Les travaux présentés dans ce document retracent mes activités de Recherche dans le domaine de la Biologie Cellulaire et Moléculaire, qui m'ont conduit de la Toxicologie Génétique à la Radiobiologie. L'action des génotoxiques sur le patrimoine héréditaire a toujours constitué le fil conducteur de mes activités. A chaque étape de mon parcours, j'ai développé des modèles biologiques destinés à répondre à des thématiques bien précises. <br />Mon travail de recherche a commencé pendant deux ans à Rhône Poulenc (1985 1986) par le test de la réparation de l'ADN in vitro et in vivo (UDS ou unscheduled DNA synthesis) sur hépatocytes de rats Sprague Dawley et Fischer 344. Ce test de « dommages primaires » permet de prédire l'activité génotoxique des xénobiotiques. Dans l'approche in vivo, mon étude mettait en évidence l'importance du métabolisme intestinal dans l'activation métabolique de certains agents génotoxiques indirects (dérivés dinitrotoluène). J'ai ensuite débutée une approche plus fondamentale au CNRS (1988 1992). En utilisant les outils de la Génétique Moléculaire, j'ai créé un nouveau modèle cellulaire exprimant un système de régulation génique qui permet de détecter rapidement les agents modifiant le profil de méthylation de l'ADN au niveau des sites 5'CpG3'. Ces xénobiotiques, à l'origine des « épimutations » et de la dérégulation de l'expression de certains gènes, ont une contribution importante et souvent sous estimée dans la progression tumorale.<br />En 1992, je me suis orienté vers la Radiobiologie au DKFZ (Deutsches Krebsforschungszentrum ; Heidelberg, Allemagne) puis au CEA (LRA). Il s'agissait d'adapter à la Radiobiologie le modèle de culture de la peau humaine reconstituée in vitro, destiné auparavant à étudier la physiologie des kératinocytes normaux ou pathologiques. L'objectif était (i) d'irradier les spécimens de peau et d'étudier les effets d'une irradiation sur les kératinocytes et les fibroblastes), et (ii) de mimer in vitro la fibrose radioinduite. Ce modèle de culture alternatif prend en compte les interactions entre cellules épithéliales et mésenchymateuses. Au cours de ce travail, je me suis intéressé à la protéine humaine HSAkin17. Mon activité s'est alors recentrée sur cette protéine. Le développement de nombreuses approches cellulaires et moléculaires au laboratoire (LGR) nous a permis de mettre en évidence l'implication de cette protéine dans la réplication de l'ADN, notamment lorsque la progression des fourches de réplication est bloquée par des dommages non réparés de l'ADN. Nous avons démontré que cette protéine était un composant nécessaire au complexe de réplication de l'ADN et qu'elle avait une activité de reconnaissance des origines de réplication endogènes.<br />Depuis la fin 2003, j'ai développé et valider les vecteurs pEBVsiRNA pour une interférence ARN (RNAi) à très long terme (> 500 jours). Ce travail a été mené sur de nombreux gènes (110 gènes ciblés), essentiellement des gènes de la réparation de l'ADN. Un brevet a été déposé en 2005. Cette approche nous permet maintenant de travailler sur les interconnexions entre les mécanismes de réparation de l'ADN dans des lignées isogèniques. A ce jour, je suis le seul à proposer un tel modèle cellulaire cohérent avec un aussi grand nombre de clones stables, maintenus en culture aussi longtemps. La création de clones silencieux, stables à très long terme, m'a permis de participer à l'élaboration de nouveaux projets de Recherche dans le cadre de nombreuses collaborations, dont certaines seront énoncées dans ce rapport. Par ailleurs, ma démarche a aboutit à une valorisation industrielle.

La réponse au stress génotoxique met en jeu de nombreux facteurs cellulaires impliqués dans un réseau complexe de mécanismes visant à assurer le maintien de l'intégrité génétique de l'organisme. Ces mécanismes incluent la détection et la réparation des lésions de l'ADN, la régulation de la transcription et de la réplication et le déclenchement éventuel de la mort cellulaire. Parmi les protéines nucléaires participant à cette réponse, les protéines kin17 sont des protéines à doigt de zinc conservées au cours de l'évolution et activées par les ultraviolets (UV) et les radiations ionisantes (RI). Nous avons montré que la protéine kin17 humaine (HSAkin17) est présente dans la cellule sous une forme soluble et sous une forme ancrée aux structures nucléaires. Une fraction de la protéine HSAkin17 est directement associée à la chromatine. La protéine HSAkin17 est recrutée sur les structures nucléaires 24 heures après traitement par différents agents induisant des cassures double-brin de l'ADN (DSB) et/ou un blocage des fourches de réplication. Par ailleurs, la réduction du niveau total de protéine HSAkin17 sensibilise les cellules RKO aux RI. Nous présentons également des résultats impliquant la protéine HSAkin17 dans la réplication de l'ADN. Cette hypothèse a été confirmée par la démonstration biochimique de son appartenance au complexe de réplication. La protéine HSAkin17 pourrait donc assurer le lien entre réplication et réparation de l'ADN, un défaut de la voie HSAkin17 entraînant une augmentation de la radiosensibilité. Dans un deuxième temps, nous avons étudié les interactions entre deux mécanismes de réparation de l'ADN : la réparation par excision de nucléotides (NER) et la recombinaison non homologue (NHEJ). Le NER prend en charge une grande variété de lésions provoquant une distortion de la double hélice d'ADN dont les dimères de pyrimidines induits par les UV. Le NHEJ assure la réparation des DSB par jonction directe des extrémités d'ADN. Nous avons utilisé un modèle syngénique de défaut de la réparation basé sur l'interférence ARN développé au laboratoire. En effet, les vecteurs dérivés du virus d'Epstein-Barr (pEBV) permettent l'expression à long terme de siRNA et l'extinction spécifique du gène cible. La réduction de l'expression de gènes impliqués dans le NER (XPA et XPC) ou le NHEJ (DNA-PKcs et XRCC4) entraîne les phénotypes attendus. Nous avons montré que la réduction du niveau de protéine XPC sensibilise les cellules HeLa à l'étoposide, un inhibiteur de la topoisomérase II qui induit des DBS, et affecte leur activité NHEJ in vitro. Ces résultats suggèrent que la protéine XPC pourrait être requise pour la réparation de certains types de cassures ou participer à un système global de régulation de la réponse cellulaire aux lésions de l'ADN. Notre modèle ouvre donc des perspectives intéressantes pour l'étude des relations entre les différentes voies de réparation de l'ADN dans des cellules humaines.

Le maintien de l'intégrité du patrimoine génétique est essentiel à la survie des organismes vivants. Face aux nombreuses sources de stress génotoxiques qui induisent des dommages de l'ADN, les cellules ont mis en place des mécanismes complexes capables de détecter et réparer ces lésions. Parmi ces sources, figurent les rayonnements ultraviolets (UV) contenus dans la lumière solaire, qui modifient la structure de l'ADN et peuvent conduire à l'introduction de mutations. Chez l'homme, la grande majorité des dommages de l'ADN produits par les rayonnements est éliminée par le système NER (Nucleotide Excision Repair), un système capable d'exciser les nucléotides lésés et de les remplacer. Une déficience de cette voie de réparation peut mener à l'apoptose (mort programmée des cellules), et augmente la susceptibilité de développer des maladies graves telles que le cancer. Le système NER met en œuvre de nombreuses protéines impliquées dans des mécanismes variés tels que la détection, la signalisation, ou la réparation de l'ADN. La protéine eucaryote KIN17, récemment découverte dans le noyau de la cellule humaine, semble appartenir à ce système de réparation. Cependant, son rôle précis dans la réponse aux dommages de l'ADN reste à ce jour inconnu. C'est pourquoi, nous avons entrepris une caractérisation structurale et fonctionnelle de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine (domaine K2) afin d'améliorer la connaissance de ses fonctions, de ses partenaires biologiques, et de ses modes de fonctionnement. La première partie de ce manuscrit est consacrée à la préparation de l'échantillon de protéine en vue d'une analyse structurale par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN). Le travail a dans un premier temps consisté à choisir et optimiser le système d'expression de domaines structuraux d'une autre protéine : la proline déshydrogénase PRODH. Dans un second temps, la meilleure stratégie de préparation de l'échantillon a été appliquée à la protéine KIN17 pour produire, puis résoudre la structure tridimensionnelle du domaine K2 par RMN et Modélisation Moléculaire. Nous avons montré que la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine adopte un repliement caractéristique de la famille structurale « Winged Helix » des protéines de liaison aux acides nucléiques. Cependant, l'analyse des détails structuraux du domaine K2, la comparaison avec des protéines de fonction connue de la même classe structurale, et des études électrophorétiques, révèlent l'incapacité de ce domaine à lier l'ADN et l'ARN de manière autonome. En revanche, nous avons mis en évidence, par une étude RMN complémentaire, l'existence d'une surface ultra conservée impliquée dans des interactions de type protéine-protéine intra-moléculaires entre le motif « Winged Helix » de la région 51-160 et la région N-terminale 1-50 de KIN17 humaine.

Très conservée, plus abondante dans les cellules en prolifération que dans les cellules<br />normales, stimulée par les rayonnements UV et ionisants, autant de caractéristiques qui ont<br />suscité notre intérêt pour l'analyse structurale et fonctionnelle de la protéine KIN17 humaine<br />(hKIN17) dans le but de caractériser sa ou ses fonction(s) dans la cellule. Plusieurs propriétés ont<br />été décrites pour la protéine hKIN17 dans différents mécanismes cellulaires tels que la réplication<br />de l'ADN, la réparation de l'ADN et le métabolisme de l'ARN. Pendant ma thèse, j'ai montré en<br />combinant des données de DC, RMN et SAXS que la protéine hKIN17 possède un domaine<br />structuré adoptant probablement le repliement d'un doigt de zinc et un domaine winged helix<br />dans sa région N-terminale. Seul le premier domaine lie les acides nucléiques, le deuxième<br />domaine ayant pour partenaires plusieurs hélicases à ARN impliquées dans la transcription et la<br />traduction. J'ai résolu par cristallographie aux rayons X la structure du domaine C-terminal qui<br />est retrouvé uniquement chez les eucaryotes supérieurs et se replie en un double domaine de type<br />SH3. J'ai montré par différentes méthodes biochimiques (filtration sur gel, gel IEF natif) que ce<br />domaine ancre la protéine hKIN17 à un complexe nucléaire acide de haut poids moléculaire dont<br />les composants sont en cours d'identification par spectrométrie de masse. De plus, il lie l'ARN et<br />les histones modifiées. L'ensemble de ces résultats confirment l'implication de la protéine<br />hKIN17 dans le métabolisme de l'ARN et précisent le rôle de chacun des domaines au sein de la<br />protéine.