Les systèmes toxine-antitoxine (STA) sont généralement constitués de deux petites protéines cytoplasmiques : une toxine stable et une antitoxine instable capable de neutraliser la toxine et de réprimer l’expression de l’opéron toxine-antitoxine. Une étude menée au laboratoire avait mis en évidence que la perte du gène hicB3 (ypo3369) de Y. pestis, codant une antitoxine solitaire putative, entraine un retard de la croissance bactérienne in vitro et une atténuation de la virulence dans un modèle murin de peste bubonique (Pradel et al., 2014). Par analyse in silico, nous avons détecté, en amont de hicB3, un petit gène non annoté candidat pour coder la toxine HicA3. La surproduction de HicA3 provoque la bactériostase chez Escherichia coli et Y. pestis et la production subséquente de HicB3 restaure la croissance. HicA3 et HicB3 constituent donc un STA fonctionnel. Cependant, la perte du STA HicA3B3 n’affecte pas la virulence de Y. pestis dans un modèle murin de peste bubonique. Nous avons ensuite purifié et caractérisé les protéines HicA3 et HicB3. La toxine HicA3 est une ribonucléase monomérique de 66 aa qui comporte un résidu histidine catalytique essentiel pour son activité. L’antitoxine HicB3 a une double fonction : elle interagit avec HicA3 pour la neutraliser et elle réprime le promoteur de l’opéron hicA3B3. Des expériences de retard sur gel et de fusions transcriptionnelles avec un gène rapporteur ont révélé que l’antitoxine HicB3 et le complexe HicA3-HicB3 se fixent sur deux opérateurs chevauchant les boîtes -10 et -35 du promoteur PhicA3. Nous avons également résolu la structure cristalline de l’antitoxine HicB3 et celle du complexe HicA3-HicB3. HicB3 est un tétramère qui comporte deux domaines de fixation à l’ADN du type ruban-hélice-hélice et deux domaines de neutralisation de la toxine. / Toxin-antitoxin systems (TAS) are generally constituted by two small cytoplasmic proteins: a stable toxin and an unstable antitoxin which neutralizes the toxin and represses the expression of the toxin-antitoxin operon. In previous research, our lab found that Yersinia pestis lacking the hicB3 (ypo3369) gene, encoding a putative orphan antitoxin, has a growth defect in vitro and is attenuated for virulence in a murine model of bubonic plague (Pradel et al., 2014). In silico analysis revealed a small gene upstream of hicB3, encoding a putative toxin that we called HicA3. HicA3 overproduction generates bacteriostasis of Escherichia coli and Y. pestis, and the subsequent production of HicB3 restores cell growth. HicA3 and HicB3 thus constitute a functional TAS. However, the lack of the HicA3B3 TAS does not affect Y. pestis virulence in a murine model of bubonic plague. We then purified and characterized the HicA3 and HicB3 proteins. The HicA3 toxin is a monomeric 66-aa ribonuclease with a catalytic histidine residue required for its activity. The HicB3 antitoxin has two functions: it binds and neutralizes HicA3 and it represses the hicA3B3 operon promoter. Gel-shift assays and transcriptional reporter fusion experiments showed that both HicB3 and the HicA3-HicB3 complex bind to two operators overlapping the -10 and -35 boxes of the PhicA3 promoter. We also solved the crystal structures of the HicB3 antitoxin and the HicA3-HicB3 complex. HicB3 is a tetramer with two DNA binding domains of the ribbon-helix-helix type and two toxin neutralization domains.

Afin de mieux comprendre la fonction et l'importance de l'interférence à l'ARN (iARN) chez les eucaryotes, l'identification des protéines cellulaires pouvant moduler ou être requises pour le fonctionnement de l'iARN, en particulier pour la fonction de la ribonucléase Dicer, et des protéines régulées par l'iARN est essentielle. Dans le premier volet de cette étude, nous avons réalisé des coimmunoprécipitations pour identifier les protéines cellulaires pouvant interagir avec Dicer chez la levure Schizosaccharomyces pombe (S. pombe). Deux protéines ont ainsi été identifiées par analyse protéomique, soit la protéine ribosomale L12 et la protéine Byr3. Le deuxième volet de cette étude a consisté à identifier les protéines régulées par la voie de l'iARN chez S. pombe. Nous avons donc procédé à des analyses par gel 2D du protéome des lignées Hu303 (type sauvage) et Hu679 (Dcr1?). Ces analyses suggèrent un rôle possible de la voie de l'iARN dans le contrôle de la glycolyse.

Le virus de l'hépatite C (VHC) est un virus à ARN qui affecte plus de 170 millions de personnes à travers le monde, dont plus de 85% sont infectés de façon persistante. Le génome du VHC est susceptible au clivage par la ribonucléase Dicer in vitro, mais non in vivo, suggérant que ce virus ait développé un moyen pour échapper à la voie de l'interférence à l'ARN, un possible mécanisme de défense de l'hôte contre les virus chez l'humain. Dans le but d'examiner la possibilité que certaines protéines du virus puissent interagir et/ou interférer avec l'activité de Dicer, nous avons sondé une librairie d'ADN complémentaire virale à l'aide d'une approche de double-hybride chez la levure, en utilisant Dicer comme appât. Nous avons observé une interaction entre Dicer et différents peptides dérivés des protéines non-structurales du VHC et identifié les portions de Dicer impliquées. Nous avons également tenté de confirmer ces interactions par des expériences de coimmunoprécipitation in vivo et in vitro.

Bovine pancreatic ribonuclease A (RNase A, EC 3.1.27.5) has been extensively studied from the structural, mechanistic and functional points of view. Within the protein folding context, it constitutes a good model of study although a rather complicated one due to the presence in the native state of four disulphide bonds and the existence of two X-proline peptide bonds in cis conformation. Most of these studies has focused on the alteration of cysteine or proline residues to study, from a kinetic point of view, the formation of the disulphide bonds or the characterization of the species present in the heterogeneous non-reduced unfolded state, respectively. In these work we have used site-directed mutagenesis to change the characteristics of a postulated chain folding initiation site (CFIS) in RNase A / La ribonucleasa A de pàncrees boví (RNasa A, EC 3.1.27.5) ha estat extensament estudiada des de punts de vista estructurals, mecanístics i funcionals. Dins del marc del plegament proteic, la RNasa A ha estat un bon model per als estudis de plegament/desplegament proteic, malgrat que força complicat a causa de la presència en l'estat natiu de quatre enllaços disulfur i l’existència de dos enllaços peptídics X-prolina en conformació cis. La major part d'aquests estudis s'han centrat en l'alteració de residus de cisteïna o de prolina per estudiar, des d'un punt de vista cinètic, la formació dels enllaços disulfur o la caracterització de les espècies presents en l'heterogeni estat desplegat de la proteïna amb els enllaços disulfur intactes, respectivament. En aquest treball hem utilitzat la mutagènesi dirigida per oligonucleòtid per canviar les característiques d'una regió de la RNasa A postulada com a iniciadora del plegament