Parmi les différents mécanismes de défense des plantes, on compte notamment la Effector-Triggered immunity (ETI) qui repose sur l’activation de protéines de résistance, les NB-LRR (Nucleotide-Binding Leucine-Rich-repeat). Plusieurs études tentant de caractériser cette réponse immunitaire en ont conclu suite à des analyses transcriptomiques, qu’elle était qualitativement similaire à la première étape de défense. Cette première étape repose sur la reconnaissance de motifs moléculaires associés aux agents pathogènes (Pattern-triggered immunity). Très récemment, suite à l’analyse du traductome d’A. thaliana après induction de la ETI, de nombreux gènes avec une efficacité de traduction découplée de leur transcription ont été identifiés. Ainsi, de nouveaux acteurs de la réponse de défense enclenchée par l’activation d’une protéine NB-LRR ont été identifiés, certains d’entre eux étant inhibés au niveau de la traduction et d’autres induits au niveau post-transcriptionnel. Parmi ces candidats, certains sont connue pour être impliquée dans la résistance aux stress abiotiques et biotiques, tel que Redox Responsive Transcription Factor 1 (RRTF1), Phosphorylcholine Cytidylyltransferase 2 (CCT2) ou encore Pentatricopeptide repeat protein for Germination on NaCl (PGN). D’autres ont fait l’objet de nombreuses études comme c’est le cas de Target Of Rapamycin (TOR), BIG, ou CBL-interacting protein kinase 5 (CIPK5) mais n’ont jusqu’à maintenant jamais été mis en lien avec la résistance des végétaux. Enfin, un petit nombre d’entre eux, dont AT1G07280 renommé ici TPR (Tetratricopeptide repeat-like), n’ont encore jamais été caractérisés. Afin de mieux comprendre le rôle de ces protéines dans la réponse de défense des plantes, la susceptibilité de lignées transgéniques knock out pour les gènes candidats, suite à l’infection par différents agents pathogènes, a été testée. Trois pathosystèmes ont été utilisés, comprenant la plante modèle Arabidopsis thaliana, et les agents pathogènes Pto DC3000 (avirulent ou virulent), H. a. et PlAMV dans chacun des systèmes. Ainsi, en accord avec les données du traductome de défense de la plante modèle, des régulateurs négatifs (TOR, CIPK5 et CIPK25) et positifs (BIG, CCT2, RRTF1) du système de défense basal et de type NB-LRR d’A. thaliana ont été identifiés. De plus, deux des candidats régulés au niveau de la traduction durant la ETI, ne semblent avoir un impact significatif que sur la PTI : LEA et TPR. Par la suite, à travers le clonage de la région transcrite, mais non traduite (UTR) de certains gènes candidats, nous avons tenté de caractériser le ou les mécanismes responsables de la régulation de leur traduction. Enfin, dans le but de déterminer si ce phénomène de régulation traductionnelle est conservé chez différentes espèces végétales, nous avons étudié l’expression de BIG, TOR et CIPK5 après activation d’une protéine NB-LRR chez N. benthamiana. Même si les deux derniers volets de ce projet n’ont pas abouti à des résultats concluants, les nombreuses analyses menées ici ont permis de confirmer l’implication de plusieurs gènes candidats dans la résistance des plantes. De plus, cette étude a aussi permis d’identifier la reprogrammation de la traduction comme étant une étape clé à l’établissement d’une réponse de défense végétale efficace.

L’étude qui vous est présentée dans ce mémoire est réalisée chez l’organisme Schizosaccharomyces pombe et elle porte sur la caractérisation de la protéine Nab2, une protéine liant les queues poly(A) ainsi que sur son implication dans la régulation génique. Tout d’abord, il faut savoir qu’il existe quatre modes de régulation (transcriptionnel, post-transcriptionnel, traductionnel et post-traductionnel) dans lesquels interviennent différents types de protéines, en particulier des protéines liant les queues poly(A) des ARN, aussi connues sous le nom de PABPs. Ces protéines reconnaissent l’ARN à l’aide de différents domaines de liaison et elles se subdivisent en deux catégories : les PABPs nucléaires ou cytoplasmiques, représentées respectivement par PABPN1 et PABPC1 chez les mammifères. Comprendre la fonction des PABPs revêt un intérêt particulier puisqu’elles sont impliquées à différents stades de la régulation génique. Des maladies ont aussi été associées à deux PABPs nucléaires humaines, PABPN1 et ZC3H14, mais aucune association entre leur fonction réciproque et la maladie n’a pu être établie. Une des façons de comprendre leur rôle est d’étudier celui de leurs orthologues respectifs. Chez la levure à fission, un orthologue de PABPN1 a été caractérisé et il s’agit de Pab2. S. pombe possède cependant une seconde PABP nucléaire, Nab2, qui est caractérisée dans ces travaux. Des méthodes in vivo et in vitro ont été utilisées afin de confirmer le statut de la protéine, à savoir qu’il s’agit bel et bien d’une PABP nucléaire et que celle-ci est non essentielle. L’identification de partenaires protéiques de Nab2 par spectrométrie de masse a aussi permis de relier Nab2 avec des processus de régulation génique tels que l’épissage et la dégradation. Puisque Pab2 est aussi associée à des fonctions en lien avec la dégradation, il est possible de faire un parallèle entre ces deux protéines et de supposer qu’elles interagissent ensemble. La deuxième partie de ces travaux porte donc sur l’étude de la relation fonctionnelle entre Nab2 et Pab2 et elle a permis de montrer un mécanisme de régulation opportuniste basé sur la liaison de la cible ARN par l’une ou l’autre de ces PABPs. En effet, l’étude de la régulation du gène modèle RPL30-2 indique que Nab2 et Pab2 ont des rôles opposés puisqu’ils sont respectivement des régulateurs positifs et négatifs de l’expression de son transcrit.

L’implantation d'Escherichia coli dans l’intestin résulte de stratégies adaptatives globales permettant à la bactérie de survivre face aux changements de conditions environnementales. Sur le plan métabolique, la colonisation de l’intestin par E. coli parait associée à la disponibilité de sources de carbone préférentielles glycolytiques, alors que la maintenance et la persistance reposent sur sa capacité à utiliser différents substrats alternatifs (principalement gluconéogéniques) lorsque les substrats préférentiels deviennent limitant. Cette activation des processus gluconéogéniques, qui implique une réorganisation fonctionnelle complète du métabolisme, est associée in situ à de profonds remaniements physiologiques (perte de motilité, formation de biofilms, etc) nécessaires à la persistance d'E. coli dans l’intestin. Ces différents processus sont coordonnés par des réseaux de régulation particulièrement complexes, dont le système Csr (Carbon storage regulator), un des principaux régulateur post-transcriptionnel d'E. coli. Lors de ces travaux, nous avons analysé le rôle du système Csr dans la nutrition carbonée et le contrôle du métabolisme central d'E. coli sur des sources de carbone supportant sa croissance dans l'intestin et représentatives des principales voies de son métabolisme central (glycolyse, voie des pentoses phosphate, voie d'Entner-Doudoroff cycle de Krebs). Cette étude a été réalisée chez deux souches d'E. coli présentant des capacités d'implantation distinctes : la souche de laboratoire K12 MG1655, et la souche Nissle 1917, un excellent colonisateur appartenant au groupe phylogénétique B2. Une analyse détaillée du fonctionnement métabolique par des approches systémiques quantitatives haut-débit (métabolomique et analyse des flux métaboliques par marquage isotopique) a été mise en place. Elle a été exploitée pour caractériser finement le comportement métabolique de souches sauvages et de mutants du système Csr d'E. coli sur différentes sources de carbone, identifier des caractères métaboliques propres à chaque souche, et étendre le rôle du système Csr dans la nutrition carbonée et dans le contrôle du métabolisme central d'E. coli. Nos résultats démontrent que i) Csr favorise l'utilisation d'un large spectre de sources de carbone aussi bien glycolytiques que gluconéogéniques, ii) Csr contrôle un nombre de voies métaboliques plus important que ce que l'on pourrait attendre à partir de ses cibles identifiées, et iii) que le contrôle global exercé par le système Csr sur le fonctionnement du métabolisme central dépend de la source de carbone. Un rôle du système Csr dans le contrôle du métabolisme redox (production de NADH et de NADPH) et énergétique (production d'ATP), non reporté à ce jour, est également démontré. Enfin, nos résultats suggèrent un rôle de Csr dans le contrôle de la balance anabolisme-catabolisme d'E. coli. Ces travaux renforcent le rôle potentiel du système Csr dans l'adaptation d'E. coli face aux changements de conditions environnementales. / The implantation of Escherichia coli in the gut results from global adaptive strategies that allow the bacteria to survive in the changing environment of the intestine. At the metabolic level, recent findings indicate that colonisation is mainly related to the utilization of sugars and sugar derivatives through glycolytic pathways. In contrast, persistence of E. coli in the gut is supported by less favorable substrates, including small organic acids. The use of the latter compounds requires activation of gluconeogenic pathways, and efficient switching between glycolytic and gluconeogenic carbon sources is likely to be a major feature of successful adaptation to life in the intestine. These adaptive processes are controlled by highly sophisticated regulatory networks, such as the Csr (carbon storage regulator) system which is the main post-transcriptional regulator in E. coli. Csr was found to control a broad range of phenotypes allowing E. coli to successfully implant and persist in the gut, such as biofilm formation, motility as well as many functions involved in carbon nutrition, including glycolysis, gluconeogenesis, acetate and glycogen metabolism. Although Csr is likely to play an important role in the adaptation of bacteria to the nutritional context of the host, it is poorly understood sofar. In this work, we investigate the role of the Csr system in the control of E. coli metabolism on physiologically-relevant carbon sources representative of the main glycolytic (Entner-Doudoroff pathway, pentose phosphate pathway, glycolysis) and gluconeogenic pathways of E. coli. This work was carried out on two E. coli strains with distinct implantation capabilities : the K12 MG1655 laboratory strain and the Nissle 1917strain, an efficient colonizer of the gut belonging to the highly competitive B2phylogenetic group. First, we designed a complete methodology (metabolomics and 13C-metabolic flux analysis) for quantitative, system-level investigations of the actual operation of E. coli metabolism. Then, we performed detailed, system-level investigations of wild-type strains and Csr mutants. This work provides valuable information regarding systemic properties of E. coli metabolism, and identifies metabolic specificities of the Nissle 1917strain likely involved in its competitiveness in the gut. The role of Csr appears to be qualitatively and quantitatively the same in both K12 MG1655 and Nissle 1917 strains. We show that i) Csr enhances the utilisation of a broad spectrum of glycolytic and gluconeogenic carbon sources, ii) Csr controls a range of metabolic pathways wider than expected from its known target enzymes, and iii) the actual impact of the Csr system on the central metabolism of E. coli depends on the carbon source. We also demonstrate that Csr controls energy and redox metabolism in E. coli. Csr enhances the production of ATP and of reduced cofactors (NADH and NADPH), and we suggest that it also may control the catabolism-anabolism balance in E. coli. Finally, our results reinforce the potential role of the Csr system in the global adaptation of the bacterium to the gut environment.

HuR est une protéine liant l’ARN, qui contrôle l’expression des gènes au niveau post-transcriptionnel. Dans le cytoplasme, HuR module la stabilité et la capacité de traduction des ARNm sur lesquels elle se fixe. Nos résultats montrent que HuR est surexprimée dans le carcinome hépatocellulaire (CHC) humain et dans des lignées de CHC en culture. HuR est anormalement retrouvée dans le cytoplasme des cellules hépatiques tumorales, et participe à leur prolifération. En combinant l’analyse globale des gènes régulés par l’extinction d’HuR, celle des ARNm liés à HuR et celle du transcriptome des CHC humains, nous avons identifié 2 gènes dont l’expression est régulée par HuR. Ces gènes sont sous-exprimés dans les tissus de CHC et participent à la mise en place du phénotype cancéreux (résistance à l’apoptose, prolifération cellulaire, invasion,...). / HuR is a RNA binding protein that controls gene expression at post-transcriptional level. In the cytoplasm, HuR modulates the stability and capacity of mRNA translation upon which it binds. Our results show that HuR is overexpressed in hepatocellular carcinoma (HCC) and in human HCC cell lines in culture. HuR is abnormally found in the cytoplasm of liver tumor cells, and contribute to their proliferation. By combining the global analysis of genes regulated by the extinction of HuR, the mRNAs associated with HuR and the transcriptome of human HCC, we identified two genes whose expression is regulated by HuR. These genes are under-expressed in HCC tissues and participate in the development of cancerous phenotype (resistance to apoptosis, cell proliferation, invasion ,...).

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Avec la récente découverte que plus de 90% du génome humain est transcrit activement, il est raisonnable d'assumer que les mécanismes de régulation post-transcriptionnelle sont les moyens primaires contrôlant le transfert de l'information de l'ARN messager à la protéine. Ces mécanismes de régulation nécessitent généralement plusieurs éléments et motifs d'ARN en cis retrouvés à l'intérieur des ARN messagers. La structure G-quadruplexe sort de l'ordinaire en terme de motif d'ARN. L'empilement des G-quartets, formés de quatre guanines coplanaires interagissant entre elles via des paires de bases Hogsteen, la présence d'un contre-ion et la structure en tétrahélice procurent à la structure G-quadruplexe une stabilité remarquable. Cette stabilité amalgamée à ces caractéristiques structurales uniques, font de ce motif un élément de régulation post-transcriptionnelle en cis très prometteur. Cette thèse présente une étude des capacités de la structure G-quadruplexe à agir comme un élément de régulation de l'ARN. Tout d'abord, j'ai exploré l'habilité d'une structure G-quadruplexe à moduler l'activité catalytique d'un ribozyme en développant et caractérisant une nouvelle classe de ribozyme, le G-quartzyme. Le G-quartzyme résulte de la fusion d’un motif G-quadruplexe au ribozyme VHD antigénomique. Une activité catalytique dépendante de la présence de potassium en solution a été observée pour ce nouveau ribozyme. La caractérisation de cette chimère G-quadruplexe-ribozyme a permis d'apprécier la flexibilité et la capacité du G-quadruplexe à moduler l'activité catalytique d'un ribozyme. Par la suite, j'ai étudié les G-quadruplexes présents dans les 5-UTR des ARNm en utilisant une approche robuste composée de trois étapes, in silico, in vitro et in cellulo. Cette méthodologie a permis d'avoir une vue d'ensemble du phénomène. L'analyse de neuf candidats de front a été la clé afin d'apprécier l'ampleur des G-quadruplexes dans les 5'-UTR agissant comme répresseurs traductionnels. Les résultats obtenus ont permis d'identifier des nouvelles règles régissant la formation de structure G-quadruplexe d'ARN in vitro et in cellulo. Ce travail suggère que ces répresseurs de la traduction sont vastement distribués à travers le transcriptome. Finalement, cette même approche a été utilisée afin d'explorer les G-quadruplexes présents dans les 3’-UTR des ARNm. Cette analyse m'a permis de discerner un nouveau rôle pour cette structure, celui de stimuler la polyadénylation alternative d'un messager. L'étude plus en détail d'un candidat, FXR1, démontre que la présence d'un G-quadruplexe dans son 3'-UTR augmente l'expression d'un transcrit plus court, produit par polyadénylation alternative, contenant moins de sites de liaison aux microARNs résultant en un gain de synthèse protéique. Les résultats recueillis lors de ce travail suggèrent également que la présence de ce motif dans les 3'-UTR diminue l'efficacité d'un site de polyadénylation situé en aval de celui-ci. Clairement, les G-quadruplexes présents dans les 3-UTR possèdent différents rôles pouvant affecter l'expression d'un gène. En conclusion, ces études ont permis de soulever l'importance majeure des G-quadruplexes d'ARN dans différents phénomènes, dont l'expression génique, et de définir de nouvelles règles majorant leur formation et leur interaction dans divers contextes cellulaires. Les résultats présentés dans cette thèse démontrent que la structure G-quadruplexe, en plus d'être largement distribuée à travers le transcriptome, possède plusieurs caractéristiques faisant de celle-ci un élément de régulation de l'ARN des plus compétent. L’identification et la caractérisation de phénomènes cellulaires associés aux G-quadruplexes s'avèrent indispensables afin de développer de nouvelles thérapies géniques ciblant ces structures.

Le concept d’opéron, défini en 1960 par Jacob et Monod comme étant un groupe de gènes transcrits ensemble et dont les produits concourent à la réalisation d'une même fonction physiologique, est resté jusqu’à tout récemment pratiquement inchangé. Selon ce modèle, toute régulation génétique a lieu au niveau transcriptionnel et est médiée par des facteurs protéiques. Cependant, au cours de la dernière décennie, une révolution a eu lieu alors qu’il fut démontré que des petites molécules d'ARN, appelés sRNAs (small RNAs), sont capables de réprimer de manière post-transcriptionnelle l’expression d’ARN messagers (ARNm) chez les procaryotes. Leur mécanisme d'action consiste généralement à inhiber la traduction d'un ARNm en compétitionnant avec la liaison des ribosomes sur le site de liaison des ribosomes (SLR) situé dans la région 5' non traduite d’un ARNm. Cette inhibition de la traduction s’accompagne généralement d'une dégradation rapide de l’ARNm cible. Les recherches que j'ai effectuées au cours de mes études de 2e et 3e cycle ont permis de découvrir des mécanismes alternatifs par lesquels les sRNAs peuvent réprimer l’expression d’ARNm cibles. J'ai tout d’abord démontré que l’expression du petit ARN RyhB lors d'une carence en fer entraîne la dégradation seulement partielle de l’ARNm polycistronique iscRSUA. De plus, j'ai participé à l’élucidation du mécanisme de dégradation d'un ARNm par l’action d'un sRNA. En effet, nous démontrons que le site de clivage de la RNase E se situe plusieurs centaines de nucléotides en aval dans le cadre de lecture de la cible et que l'arrêt de la traduction n'est pas suffisant à l’obtention d'une dégradation rapide d'un ARNm cible. Finalement, j'ai caractérisé un nouveau mécanisme par lequel un sRNA peut réprimer la traduction d’un ARNm en s’appariant loin en amont du SLR par le recrutement de la protéine chaperon Hfq. Nous démontrons que c'est la protéine qui joue le rôle principal dans la compétition avec les ribosomes.

Ce travail de thèse porte sur l’étude des régulations post-transcriptionnelles en réponse à la lumière chez A.thaliana. Nous avons étudié deux systèmes de réponse à la lumière, la régulation traductionnelle des antennes photosynthétiques (Lhc) et la régulation de la voie des anthocyanes par le RNA silencing permettant la photoprotection. Dans une première partie nôtre approche a permis de montrer que la lumière a un impact sur le niveau de traduction global. De plus nous avons pu mettre en évidence que certaines Lhc sont régulées de façon traductionnelles en réponse à la lumière. Cette régulation pourrait être une composante du signal rétrograde entre le chlorolaste et le noyau. En parrallèle dans une seconde partie nous avons caractérisé la voie TAS4 de RNA silencing chez les plantes. Cette voie est mise en place en réponse à la forte lumière et régule l’accumulation des anthocyanes. / This work concerned post-transcriptional regulations in response to light in Arabidopsis thaliana. We are interested in two light responsive systems, translational regulation of the photosynthetic antenna protein and the regulation of the anthocyanin pathway by RNA silencing.In a first part we have shown that light affects global translation level. Furthermore our data indicate that some Lhc proteins are regulated at translational level in response to light. It seems that transaltional regulation of Lhc is a part of retrograde signaling between chlroroplast and nuclear. In a second part we have characterized the TAS4 RNA silencing pathway in Arabidopsis. We show that TAS4 regulate the accumulation of anthocyanin pathway in respose to high light.

Le Glypican-3 (GPC3) est surexprimé dans 72% des carcinomes hépatocellulaire (CHC). C’est un co-récepteur membranaire du récepteur WNT, qui appartient à la famille des protéoglycanes à sulfates d'héparane. L'objectif général de ma thèse vise à étudier les mécanismes de régulation post-transcriptionnelle de l’expression du GPC3 dans le CHC. Pour cela, j’ai développé un test fonctionnel qui m’a permis de cribler une bibliothèque de 876 microARNs humains. Ceci a conduit à l’identification de 5 microARNs régulateurs de l’expression de l’ARNm codant pour le GPC3 via sa région 3’ non traduite (NT). Mon travail de thèse porte plus particulièrement sur le miR-1271 et le miR-1291 car ils sont dérégulés dans le CHC et sont respectivement inhibiteur et inducteur de l’expression du GPC3. Dans un premier projet, j’ai démontré que le miR-1271 cible directement la région 3’NT du GPC3 et diminue la stabilité de son ARNm. Ce microARN est sous-exprimé dans le CHC et son expression corrèle négativement avec celle de l'ARNm du GPC3 dans les CHC associés à une infection par le virus de l’hépatite B. Dans un deuxième projet, j’ai démontré que le miR-1291 régule positivement l’expression du GPC3 en inhibant un facteur intermédiaire. Une analyse in silico a permis d’identifier IRE1α comme candidat. IRE1α est une protéine transmembranaire du réticulum endoplasmique (RE) qui participe à « l’Unfolded Protein Response », une réponse adaptative activée lors de l’accumulation de protéines mal conformées dans le RE. J’ai démontré qu’IRE1α clive l’ARNm codant pour le GPC3 grâce à son activité endoribonucléase. D’autre part, le miR-1291 cible directement l’ARNm codant pour IRE1α dans sa région 5’NT ce qui inhibe son expression et induit une surexpression du GPC3. Le miR-1291 est surexprimé dans le CHC et son expression corrèle positivement avec celle de l’ARNm du GPC3. En conclusion, mon travail de thèse m’a permis de mettre en évidence et de caractériser deux nouveaux microARNs (miR-1271 et miR-1291) contrôlant l’expression du GPC3 par des mécanismes directs ou indirects. La pertinence physiopathologique de ces régulations dans le CHC est en accord avec les niveaux d’expression respectifs de ces microARNs, qui pourraient contribuer à la surexpression du GPC3 dans ces tumeurs. / Glypican-3 (GPC3) is overexpressed in 72% of hepatocellular carcinoma (HCC). It is a co-receptor for WNT receptor and belongs to the heparan sulfate proteoglycans family. The general objective of my PhD thesis was to study the mechanisms by which GPC3 is post-transcriptionnally regulated in HCC. To this end, I developed a functional test that allowed me to screen a library of 876 human microRNAs. This led me to identify 5 microRNAs that regulate the expression of GPC3 mRNA through its 3’Untranslated Region (UTR). The work presented in this thesis particulary focuses on miR-1271 and miR-1291 as both microRNAs present a deregulated expression in HCC and are respectively inhibitor and activator of GPC3 mRNA expression. In a first project, I demonstrated that miR-1271 directly binds to GPC3 mRNA 3’UTR and affects its stability. This microRNA is underexpressed in HCC and its expression negatively correlates with that of GPC3 mRNA in a subgroup of HCC corresponding to those associated with hepatitis B virus infection. In a second project, I demonstrated that miR-1291 postively regulates the expression of GPC3 mRNA by targeting an intermediate factor. An in silico analysis led to the identification of the Inositol Requiring Enzyme 1 alpha (IRE1α) as a potential candidate. IRE1α is an endoplasmic reticulum (ER) resident type I transmembrane protein and contributes to the signaling of the Unfolded Protein Response (UPR). The UPR is an adaptive response activated upon accumulation of improperly folded proteins in the ER. I showed that IRE1α cleaves GPC3 mRNA through its endoribonuclease activity. Moreover I demonstrated that miR-1291 directly targets IRE1α mRNA through its 5’UTR, thereby decreasing its expression and contributing to GPC3 mRNA overexpression. MiR-1291 is overexpressed in HCC and its expression positively correlates with that of GPC3 mRNA. In summary, the work carried out during my PhD allowed the identification and the characterization of two new microRNAs (miR-1271 and miR-1291) that control the expression of GPC3 mRNA through direct or indirect mechanisms. The pathophysiological relevance of these regulatory mechanisms is in agreement with the respective expression levels of these microRNAs in HCC, which could therefore contribute to the overexpression of GPC3 in those tumors.

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