Le concept d’opéron, défini en 1960 par Jacob et Monod comme étant un groupe de gènes transcrits ensemble et dont les produits concourent à la réalisation d'une même fonction physiologique, est resté jusqu’à tout récemment pratiquement inchangé. Selon ce modèle, toute régulation génétique a lieu au niveau transcriptionnel et est médiée par des facteurs protéiques. Cependant, au cours de la dernière décennie, une révolution a eu lieu alors qu’il fut démontré que des petites molécules d'ARN, appelés sRNAs (small RNAs), sont capables de réprimer de manière post-transcriptionnelle l’expression d’ARN messagers (ARNm) chez les procaryotes. Leur mécanisme d'action consiste généralement à inhiber la traduction d'un ARNm en compétitionnant avec la liaison des ribosomes sur le site de liaison des ribosomes (SLR) situé dans la région 5' non traduite d’un ARNm. Cette inhibition de la traduction s’accompagne généralement d'une dégradation rapide de l’ARNm cible. Les recherches que j'ai effectuées au cours de mes études de 2e et 3e cycle ont permis de découvrir des mécanismes alternatifs par lesquels les sRNAs peuvent réprimer l’expression d’ARNm cibles. J'ai tout d’abord démontré que l’expression du petit ARN RyhB lors d'une carence en fer entraîne la dégradation seulement partielle de l’ARNm polycistronique iscRSUA. De plus, j'ai participé à l’élucidation du mécanisme de dégradation d'un ARNm par l’action d'un sRNA. En effet, nous démontrons que le site de clivage de la RNase E se situe plusieurs centaines de nucléotides en aval dans le cadre de lecture de la cible et que l'arrêt de la traduction n'est pas suffisant à l’obtention d'une dégradation rapide d'un ARNm cible. Finalement, j'ai caractérisé un nouveau mécanisme par lequel un sRNA peut réprimer la traduction d’un ARNm en s’appariant loin en amont du SLR par le recrutement de la protéine chaperon Hfq. Nous démontrons que c'est la protéine qui joue le rôle principal dans la compétition avec les ribosomes.

Les P-bodies sont des granules cytoplasmiques de fonction inconnue. Ils sont néanmoins conservés de la levure à l’homme, suggérant un rôle important chez les eucaryotes. L’analyse de l’influence de l’expression de certaines protéines pouvant se localiser dans ces granules a permis de mettre en évidence le rôle crucial de DDX6 dans l’assemblage des P-bodies. En effet, l’inhibition de l’expression de DDX6 dans les cellules humaines empêche l’assemblage des P-bodies. L’étude de la protéine DDX6 semblait donc être un bon point de départ pour comprendre d’avantage le rôle des P-bodies. Cette hélicase à motif DEAD de 54 kDa interagit avec des protéines du complexe répression de la traduction CPEB chez le Xénope, mais également avec des protéines des complexes de dégradation 5’-3’ et 3’-5 ‘ des ARNm chez les mammifères, les levures et les drosophiles, ou encore avec les protéines Argonautes du complexe miRISC chez les mammifères. Nos travaux se sont donc intéressés à déterminer les principales fonctions de DDX6 dans les cellules humaines. Les complexes protéiques contenant DDX6 ont été purifiés à partir de lysats cytoplasmiques de cellules HEK293 transfectées avec un plasmide codant pour la protéine FLAG-DDX6-HA. Plus de 300 partenaires protéiques ont été identifiés en spectrométrie de masse. Trois complexes majeurs contenant DDX6 ont été mis en évidence : un complexe de répression « CPEB-like », le complexe de décoiffage des ARNm, et un complexe contenant les ataxin-2 et ataxin-2-like. Les protéines du cœur du complexe de jonction d’exons sont également en interaction avec DDX6, suggérant que DDX6 interagit avec des ARNm tout juste sortis du noyau. Enfin, le grand nombre et les hauts scores avec lesquels ont été identifiés les protéines ribosomales nous ont conduit à analyser la présence de DDX6 au niveau des polysomes. L’analyse de lysats cytoplasmiques sur gradient de sucrose nous a permis de mettre en évidence l’association d’une fraction de DDX6 aux polysomes. Toutes ces observations mettent en évidence le rôle multiple de DDX6 entre répression et dégradation des ARNm, dans les cellules humaines. L’hélicase pourrait permettre le recrutement du complexe de répression par des ARNm activement traduits. La fixation multiple de DDX6 à l’ARNm pourrait être un moyen de recruter simultanément les complexes de répression et de dégradation des ARNm sur un même ARNm. / P-bodies are cytoplasmic granules. Their function is unknown, but they are conserved from the yeast to humans, suggesting an important role through eukaryotes. The expression inhibition of several proteins localized in P-bodies leads to their disassembly. In most cases, a cellular stress induced by arsenite treatment causes P-body assembly, except in cells depleted for DDX6. Since this observation showed that DDX6 is necessary for P-body assembly, to study this protein is a good starting point to further understand the role of P-bodies. This 54 kDa DEAD-box helicase interacts with proteins of the CPEB repression complex in xenopus oocytes, but also with protein of the déadénylation and dacapping complex in yeasts, drosophila and mammals, and with proteins of the miRISC complex. Our project was to determine the DDX6 main protein partners in human cells. To do so, DDX6 containing complexes were purified using HEK293 cells transfected with a plasmid encoding for the FLAG-DDX6-HA. Over 300 partners were identified by mass spectrometry. Three main DDX6 containing complexes were highlighted in human cells: A “CPEB-like” repression complex, the decapping complex, and a complex containing ATXN2 and ATXN2L proteins. Exon junction complex core proteins were also identified as DDX6 partners, raising the possibility that DDX6 interacts with mRNA not yet translated. A large number of ribosomal proteins were also identified with high scores, suggesting that DDX6 interacts with actively translated mRNA. Analyze of cytoplasmic lysates on sucrose gradients showed that DDX6 is partially associated with polysomes. To conclude, these observations showed the multiple roles of DDX6 in human cell, between mRNA repression and degradation. The helicase could allow the recruitment of the repression complex on actively translated mRNA. In a nutshell, the multiple binding of DDX6 on one mRNA could be a way to enable the fixation of repression and degradation complexes at the same time, on the same mRNA.

La dégradation des ARN messagers (ARNm) est un processus universel extrêmement complexe. D’une manière semblable aux polymerases pour la transcription et ribosomes pour la traduction, les complexes de protéines effectuant la dégradation des ARNm sont précisément régulés. La dégradation des ARNm eucaryotes s’effectue selon un schéma conservé évolutivement qui est initié par la déadénylation résultant dans la formation de transcrits avec des queues polyA courtes. De tels intermédiaires sont alors dégradés par le clivage de leur coiffe suivi par une digestion exonucléolytique 5’-3’ effectuée par Xrn1, ou alternativement par une digestion 3 ’-5’ catalysée par l’exosome. Dans ma thèse je présente une dissection fonctionnelle du complexe de déadénylation CCR4-NOT basée sur son analyse structurale. Je me suis essentiellement intéressé à cinq questions fondamentales concernant ce complexe : La formation du complexe CCR4-NOT complexe est-elle requise pour la déadénylation ? Quel est le rôle moléculaire de sous-unités Not2/3/5 du complexe ? Pourquoi la protéine Not1 est-elle essentielle chez la levure ? Le complexe CCR4-NOT joue-t-il un rôle dans la répression de la traduction ? Comment le complexe CCR4-NOT est-il ciblé sur ses substrats ARNm ? / MRNA degradation is a highly complex and versatile process. In a manner similar to polymerase complexes in transcription and ribosomes in translation, protein complexes mediating mRNA decay are tightly regulated. Eukaryotic mRNA decay follows a conserved pathway initiated by deadenylation that generates transcripts with short polyA tails. The latter intermediates are degraded either by decapping followed with 5’-3’ trimming mediated by Xrn1, or by exosome-mediated digestion in the 3’-5’ direction. In my thesis I present a functional dissection of the Ccr4-Not deadenylase complex based on its structural analysis. Essentially, I addressed five fundamental questions related to this complex: Is CCR4-NOT complex formation required for deadenylation activity? What is the molecular role of associated Not2/3/5 subunits? Why is the Not1 protein essential in yeast? Does the CCR4-NOT complex play role in translation regulation? How is the CCR4-NOT complex targeted to its mRNA substrates?