Thèse de doctorat : Physique : Lyon, École normale supérieure (sciences) : 2006. / Bibliogr. en fin de chapitres.

L'organisation de la chromatine a une importance fonctionnelle pour contrôler le programme d'expression des gènes. Par contre, les liens qui l'unissent au déroulement de la réplication de l'ADN sont beaucoup moins connus. Grâce à des approches basées sur la capture d'interactions chromosomiques et sur l'imagerie cellulaire, nous avons étudié les liens entre le repliement à grande échelle de la chromatine et le timing de réplication. Cette analyse, effectuée dans des cellules humaines lymphoblastoïdes, des cellules mononucléées du sang (PBMC) et des cellules issues d'une leucémie myéloïde à caractère érythrocytaire, a permis l'identification de domaines structuraux du noyau. Ces domaines sont relativement isolés les uns des autres et leurs frontières coïncident avec les zones d'initiation précoce. De plus, notre étude montre que ces zones d'initiation précoce interagissent préférentiellement, aussi bien entre voisins immédiats (séparation génomique de l'ordre de la mégabase) que le long du chromosome entier. Les loci répliqués tardivement interagissent eux-aussi avec leurs homologues, conduisant, dans l'espace nucléaire, à une ségrégation des loci en fonction de leur timing de réplication. Ces résultats sont soutenus par des mesures de distances sur des hybridations in-situ qui montrent que les loci répliqués en début de phase S sont plus proches qu'attendus. Nos travaux révèlent enfin que l'organisation de la chromatine est similaire dans des cellules en phase G0 (PBMC dormantes), démontrant qu'elle n'est pas spécifique des cellules en phase S. Pris ensemble, ces résultats apportent des preuves directes d'une organisation robuste de la chromatine, partagée par les cellules en cycle et dormantes, et corrélée au timing de réplication à différentes échelles.

L'organisation de la chromatine a une importance fonctionnelle pour contrôler le programme d'expression des gènes. Par contre, les liens qui l'unissent au déroulement de la réplication de l'ADN sont beaucoup moins connus. Grâce à des approches basées sur la capture d'interactions chromosomiques et sur l'imagerie cellulaire, nous avons étudié les liens entre le repliement à grande échelle de la chromatine et le timing de réplication. Cette analyse, effectuée dans des cellules humaines lymphoblastoïdes, des cellules mononucléées du sang (PBMC) et des cellules issues d'une leucémie myéloïde à caractère érythrocytaire, a permis l'identification de domaines structuraux du noyau. Ces domaines sont relativement isolés les uns des autres et leurs frontières coïncident avec les zones d'initiation précoce. De plus, notre étude montre que ces zones d'initiation précoce interagissent préférentiellement, aussi bien entre voisins immédiats (séparation génomique de l'ordre de la mégabase) que le long du chromosome entier. Les loci répliqués tardivement interagissent eux-aussi avec leurs homologues, conduisant, dans l'espace nucléaire, à une ségrégation des loci en fonction de leur timing de réplication. Ces résultats sont soutenus par des mesures de distances sur des hybridations in-situ qui montrent que les loci répliqués en début de phase S sont plus proches qu'attendus. Nos travaux révèlent enfin que l'organisation de la chromatine est similaire dans des cellules en phase G0 (PBMC dormantes), démontrant qu'elle n'est pas spécifique des cellules en phase S. Pris ensemble, ces résultats apportent des preuves directes d'une organisation robuste de la chromatine, partagée par les cellules en cycle et dormantes, et corrélée au timing de réplication à différentes échelles. / Chromatin organization is of functional significance to control the gene expression program. However, its interplay with DNA replication program is less known. Though the capture of chromosomal interactions and cell imaging, we studied the links between the high-order folding of chromatin and the replication timing. This analysis, which has been performed in human lymphoblastoid cells, in peripheral blood mononuclear cells (PBMC), and in a myeloid leukemia cell line with erythroid properties, allowed the identification of structural domains in the nucleus. These domains are quite isolated from each other and their boundaries coincide with early-initiation zones. In addition, our study shows that these early-initiation zones preferentially interact with each other. These interactions have been observed between neighboring early-initiation zones (genomic separation around 1 to few megabases) but also along the whole chromosome. The late-replicated loci interact with their counterparts as well, leading to a nuclear segregation of the loci according to their replication timing. These results are sustained by distance measurements in in-situ hybridizations which show that loci replicated at the beginning of S-phase are closer than expected. Our work also reveals that chromatin organization is similar in cells blocked in G0 phase (quiescent PBMC), demonstrating that it does not result from the cells in S-phase. Taken together, these results provide direct clues for a robust chromatin organization, common to cycling and resting cells, and related to the replication timing at different scales.

Le mélanome est un cancer agressif dont la progression est facilitée par la dégradation de la matrice extracellulaire, à la fois par les fibroblastes et les cellules tumorales. Cette dégradation génère des peptides d’élastine, notamment responsables de la prolifération des cellules saines et cancéreuses. Le peptide d’élastine (VGVAPG)3 accélère la reprise et le déroulement du cycle cellulaire de fibroblastes normaux et de cellules de mélanomes préalablement synchronisés (expression de pKi-67, détection de la phase S et quantification d’ADN). L’architecture nucléaire associée à la reprise de la synthèse des ARNm concerne les compartiments nucléaires PML-NBs et domaines SC35, partenaires indissociables de la transcription et de l’épissage, qui sont étudiés, après immunomarquages, en microscopie confocale suivie d’une reconstruction 3D. Les compartiment PML-NBs et domaines SC35 se réorganisent en fonction d’une part des phases du cycle cellulaire et d’autre part de l’activité transcriptionnelle, passant d’une séquestration du SC35 dans les PML-NBs à une interpénétration des deux compartiments. L’analyse quantitative de ces compartiments complète les résultats architecturaux en 3D. Le peptide se fixe sur le complexe récepteur de l’élastine, et induit de l’activation de la voie MEK ½ ERK ½. Un antagoniste de cette fixation (lactose) ainsi que l’inhibition de la voie ERK ½ (UO126) conduisent à l’abolition des effets dus au peptide tant pour le cycle cellulaire que pour l’organisation des PML-NBs et domaines SC35, confirmant ainsi l’implication de ces voies. / Melanoma is an aggressive cancer for which invasion is facilitated by degradation of the extracellular matrix, both by normal fibroplasts and tumor cells. This degradation generates elastin peptides, in particular responsible for the proliferation of normal and tumor cells. The elastin peptide (VGVAPG)3. accelerates recovery and progression in cell cycle of normal fibroblasts and melanoma cells previously synchronized (expression of pKi-67, S-phase detection and quantification of DNA). The nuclear architecture associated with the recovery of the synthesis of mRNA on the PML-NBs nuclear compartments and SC35 domains, inseparable partners of transcription and splicing, which are studied after immunostaining by confocal microscopy followed by 3D reconstruction. Compartments PML-NBs and SC35domains are reorganized according of the phases of the cell cycle and also the transcriptional activity, from SC35 sequestration in PML-NBs to an interpenetration of the two compartments. The quantitative analysis of these compartments consolidates the 3D architectural results. The peptide binds to the elastin receptor complex and induceds the activation of the MEK 1/2 ERK 1/2. An antagonist of the fixation (lactose) and inhibition of ERK 1/2 (UO126) lead to the abolition of effects due to the peptide for both the cell cycle and the organized of PML-NBs and SC35 domains, confirming the involvement of these pathways.

L'objet de cette thèse est l'étude comparative de la réponse de cellules saines et malignes à la micro- et la nano-topographie de surface. L'interaction avec des stries de profondeur nanométrique est étudiée grâce à une méthode statistique. Nous démontrons que les cellules saines s'alignent plutôt sur des stries profondes, et que les cellules cancéreuses sont plus sensibles aux stries peu profondes. L'analyse des noyaux révèle qu’ils suivent l'alignement des corps cellulaires plus fidèlement dans le cas des cellules cancéreuses et que les noyaux de ces dernières sont plus sensibles aux stries de faible profondeur. Sur des micro-piliers nous démontrons que les cellules d’ostéosarcomes sont capables de se déformer et de faire adopter à leurs noyaux la forme de l'espace entre les piliers. Ceci ne se produit que durant la phase initiale d'adhésion pour les cellules saines. Les cellules immortalisées présentent un niveau intermédiaire de déformation. Quand l'espacement entre piliers est réduit, des différences de déformation sont révélées entre les lignées cancéreuses testées. La déformation est aussi liée au caractère cancéreux de kératinocytes et à l'expression de Cdx2 dans des lignées d'adénocarcinomes. Nous avons tenté d'expliquer ce mécanisme de déformation en l'attribuant au cytosquelette grâce à des analyses en microscopie confocale et avec des inhibiteurs du cytosquelette. L'imagerie de cellules vivantes a permis d'observer que les cellules sont très mobiles même quand elles sont déformées, que la mitose nécessite la perte de la déformation et que la déformation après mitose est plus rapide que la déformation pendant l'adhésion initiale des cellules. / This thesis deals with the differential response of healthy and cancerous cells to surface topography at the nanoscale and the microscale. Using a statistical method we developed we studied the interactions of cells with grooves of nanoscale depth. We demonstrate that healthy cells have a greater ability to align with deeper grooves, whereas cancerous cells are more sensitive to shallow grooves. Analysis reveals that the nucleus follows the alignment of the cell body more closely in cancerous cells, and that the nucleus of cancerous cells is more sensitive to shallow grooves.On microscale pillars we demonstrate for the first time that osteosarcoma cells deform to adopt the surface topography and that the deformation extends to the interior of the cell and in particular to the nucleus. We show that healthy cells only deform during the initial stages of adhesion and that immortalized cells show intermediate deformation between the healthy and cancerous cells. When the spacing between the pillars is reduced, differences in the deformation of different cancerous cell lines are detected. Deformation was also found to be related to the malignancy in keratinocytes, and related to the expression of Cdx2 in adenocarcinoma. The mechanism of deformation is tentatively attributed to the cytoskeleton and attempts to identify the main actors of deformation were performed using confocal microscopy and cytoskeleton inhibitors. Live cell imaging experiments reveal that the deformed cells are very mobile on the surfaces, loss of deformation is necessary for mitosis to occur and deformation after mitosis is more rapid than initial deformation upon adhesion to surfaces.

Etude du diagnostic des lésions prémalignes du col de l'utérus, fondée sur l'utilisation d'un système automatique d'analyse des frottis vaginaux: le système LEYTAS (Leyden Television Analysis System). Plusieurs paramètres nucléaires ont été mesurés en utilisant le système SAMBA. Le taux actuel de faux positifs commis par le système LEYTAS peut être réduit fortement en utilisant des paramètres nucléaires, tels que la densité optique moyenne et des paramètres de texture nucléaire