Au Canada, en 2015, il était estimé que 78 000 personnes allaient mourir d’un cancer, représentant 30 % de tous les décès et faisant de celui-ci la première cause de mortalité. De plus, 196 900 nouveaux cas de cancers seraient découverts au cours de cette même année (Canadian Cancer Society’s Advisory Committee on Cancer Statistics. Canadian Cancer Statistics 2015. Toronto, ON : Canadian Cancer Society; 2015). L’intégrité du génome est chaque jour menacée par des conditions environnementales qui endommagent l’ADN (ultraviolets, produits chimiques divers, etc.). Parmi les différents types de lésions, l’un des plus délétères et pouvant mener au cancer est la cassure double-brin (CDB). Celle-ci peut être réparée suivant deux mécanismes majeurs : la jonction des extrémités non homologues (Non-Homologous End-Joining ou NHEJ) ou la Recombinaison Homologue (RH). Cette dernière, prépondérante pendant les phases S/G2, consiste en la réparation d’une CDB grâce à l’utilisation d’une chromatide soeur comme modèle, permettant une réparation fidèle du dommage. La RH est sous la dépendance de diverses protéines, dont RAD51, PALB2 et BRCA2. Ces deux dernières sont connues pour être mutées dans les cancers du sein et des ovaires. Ainsi, la compréhension de l’implication de chaque acteur dans la RH est un objectif fondamental dans la lutte contre le cancer et constitue l’objectif général de cette thèse. En 2012, une étude a montré qu’une nouvelle protéine, APRIN (Androgen-induced PRoliferation INhibitor), appartenant au complexe cohésine, interagissait avec BRCA2 et jouait un rôle dans la RH. Les rôles précis d’APRIN dans ce mécanisme restaient toutefois à être définis. Le projet principal de cette thèse repose sur la caractérisation fonctionnelle d’APRIN dans la réparation par RH. Nous révélons qu’APRIN aurait un rôle spécifique et indépendant de celui de la cohésine dans la RH, et pourrait agir à diverses étapes cruciales de ce mécanisme. De plus, nos données montrent que le niveau d’expression d’APRIN pourrait être un marqueur de prédiction dans le cancer ovarien. Étant donné qu’APRIN interagit aussi avec PALB2, autre partenaire essentiel de BRCA2, nous avons également étudié et caractérisé les fonctions de divers mutants de PALB2. Nous faisons ainsi la découverte inattendue d’un nouveau phénotype induit par une troncation de cette protéine associée à certains cancers agressifs. Ainsi, cette thèse apporte des informations supplémentaires et indispensables à la compréhension de la réparation de l’ADN par RH et de la survenue de certains cancers. / Cancer is the leading cause of death in Canada (30% of all deaths). By 2015, it was estimated that 78,000 Canadians would die of cancer. Moreover, 196,900 new cases of cancer were discovered in that same year (Canadian Cancer Society’s Advisory Committee on Cancer Statistics. Canadian Cancer Statistics 2015. Toronto, ON: Canadian Cancer Society; 2015). Each day, genome integrity is threatened by environmental conditions that can induce DNA damages (UV, chemicals, etc.). Amongst different types of lesions, double-strand breaks (DSB) are one of the most deleterious and can lead to cancer development. DSB can be repaired following two different and major pathways: Non-Homologous End-Joining (NHEJ) and Homologous Recombination (HR). HR mainly takes place during S/G2 phases and uses the intact sister chromatid as a template for repair. This renders HR to be a faithful mechanism, which depends on three important proteins: RAD51, PALB2 and BRCA2. The last two proteins are frequently found mutated in both breast and ovarian cancers. Understanding how each HR actor is specifically implicated in this pathway is important to develop strategies to fight cancer and constitutes the general aim of this thesis. In 2012, APRIN (Androgen-induced PRoliferation INhibitor), known as a regulator of the cohesin complex, was described as a new interacting partner of BRCA2 and an actor of HR. Nevertheless, how APRIN was specifically implicated in HR remained unclear. Hence, the major objective of this thesis was to functionally characterize APRIN in HR. We show that APRIN possesses a specific and independent role from the cohesin complex in HR and could be implicated in different steps during this repair pathway. Interestingly, APRIN expression levels in ovarian cancer tumours may be used as a prognostic marker. Moreover, to achieve the general objective of this thesis, we focused on another BRCA2 partner : PALB2. We studied the impact of different truncating mutations found in cancers on PALB2 functions. Surprisingly, we discovered that the consequence of an aggressive cancer-causing mutation could stem from an aberrant localization of PALB2. Consequently, this thesis provides important new information on the repair of DSB by HR and on the occurrence of cancers.

Thèse en cotutelle, Doctorat en biologie cellulaire et moléculaire, Université Laval, Québec, Canada et Université de Nantes, Nantes, France / Les cellules humaines sont soumises à des stress induisant des cassures double-brin de l’ADN (CDB). Ces CDB sont réparées notamment par la recombinaison homologue, impliquant les protéines RAD51 et RAD52. Une stratégie thérapeutique émergente est de développer des molécules inhibant RAD51 ou RAD52 afin d’accentuer l’instabilité génétique et la mort de la cellule cancéreuse. En effet, dans certains cancers, l’activité de RAD51 est dérégulée promouvant la prolifération tumorale. Il existe plusieurs molécules inhibitrices de RAD51 et nous nous sommes intéressés au DIDS dont le mode d’action n’a pas encore été déterminé. Concernant RAD52, une létalité synthétique a été montrée lorsque celle-ci est inactivée dans des cellules déficientes en BRCA1, BRCA2 ou PALB2, trois gènes mutés dans de nombreux cancers. Récemment, trois types de molécules inhibitrices de RAD52 ont été mis en évidence. Nous avons tout d’abord étudié l’impact du DIDS ainsi que des molécules dérivées afin de comprendre le mécanisme mis en jeu. Nous avons montré que le DIDS, ainsi que ses dérivés inhibent la liaison de RAD51 à l’ADN. Ces molécules empêchent la formation du nucléofilament entrainant une diminution du nombre de foyers RAD51. Nous avons développé une méthode de criblage par fluorescence pour évaluer l’effet d’une banque de 696 molécules sur la capacité de RAD52 à hybrider deux ADNsb. Deux molécules capables d’inhiber la fonction d’hybridation de RAD52 ont été mises au jour. In vivo, elles entrainent une diminution de la survie de cellules déficientes en PALB2. La recherche et le développement de nouveaux inhibiteurs de RAD51 et RAD52 constituent des stratégies thérapeutiques d’avenir. / Human cells are subjected to stress inducing DNA double-strand breaks (DSB). DSB are repaired in particular by homologous recombination, involving RAD51 and RAD52 proteins. An emerging therapeutic strategy is to develop RAD51 or RAD52 inhibitors that promote genetic instability and induce cancer cell death. In some cancers, the activity of RAD51 is deregulated promoting tumor proliferation. There are several RAD51 inhibitors and we focused on DIDS, whose mechanism of action has not been yet determined. Concerning RAD52, a synthetic lethality has been shown when its gene is inactivated in BRCA1, BRCA2 or PALB2 deficient cells, those genes being mutated in various cancers. Recently, three types of molecules inhibiting RAD52 were highlighted. We studied the impact of DIDS and its derivatives to understand the mechanism involved in the inhibition. We showed that DIDS and its derivatives inhibit RAD51 DNA binding function. These molecules prevent the formation of nucleofilament leading to a decrease in RAD51 foci formation. We have developed a fluorescent method of screening to evaluate the effect of a library of 696 molecules on the RAD52 ability to hybridize two ssDNA. Two molecules were able to inhibit the RAD52 hybridization function. In vivo, they induce a decrease in PALB2 deficient cell survival. Research and development of new RAD51 and RAD52 inhibitors represent promising therapeutic strategies.

Lors de la vie, des mécanismes de réparation de l’ADN sont mis en oeuvre lors d’agressions, pour protéger le génome. La réparation par excision de nucléotides (NER) est l’un de ces mécanismes. Des mutations des facteurs NER sont à l’origine de 3 maladies génétiques humaines: Xeroderma pigmentosum (XP), la trichothiodystrophie (TTD) et le syndrome de Cockayne (CS). Certains de leurs signes cliniques ne sont pas expliqués par un défaut de réparation de l’ADN. Des études suggèrent que ces facteurs interviennent dans d’autres processus, notamment lors de l’expression des gènes. Durant ma thèse, je me suis intéressé aux rôles des facteurs NER dans la transcription. En effet, j’ai montré que ces facteurs, dit de réparation, étaient recrutés avec la machinerie transcriptionnelle au niveau du promoteur et du terminateur de gènes activés. Ils influencent l’environnement chromatinien des gènes activés (boucles de chromatine et modifications post-­‐ traductionnelles des histones). Ma thèse apporte une meilleure compréhension du processus de transcription des gènes activés, permettant de mieux comprendre certaines anomalies associées aux yndromes XP, CS et TTD. / Throughout life, the mechanisms of DNA repair are implemented in attacks to protect the integrity of our DNA. The nucleotide excision repair (NER) is one of these mechanisms. Mutations targeting genes of NER factors (XPA-­‐G, TTD-­‐A, CSA and CSB) are responsible for three human genetic diseases : Xeroderma pigmentosum (XP), trichothiodystrophy (TTD) and Cockayne syndrome (CS). Some of them clinical features cannot be explained by a defect in DNA repair only. Previous studies suggest that these factors could be involved in other functions, including gene expression. In my thesis, I am interested in the roles of NER factors during the transcription process. Indeed, we have shown that these “repair” factors, were recruited with the transcription al machinery at the promoter and terminator of activated genes during transcription. They influence the chromatin environment of activated genes (chromatin loops and post-­‐translational modifications of histones).My thesis provides a better understanding of the transcription process of activated genes and allows a better understanding of some syndromes associated with XP, CS and TTD.

En phase somatique, plusieurs mécanismes de réparations de l'ADNinterviennent pour réparer les cassures double brin (CDB) de l'ADN. Enphase méiotique, les CDB de l'ADN engendrées de façon programmées parSpo11 sont réparées par la recombinaison homologue (RH) dont les acteursprincipaux sont Rad51 et Dmc1 aidés de Brca2. Chez Arabidopsis, en absencede Brca2, le déroulement méiotique est perturbé, les chromosomes nes'associent pas en bivalents, ils apparaissent emmêlés. Ainsi, en absencede Brca2, la recombinaison homologue pourrait ne plus être fonctionnelleet les anomalies chromosomiques observées pourraient être le résultat deréparations aberrantes des CDB de l'ADN effectuée par d'autres mécanismesde réparation de l'ADN. Nous avons montrés, chez Arabidopsis, que le Nonhomologous End Joining (NHEJ) et/ou le Single Strand Annealing (SSA),mécanismes de réparation des CDB de l'ADN en phase somatique,n'intervenaient pas en phase méiotique dans la formation des anomaliesobservées en absence de Brca2. Toujours dans l'hypothèse où ces figuresméiotiques soient le résultat de liaisons covalentes, nous avons regardési les ADN-ligases ne pourraient pas être impliquées. Ainsi, nous avons pumontrer que la Ligase 6, ADN-ligase spécifique des plantes, n'avait pas derôle dans les anomalies chromosomiques observées en méiose en absence deBrca2. D'ailleurs la Ligase 6 ne semble pas non plus intervenir dans lesfigures chromosomiques observées chez les mutants rad51 et mnd1. Le rôlede la Ligase 6 n'ayant pas été déterminé lorsque nous avons démarré cetravail, nous avons voulu identifier son le rôle en étudiant le mutantcorrespondant. Le mutant ligase 6 ne présente pas de sensibilité auxstress génotoxiques utilisés ce qui indique que la Ligase 6 ne semble pasintervenir dans la réparation de l'ADN. La mutation dans le gène LIGASE Iest létal à l'état homozygote, de plus nous avons pu observer uneségrégation anormale chez l'hétérozygote mutant pour le gène LIGASE I. Lalétalité du mutant ligase I a été contournée par l'utilisation d'unsystème ARNi pour éteindre l'expression du gène LIGASE I uniquement enméiose. Cependant, l'implication de la Ligase I, dans les anomaliesméiotiques observées en absence de Brca2 n'a pas pu être déterminée.Enfin, nous avons confirmé que, chez Arabidopsis, Xrcc4 avait un rôle dansle NHEJ via son interaction avec la Ligase IV et via la sensibilité dumutant xrcc4 à différents stress génotoxiques. En revanche, Xrcc4-like nesemble pas interagir avec les acteurs du complexe de ligation du NHEJ etle mutant ne présente pas de sensibilité aux stress génotoxique, indiquantque cette protéine n'est pas impliquée dans le NHEJ et plus généralementdans les mécanismes de réparation de l'ADN.

En réponse aux dommages de son génome, le choix par la cellule de la voie de réparation de l'ADN est un crucial par ses conséquences en termes de mutagénèse et de survie. Pour faire face aux cassures double-brin de l'ADN (CDB), les cellules humaines possèdent deux voies principales qui consistent soit à rejoindre les extrémités de la cassure par jonction d'extrémités non-homologues (voie conventionnelle C-NHEJ), soit à reconstituer par recombinaison homologue la séquence clivée en copiant son double non endommagé présent après la réplication (voie RH). La RH nécessite de dégrader l'un des brins d'ADN de part et d'autre de la cassure. Cette dégradation produit de courts fragments d'ADN simple-brin, connus pour aider à signaler le dommage à la cellule. Dans ce travail, nous avons évalué directement l'effet de ces fragments d'ADN simple brin sur la réparation des CDB dans des expériences biochimiques et cellulaires. Nous montrons que de courts fragments d'ADN simple-brin inhibent la C-NHEJ en inactivant sa protéine clef Ku, tout en stimulant une forme minoritaire de jonction des cassures dite NHEJ alternative (A-EJ). Ces travaux permettent de mieux comprendre comment la réparation par la voie peu connue A-EJ peut s'exprimer dans les cellules mais aussi d'envisager des stratégies pour piloter la réponse des cellules cancéreuses aux thérapies induisant des CDB. / In response to DNA damage, the choice made by the cells between DNA repair mechanisms is crucial for mutagenic and survival outcomes. In humans, DNA double-strand breaks are repaired by two mutually-exclusive mechanisms, homologous recombination or end-joining. Among end-joining mechanisms, the main process is classical non-homologous end-joining (C-NHEJ) which relies on Ku binding to DNA ends and DNA Ligase IV (Lig4)-mediated ligation. Mostly under Ku- or Lig4-defective conditions, an alternative end-joining process (A-EJ) can operate and exhibits a trend toward microhomology usage at the break junction. Homologous recombination relies on an initial MRN-dependent nucleolytic degradation of one strand at DNA ends. This process, named DNA resection generates 3' single-stranded tails necessary for homologous pairing with the sister chromatid. While it is believed from the current literature that the balance between joining and recombination processes at DSBs ends is mainly dependent on the initiation of resection, it has also been shown that MRN activity can generate short single-stranded DNA oligonucleotides (ssO) that may also be implicated in repair regulation. In this work, we evaluate the effect of ssO on end-joining at DSB sites both in vitro and in cells. Under both conditions, we report that ssO inhibit C-NHEJ through binding to Ku and favor repair by the Lig4-independent microhomology-mediated A-EJ process. Our data bring new clues in the understanding of the cellular response to DNA double-strand breaks.

Parmi les dommages de l'ADN, la cassure double-brin (CDB) constitue la lésion la plus toxique, puisqu'une seule CDB non réparée ou réparée de façon incorrecte peut conduire à la mort cellulaire. Cette toxicité est justement exploitée en clinique pour éradiquer les cellules tumorales. Parmi l'arsenal des molécules utilisées en chimiothérapie, les poisons de topoisomérase I (TOPO1), tel que la camptothécine (CPT), sont capables d'induire un type particulier de CDBs à une seule extrémité, générées lors de la collision entre la fourche de réplication et la TOPO1 bloquée sur l'ADN. Ces cassures sont réparées par recombinaison homologue (RH) puisqu'en absence de seconde extrémité, elles ne peuvent être substrats de la jonction d'extrémités non homologues (JENH) qui, pour ligaturer en nécessite deux. L'hétérodimère Ku, initiateur de la JENH est à la fois un détecteur majeur des CDBs de par son abondance nucléaire et sa forte affinité, et un puissant inhibiteur de la RH. Ainsi, pour la compréhension des mécanismes déterminants le choix de la voie de réparation adaptée à chaque type de CBD, la régulation de la liaison de Ku aux CDBs à une extrémité est donc une question cruciale. Dans ce contexte, mon premier projet de thèse a concerné la compréhension moléculaire du choix de la voie de réparation des CDBs à une extrémité. Par une technique de microscopie à haute résolution, j'ai d'abord montré que l'hétérodimère Ku et son partenaire la DNA-PKcs sont rapidement recrutés au niveau de ces dommages dans l'ADN de cellules humaines. J'ai ensuite démontré que grâce à la phosphorylation de CtIP par ATM et à l'action coordonnée des activités nucléases de MRE11 et CtIP, Ku est relargué des CDBs à une extrémité. La dissociation de la DNA-PKcs des CDBs à une extrémité dépend de sa phosphorylation par ATM au niveau du cluster ABCDE. A l'aide d'un mutant non phosphorylable de ce cluster, j'ai montré que le défaut de dissociation de la DNA-PKcs prévient le relargage de l'hétérodimère Ku dépendant de MRE11. Mes travaux suggèrent toutefois l'existence d'une voie additionnelle pouvant éliminer Ku de plus 50% des CDBs à une extrémité. Enfin, j'ai démontré que la persistance de Ku et de la DNA-PKcs aux extrémités de la cassure ne perturbe ni la résection longue distance ni la formation de filament de RAD51 mais compromet la survie cellulaire. Mon second projet de thèse a consisté à perturber les mécanismes contrôlant le choix de la voie de réparation des CDBs dans le but de potentialiser l'effet de la CPT. Comme l'inhibition d'ATM induit une sensibilisation dramatique des cellules en réplication à la CPT, il devrait être possible d'identifier d'autres sensibilisateurs à la CPT qui désorganiseraient la réparation des CDBs à une extrémité. Sur la base d'un test de cytotoxicité, j'ai réalisé un criblage phénotypique de la chimiothèque du NIH et identifié un antibiotique, la nitrofurantoïne (NTF) et l'hydrocortisone acétate (HCA) capables de potentialiser l'effet de la CPT. Si la sensibilisation par la NTF semble plutôt associée à la génération d'espèces oxygénées réactives (ROS) par nitroréduction de la molécule, celle induite par l'HCA n'a pas été reproduit et est toujours en cours d'investigation. Mes travaux de thèse contribuent à la compréhension des mécanismes du choix de la voie de réparation impliqués dans la tolérance des cellules à la CPT et ouvrent des perspectives de ciblage pour potentialiser son pouvoir anti-cancéreux. / DNA double-strand break (DSB) is the most toxic DNA damage, because a single mis- or un-repaired DSB can lead to cell death. This toxicity is exploited in clinics to eradicate tumoral cells. So, among molecules currently used in chemotherapy, topoisomerase 1 (TOPO1) poisons such as camptothecin (CPT), are able to generate a particular type of DSB bearing one single end (seDSBs); these lesions are created when a replication fork collides with the TOPO1 blocked on the DNA. They are repaired by homologous recombination (HR) because, devoid of a second end, they cannot be ligated by non-homologous end-joining (NHEJ). The Ku heterodimer, the initiator of the NHEJ is both a major detector of the DSBs due to its nuclear abundance and strong affinity, and a powerful HR inhibitor. Therefore, the regulation of Ku binding to one-ended DSB is a crucial question for the understanding of mechanisms determining the choice of the suitable DSB repair pathway. In this context, my first thesis project aimed at deciphering the molecular mechanisms responsible for the DNA repair pathway choice at seDSBs. Firstly, using High Resolution Microscopy, I demonstrated that Ku and DNA-PKcs are rapidly recruited on seDSBs. Then, I showed that ATM-dependent phosphorylation of CtIP and the epistatic and coordinated actions of MRE11 and CtIP nuclease activities are required to limit the stable loading of Ku on seDSBs. I established that DNA-PKcs removal from seDSBs relies on ATM-dependent phosphorylation of the ABCDE cluster. Using a non-phosphorylable mutant of this cluster, I demonstrated that impaired DNA-PKcs removal prevents MRE11 from releasing Ku. However, my work also suggested the existence of an additional mechanism that contributes to prevent Ku accumulation at 50% of seDSBs. Finally, I demonstrated that Ku and DNA-PKcs persistence on seDSBs does not impair long range resection and RAD51 recruitment but compromises cell survival. My second thesis project was dedicated to target the DSB repair pathway choice mechanisms in order to potentiate the effect of CPT. Indeed, since ATM inhibition increases drastically the death of replicative cells treated with CPT, we may identify others sensitizers able to disrupt the repair pathway choice. On the basis of a cytotoxicity assay on mouse embryonic fibroblasts (MEFs), I performed a phenotypic screening of the NIH Clinical Collection and identified the antibiotic nitrofurantoin (NTF) and hydrocortisone acetate (HCA) as a sensitizer of MEFs to CPT. However, sensitization induced by NTF does not depend on Ku but rather seems to rely on Reactive Oxygen Species (ROS) generation by nitroreduction of the molecule and sensitization induced by HCA is not reproducible and is still under investigation. My work contributes to extend the knowledge of the repair pathway choice mechanisms involved in cell tolerance to CPT and opens new opportunities to potentiate its anticancerous property.

L’ADN est constamment exposé à des insultes génotoxiques endogènes et exogènes. Plusieurs mécanismes de réparations de l’ADN sont mis en œuvre pour préserver la stabilité du génome et de l’épigénome. La recombinaison homologue (RH) joue un rôle central dans la réparation des cassures double brin de l’ADN (DSBs) et le redémarrage des fourches de réplication en réponse à un stress réplicatif. Ces deux processus sont tous deux couplés à l’assemblage de la chromatine. Le facteur d’assemblage de la chromatine 1 (CAF-1) est un chaperon d’histone conservé au cours de l’évolution qui fonctionne dans le processus d’assemblage des nucléosomes couplé à la réparation de l’ADN et à la réplication, en déposant sur l’ADN les tétramères d’histones (H3-H4)2 nouvellement synthétisés. Chez la levure Schizosaccharomyces pombe, le complexe CAF-1 est constitué de trois sous-unités, Pcf1, Pcf2 et Pcf3. Il a été montré que CAF-1 agit dans l’étape de synthèse de l’ADN durant le processus de réplication dépendante de la recombinaison (RDR) et protège le désassemblage des D-loop par l’hélicase Rqh1, membre de la famille des hélicases RecQ. Dans cette étude, nous avons adressé le rôle de CAF-1 pendant la réparation de l’ADN par recombinaison homologue chez la levure Schizosaccharomyces pombe. Par l’utilisation d’approches in vivo et in vitro, nous avons validé des interactions protéines-protéines au sein d’un complexe contenant Rqh1, CAF-1, PCNA, et l’Histone H3. Nous avons montré que Rqh1 interagit avec Pcf1 et avec Pcf2 indépendamment l’un de l’autre, et que l’interaction Rqh1-Pcf1 est stimulée par des dommages à l’ADN. Nous avons mis en place une méthode d’analyse de liaison à la chromatine pour suivre l’association de CAF-1 à la chromatine en réponse aux dommages à l’ADN. Nous avons observé qu’un stress réplicatif, mais pas l’induction de cassures double brin de l’ADN, favorise l’association de CAF-1 à la chromatine. Nous avons identifié plusieurs facteurs de la RH nécessaire pour l’association de CAF-1 à la chromatine en réponse à un stress réplicatif. De plus, nous avons mis en évidence des interactions physiques entre Pcf1 et des facteurs de la recombinaison homologue, parmi lesquels RPA et Rad51. Nos données suggèrent que CAF-1 pourrait s’associer aux sites de synthèse d’ADN dépendent de la recombinaison via son interaction avec des facteurs de la RH. L’ensemble des données de cette étude contribuent à renforcer le role de CAF-1 couplé à réparation de l’ADN, et révèlent une interconnexion entre les facteurs de la RH et l’assemblage de la chromatine. / DNA is constantly exposed to both endogenous and exogenous genotoxic insults. Multiple DNA repair mechanisms are exploited to guard the genome and epigenome stability. Homologous recombination (HR) plays a major role in repairing DNA double strand breaks (DSBs) and restarting stalled replication forks under replicative stress. These two processes are both coupled to chromatin assembly. Chromatin assembly factor 1 (CAF-1) is a highly conserved histone chaperone known to function in a network of nucleosome assembly coupled to DNA repair and replication, by depositing newly synthesized histone (H3-H4)2 tetramers onto the DNA. The fission yeast CAF-1 complex consists of three subunits Pcf1, Pcf2 and Pcf3. CAF-1 has been previously reported to act at the DNA synthesis step during the process of recombination-dependent replication (RDR) and protects the D-loop from disassembly by the RecQ helicase family member, Rqh1. In this study, we addressed the role of CAF-1 during homologous-recombination-mediated DNA repair in fission yeast.Using in vivo and in vitro approaches, we validated interactions within a complex containing Rqh1, CAF-1, PCNA, and Histone H3. We showed that Rqh1 interacts with both Pcf1 and Pcf2 independently of each other, and the Pcf1-Rqh1 interaction is stimulated by DNA damage. We developed an in vivo chromatin binding assay to monitor the association of CAF-1 to the chromatin upon DNA damage. We observed that replication stress but not double strand break favors CAF-1 association to the chromatin. We identified that several HR factors are required for CAF-1 association to the chromatin upon replication stress. In support of this, we have identified physical interactions between Pcf1 and HR factors, including RPA and Rad51. Our data suggest that CAF-1 would associate with the site of recombination-dependent DNA synthesis through physical interactions with HR factors. Put together, this work contributes to strengthening the role of CAF-1 coupled to DNA repair, and reveals the crosstalk between HR factors and chromatin assembly.

Les protéines et les voies impliquées dans la réponse aux dommages de l'ADN (DDR), permettant de maintenir la stabilité génétique et de préserver la fidélité de la réplication, agissent non seulement comme l'initiation de la cancérogenèse mais peuvent également jouer un rôle majeur dans la progression tumorale et dans la résistance aux thérapies. La voie FANC joue un rôle central dans la stabilité génétique lors d'un stress réplicatif. La perte de fonction de cette voie est la cause d'un syndrome de fragilité chromosomique et de prédisposition au cancer appelé Anémie de Fanconi (FA).Nous avons démontré que les protéines FANC était surexprimées et suractivées dans les mélanome métastatiques exprimant le facteur de transcription MITF, un oncogène exprimé dans 80% des cas de mélanome. Nous avons identifié MITF comme un régulateur majeur de l'expression des transcrits codant les protéines de la voie FANC dans les cellules de mélanomes et montré que les cellules déplétées pour MITF présentaient les caractéristiques des cellules FA, i.e., une hypersensibilité aux agents pontants l'ADN. De plus, la voie FANC module également la migration des cellules de mélanome. Nos observations montrent le rôle central de cette voie de réparation dans la résistance des cellules de mélanomes aux dommages de l'ADN. Cette voie serait donc une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement du mélanome.Nous avons également observé que la perte de fonction de la voie FANC augmente l'expression de MiTF dans des cellules FA et des cellules déplétées pour les protéines FANC. Nous avons montré que la voie FANC régule négativement l'expression de MITF au niveau transcriptionnel. Des résultats préliminaires montre que FANCD2 pourrait être associés au promoteur de MiTF au niveau d'un site de fixation de NF-kB, où il pourrait empêcher son action. La déplétion de MiTF conduit à une sensibilité aux agents pontants l'ADN dans des cellules contrôles mais pas dans des cellules FA, suggérant que MITF jouerait un rôle dans la DDR en régulant l'expression des protéines FANC. Enfin, nous avons montré que l'expression de MiTF est induite en réponse aux stimuli pro-inflammatoire. Enfin, l'expression altérée de MITF pourrait expliquer des défauts de pigmentation et la microphthalmie rapportés chez les patients FA. L'ensemble de ces données, à la fois validée et préliminaire, supporte l'existence d'une relation épistatique entre MiTF et la voie FANC. Cet voie aurait un rôle important à la fois dans la résistance au mélanome métastatique et dans certaines caractéristiques pathologiques de l'anémie de Fanconi. / Proteins and pathways involved in DNA damage response (DDR), maintaining genetic stability and safeguarding DNA replication, act not only as caretakers against cancer initiation but also play a major role in sustaining cancer progression and resistance to pharmacological-based therapies. The FANC pathway is central in maintaining genetic stability under conditions of replication stress and its loss-of-function is causative of the cancer predisposition and chromosome fragility syndrome Fanconi Anemia (FA).We demonstrate here that FANC proteins are over-expressed and over-activated in metastatic melanoma cells expressing the oncogenic microphthalmia-associated transcription factor (MiTF), which high expression is maintained in 80% of melanoma cases. We identified MiTF as a critical regulator of the expression of the mRNAs coding key proteins of the FANC pathway in melanoma cells and demonstrated that MiTF-silenced cells display the primary characteristics of FA cells, i.e., the cellular and chromosomal hypersensitivity to DNA interstrand crosslink- inducing agents. Moreover, FANC pathway also modulates melanoma cell migration. Our observations point to a central role of the FANC pathway in cellular and chromosomal resistance to DNA damage in melanoma cells. Thus, the FANC pathway appears as a promising new therapeutic target for melanoma treatment.Inversely, we observed that FANC pathway loss-of-function is associated to increased expression of MiTF in both FA patient-derived and siRNA-downregulated cells. We demonstrated that the FANC pathway negatively regulates MiTF expression at the mRNA level and have obtained preliminary data suggesting that FANCD2 associates to the MiTF promoter, impeding the action of the NF-kB transcription factor. MiTF depletion increases MMC sensitivity in FANC pathway proficient cells, but does not modify the sensitivity of FA cells, supporting the hypothesis that MiTF acts on the DDR by regulating the expression of FANC proteins. Finally, we demonstrated that MiTF expression is induced in response to inflammatory stimuli, like TNF-a. Thus, altered MiTF expression in FA could be involved in the pigmentation defects and microphthalmia reported in patients.In conclusion, we will present a corpus of both validated and yet preliminary data that strongly supports the existence of an epistatic relationship between MiTF and the FANC pathway. This circuitry appears to have an important role in melanoma resistance to chemotherapies and in some FA pathological traits.

Les cancers du poumon non à petites cellules (CPNPC) restent une cause majeure de mortalité par cancer, malgré l’apport de thérapies moléculaires ciblées et des immunothérapies. La survie des patients aux stades avancés reste limitée et la mise au point de biomarqueurs pronostiques permettant de stratifier les patients ou prédictifs de réponse à différents types de traitement constitue un enjeu important pour la prise en charge des patients.La mise au point de biomarqueurs obéit à des enjeux spécifiques tenant à la connaissance de la biologie tumorale dans des domaines complexes tels que celui de la réparation de l’ADN, aux caractéristiques des outils disponibles pour créer ces biomarqueurs et à leur applicabilité dans le contexte clinique.Dans le cadre de cette thèse, il a été étudié la manière dont l’expression de la protéine PARP1 peut s’intégrer aux biomarqueurs pronostiques de réparation de l’ADN dans les CPNPC. Il a par ailleurs été étudié le rôle de la protéine MMS19, identifiée à partir d’études d’expression génique, comme biomarqueur prédictif potentiel de réponse au cisplatine dans les CPNPC. Enfin, l’utilisation des cellules tumorales circulantes pour le développement de biomarqueurs a été étudiée dans le cadre de la détection des remaniements du gène ALK, une altération oncogénique constituant une cible thérapeutique dans les CPNPC. / Non-small cell lung cancers (NSCLC) remain a leading cause of cancer-related death despite the advent of targeted therapies and immunotherapies. At advanced stages, patient survival remains limited and establishment of new biomarkers, either prognostic for patient stratification or predictive of response to various therapies, is an important goal for patient’s treatment.Development of biomarkers is dependent on many components among which: knowledge of cancer cell biology in complex cellular processes such as DNA repair, characteristics of tools available to create biomarkers and applicability in daily medical practice.In this thesis, expression of PARP1 has been evaluated as a prognostic biomarker in NSCLC, in the broader context of DNA repair biomarkers. The biological and clinical relevance of MMS19 protein, identified in gene expression analysis , as a biomarker for cisplatin sensitivity in NSCLC has also been studied. Finally, the use of circulating tumor cells for biomarker development has been studied through the detection of ALK gene rearrangment, an oncogenic targetable alteration in NSCLC.

Avec la chimiothérapie et la chirurgie, la radiothérapie fait partie intégrante de l'arsenal thérapeutique pour lutter contre le cancer. Afin de potentialiser l’efficacité des rayonnements ionisants, la radiochimiothérapie s’est développée mais en raison des résultats insuffisants de cette stratégie, de nouvelles voies permettant une modulation de la radiosensibilité tumorale sont évaluées. C’est dans ce contexte d’amélioration de l’efficacité de la radiothérapie que s’inscrit ce travail de thèse. Nous avons évalué l’intérêt thérapeutique de l’association d’inhibiteurs de la réparation de l’ADN à la radiothérapie sur un modèle orthotopique de cancer bronchique et sur un modèle orthotopique de cancer de la tête et du cou. En raison de son rôle prépondérant dans la réparation des cassures simple brin, PARP1 a été ciblé dans un premier temps pour éprouver cette stratégie, à l’aide d’un inhibiteur chimique l’Olaparib. Le rationnel consistait à inhiber la réparation de dommages induits par l’irradiation, pouvant ainsi conduire à la mort des cellules tumorales. Les résultats obtenus in vitro ont montré que l’inhibition de PARP1 permettait en effet de potentialiser les effets de la radiothérapie. Cette association thérapeutique a, par la suite, été évaluée in vivo et a montré une très faible radiosensibilisation, limitée par une toxicité induite par cette association. Afin d’augmenter l’efficacité de cette stratégie thérapeutique, un inhibiteur d’ATR (AZD6738), une des protéines majeures de la réponse aux dommages de l’ADN et au stress réplicatif, a été ajouté à la combinaison initiale. Il a en effet été montré que Chk1, la cible principale d’ATR, était activée dans les cellules traitées avec l’Olaparib et/ou irradiées. Nous avons démontré in vitro et in vivo, que l’AZD6738 améliorait l’efficacité de la combinaison irradiation et Olaparib dans nos deux modèles tumoraux, suggérant le potentiel de cette triple combinaison en clinique. Enfin, en raison du rôle de l’irradiation et de PARP1 dans différents processus immunitaires, nous avons étudié de façon préliminaire l’influence de nos différentes combinaisons thérapeutiques sur l’infiltrat immunitaire tumoral. Sachant que l’efficacité de l’association Olaparib/irradiation avait été démontrée dans des modèles tumoraux implantés en sous-cutané, ce travail de thèse montre l’importance et la pertinence de modèles précliniques plus proches de la pathologie humaine, comme les modèles orthotopiques. En effet, il est très probable que les toxicités observées au cours de ce travail soit la conséquence d’une détérioration avancée des muqueuses présentes dans le champ d’irradiation et que celles-ci ne puissent être observées lors d’irradiation localisée de tumeurs implantées en sous-cutané. / With chemotherapy and surgery, radiotherapy is part of anti cancer therapeutic strategy. To increase ionizing radiations effects, radiochemotherapy has emerged, but because of inefficient results, new pharmacological strategies for modulation of radiosensitization has been assessed. My thesis project is part of this context of improvement of radiotherapy efficiency. We have evaluated therapeutic interest of association of DNA repair inhibitors and radiotherapy on lung cancer model and head and neck cancer model. Because of its implication in single strand break repair, PARP1 has been first, targeted to assess this strategy, with the chemical inhibitor Olaparib. The rational was to inhibit radio-induced damages, leading to cellular death. In vitro, we have demonstrated that Olaparib was promising for enhancing radiation efficacy, but has an in vivo limited radiosensitization, plus we observed with this association a toxicity. Non toxic association has been found by decreasing Olaparib dose, but association efficiency has been limited, meaning that Olaparib, in our model, has a restrained therapeutic index.To increase the efficiency of this combination, we have added an ATR inhibitor (AZD6738), one of the key proteins implicated in response to DNA damages and replicative stress. In fact it has been demonstrated, that ATR main target, Chk1, was activated in Olaparib-treated and/or irradiated cells. We have demonstrated in vitro and in vivo, that AZD6738 improved efficiency of Olaparib and radiotherapy combination in both models, suggesting the potential of this triple combination in clinic.Finally, because of effects of PARP1 and radiation on different immune processes, we have preliminary studied, the influence of this different combinations on immune infiltrate.Knowing that efficiency of the association Olaparib and radiotherapy has already been demonstrated in subcutaneous models, this work has shown the importance and relevance of preclinical models, closer to human pathologies, as orthotopic models. In fact, it is likely that toxicities observed during this work, are the consequence of mucous membrane damaging in the field of irradiation, which cannot be observed with localized irradiation of subcutaneous tumors.