ce jour semblent supporter une forte implication de ces protéines dans la recombinaison homologue méiotique.

L'interférence à l'ARN ou RNAi est un mécanisme d'extinction de l'expression des gènes nécessitant des molécules d'ARN double-brin. Dans le cytoplasme, une machinerie enzymatique les prend en charge afin de produire de courts ARNs simple-brin de 21 nucleotides (siARN) qui vont s'associer avec une protéine Argonaute pour former le complexe effecteur appelé le complexe RISC. Ce complexe cible un ARNm par complémentarité de bases et induit sa dégradation de façon séquence spécifique. Malgré son utilisation fréquente dans les laboratoires de recherche et son fort potentiel comme agent thérapeutique, le mécanisme moléculaire par lequel le RNAi s'opère reste encore peu compris. En utilisant le nematode Caenorhabditis elegans comme modèle animal, mon projet de recherche avait pour but de mieux comprendre le fonctionnement du RNAi en déterminant : 1) la cinétique de dégradation d'un ARNm ciblé par la voie du RNAi et; 2) les caractéristiques moléculaires de l'ARN double-brin qui sont nécessaires à l'induction et au maintien du RNAi chez l'animal. Les résultats que j'ai obtenus indiquent que le clivage spécifique de l'ARNm dans la région complémentaire au siARN mène à la stabilisation d'une partie de l'ARNm ciblé suggérant que cette stabilisation serait importante pour obtenir une réponse RNAi efficace chez le nematode. De plus, mes études ont démontré que le nombre siARN, généré par la molécule d'ARN double-brin, affecte la dégradation de l'ARNm, le maintien et la transmission du RNAi chez l'animal. En résumé, mes études ont permis de mieux caractériser l'atténuation génique médiée par le RNAi chez l'animal et la mise en évidence des paramètres moléculaires importants dans la voie du RNAi. Ces observations permettront la création d'une nouvelle génération d'approches thérapeutiques utilisant le plein potentiel du RNAi comme régulateur d'expression génique.

Les travaux présentés dans ce mémoire portent sur la synthèse et à l'étude physico-chimique et biologique de nouveaux tensioactifs fluorés pour la conception de vecteurs non-viraux ayant un intérêt dans le domaine de l'interférence ARN. Dans un premier temps, en se basant sur l'expérience du laboratoire et sur l'étude des vecteurs existants, nous avons proposé un design moléculaire pour la synthèse d'amphiphiles bicaténaires géminis et monocaténaires. La synthèse a été réalisée par des méthodes simples et offre de bons rendements. Les tensioactifs préparés comportent des chaines grasses fluorées pour leurs propriétés spécifiques et des motifs polyaminés ou oxyéthylènique comme partie polaire. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés aux propriétés physico-chimiques de ces familles de molécules. Les tensioactifs géminis sont insolubles dans l'eau et forment des monocouches de Langmuir stables à l'interface air/eau. L'étude de ces monocouches révèle que l'organisation à l'interface est fortement dépendante du bras espaceur entre les deux chaines grasses fluorées. Les molécules monocaténaires quant à elles sont solubles dans l'eau, montrent une forte activité de surface et forment spontanément des vésicules en solution. Nous avons ensuite étudié l'interaction entre les produits synthétisés et un petit monobrin d'ADN de 23 bases. Une interaction relativement forte a été mise en évidence pour la plupart des molécules et nous avons essayé de relier la structure de ces molécules aux propriétés physico-chimiques et biologiques observées. Enfin, des tests préliminaires de viabilité cellulaire ont été effectués sur des cellules issues de poumon humain et montrent une bonne viabilité cellulaire pour des concentrations d'utilisation clinique classiques et une bonne stabilité dans le temps. Ces travaux laissent entrevoir un bon potentiel de vectorisation pour ces tensioactifs fluorés mais cela nécessite encore des études complémentaires comme la caractérisation complète des complexes formés avec l'ADN ainsi que des tests de toxicité cellulaire avant le moindre essai de transfection. / The work presented in this paper focus on the synthesis and characterization of physico-chemical properties of original fluorocarbon surfactants for obtaining nanovectors models to determine the qualifications required for efficient transport of oligonucleotides in the field of RNA interference. Building on the extensive work reported in the literature and the laboratory expertise in the field of fluorinated amphiphiles, we are interested in the synthesis of two major families of compounds. One corresponds to compounds of Géminis type with two fluorocarbon chains, two polar head groups derived from carboxylic acids and an oxyethylene or polyamine spacer arm. The structure of these compounds is conducive to the formation of stable Langmuir films that used to study interactions with the oligonucleotide. The second family corresponds to monocatenar counterparts who spontaneously self-assembled in vesicles, that is to say 3D models nanovectors. The characterization of the behavior at the air / water interface or in solution of these different molecules in the presence and absence of oligonucleotide allowed us to establish a number of relationships between molecular structure, physicochemical properties and complexation of the oligonucleotide. Preliminary tests of cell viability were performed on cells from human lung and have shown good cell viability at conventional clinical used concentrations and good stability over time. These studies suggest good potential for vectorization of these fluorinated surfactants but that still requires further study as the full characterization of complexes formed with DNA as well as tests for toxicity before testing cell transfection.

Afin de mieux comprendre la fonction et l'importance de l'interférence à l'ARN (iARN) chez les eucaryotes, l'identification des protéines cellulaires pouvant moduler ou être requises pour le fonctionnement de l'iARN, en particulier pour la fonction de la ribonucléase Dicer, et des protéines régulées par l'iARN est essentielle. Dans le premier volet de cette étude, nous avons réalisé des coimmunoprécipitations pour identifier les protéines cellulaires pouvant interagir avec Dicer chez la levure Schizosaccharomyces pombe (S. pombe). Deux protéines ont ainsi été identifiées par analyse protéomique, soit la protéine ribosomale L12 et la protéine Byr3. Le deuxième volet de cette étude a consisté à identifier les protéines régulées par la voie de l'iARN chez S. pombe. Nous avons donc procédé à des analyses par gel 2D du protéome des lignées Hu303 (type sauvage) et Hu679 (Dcr1?). Ces analyses suggèrent un rôle possible de la voie de l'iARN dans le contrôle de la glycolyse.

Les microARN (miARN) sont de petits ARN endogènes de 21-23 nucléotides (nt) impliqués dans la répression traductionnelle d'ARN messagers (ARNm) spécifiques par la reconnaissance de sites de liaison (SL) dans la région 3' non-traduite (3'NT) chez la plupart des eucaryotes. Dans le cerveau de patients atteints de la maladie d'Alzheimer, l'expression de la protéine BACE est augmentée d'environ 3 fois, malgré des niveaux inchangés d'ARNm, suggérant la perte possible d'une régulation par les miARN. De fait, la région 3'NT de mBACEl régule l'expression du gène rapporteur Renilla luciférase (Rluc), auquel il est couplé, à la baisse par plus de 70 % dans les lignées cellulaires murines neuronale (N2a) et fibroblastique (NIH 3T3). Une analyse bioinformatique a révélé deux SL potentiels pour des miARN dans la région 3'NT de mBACEl, soit pour miR-298 et miR-328. Nous avons démontré que ces miARN lient de façon spécifique leur SL présumé par EMSA in vitro. Ces interactions sont déstabilisées par la perturbation de l'appariement de la région 5' du miARN. Le SL de miR-328 est capable de médier la répression de l'expression de Rluc in vivo, alors que la mutation des SL abolit cette répression, validant ainsi la fonctionnalité du SL. Finalement, une surexpression ou une neutralisation de miR-298 et miR-328 font varier les niveaux de mBACEl endogène à la baisse et à la hausse, respectivement. Nos résultats suggèrent l'implication de miR-298 et miR-328 dans la régulation de l'expression de BACE, et offrent une nouvelle perspective étiologique de la maladie d'Alzheimer.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / La sérine/thréonine kinase mTOR (mammalian target of rapamycin) participe à un rétrocontrôle négatif envers la voie IRS-1/PI3K/Akt. Dans les adipocytes et les myocytes, l'inhibition aiguë de la voie mTORCl/S6Kl augmente la signalisation de l'insuline par la voie IRS-1/PI3K/Akt et le transport du glucose en empêchant la phosphorylation négative d'IRS-1 sur serine. Dans cette étude, l'utilisation de l'interférence à l'ARN dans les adipocytes 3T3-L1 a confirmé le rôle des protéines mTOR, raptor et S6K1 dans le rétrocontrôle négatif sur la signalisation métabolique de l'insuline. Cependant, l'inhibition chronique de la voie mTORCl/S6Kl mène également à une réduction de l'action de l'insuline sur le transport du glucose. Cette dichotomie entre l'activation de la PI3K et le transport du glucose est attribuable à une diminution imprévue de l'activation d'Akt2 et de l'expression de GLUT4. Ainsi, l'inhibition chronique de la voie mTORCl/S6Kl pourrait ne pas être une approche efficace pour rétablir la sensibilité à l'insuline.

Le virus de l'hépatite C (VHC) est un virus à ARN qui affecte plus de 170 millions de personnes à travers le monde, dont plus de 85% sont infectés de façon persistante. Le génome du VHC est susceptible au clivage par la ribonucléase Dicer in vitro, mais non in vivo, suggérant que ce virus ait développé un moyen pour échapper à la voie de l'interférence à l'ARN, un possible mécanisme de défense de l'hôte contre les virus chez l'humain. Dans le but d'examiner la possibilité que certaines protéines du virus puissent interagir et/ou interférer avec l'activité de Dicer, nous avons sondé une librairie d'ADN complémentaire virale à l'aide d'une approche de double-hybride chez la levure, en utilisant Dicer comme appât. Nous avons observé une interaction entre Dicer et différents peptides dérivés des protéines non-structurales du VHC et identifié les portions de Dicer impliquées. Nous avons également tenté de confirmer ces interactions par des expériences de coimmunoprécipitation in vivo et in vitro.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.