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Characterisation of AAV capsid-specific CD8+ T cell responses in human subjects / Caractérisation des réponses cellulaires T CD8+ spécifiques de la capside de l'AAV chez l'Homme

Vandamme, Céline 07 November 2016 (has links)
L’immunité pré-existante dirigée contre la capside de l’AAV constitue l’un des obstacles majeurs à la sécurité et à l’efficacité du transfert de gène à l’aide de vecteurs AAVr. En particulier, les réponses cellulaires cytotoxiques dirigées contre l’AAV se sont trouvées être un défi à caractériser en raison de la faible fréquence des LT CD8+ circulants spécifiques de la capside, qui peuvent rarement être détectés par cytométrie de flux ou test ELISpot classiques. Ici, nous avons utilisé des tétramères de CMH classe I fluorescents en association avec un enrichissement magnétique pour détecter ex vivo des lymphocytes T CD8+ spécifiques de la capside dans des PBMCs humains. Pour la première fois, nous avons mis en évidence que tous les individus possèdent des LT CD8+ spécifiques de la capside, parmi lesquels on retrouve une sous-population de lymphocytes TEMRA mémoires effecteurs. Nous n’avons par ailleurs observé aucune corrélation entre les réponses ELISpot IFNγ et les fréquences ex vivo de LT CD8+ spécifiques de la capside, ce qui nous indique que ces fréquences ne sont pas prédictives de la fonctionnalité des cellules détectées. De manière intéressante, l’évaluation fonctionnelle de lignées primaires humaines de LT CD8+ spécifiques de la capside, amplifiées à partir de PBMCs après enrichissement par tétramères, a révélé qu’une dégranulation en réponse à des cellules cibles n’était pas systématiquement corrélée à la sécrétion de Perforin et Granzyme B. Les résultats de nos travaux encouragent le développement de nouvelles technologies associant haute sensibilité de détection et évaluation poly-fonctionnelle afin de prédire l’impact des réponses immunitaires cellulaires spécifiques de la capside de l’AAV lors des essais cliniques de thérapie génique. / Pre-existing immunity to AAV capsid constitutes one of the major hurdle to rAAV-based gene transfer's safety and efficiency in Humans. Particularly, anti-capsid cytotoxic cellular responses have proven to be a challenge to characterise because of the scarcity of circulating AAV-specific CD8+ T lymphocytes which can seldom be detected with conventional flow cytometry or ELISpot assays. Here, we used fluorescent MHC class I tetramers combined with magnetic enrichment to detect AAV-specific CD8+ T cells in human PBMCs ex vivo. For the first time, we evidenced that all individuals tested possessed a pool of AAV-specific CD8+ Tcells that displayed a TEMRA memory subset. Importantly, we observed no correlation between IFNγ ELISpot responses and ex vivo frequencies of AAV-specific CD8+ T cells, which indicates that frequencies of capsid-reactive T cells are not predictive of their functionality. Interestingly, functional assessment of primary AAV8- specific CD8+ T cell lines, expanded from PBMCs after tetramer enrichment, revealed that degranulation activity in response to target cells wasn’t systematically related to secretion of granzyme B and perforin. Our data encourage the development of new technologies combining accrued detection sensitivity and poly-functional assessment to predict the impact of capsid-specific cellular immune responses in rAAV-mediated clinical trials.
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Contribution à l'étude de la structure et du polymorphisme du génome du basidiomycète ectomycorhizien "Laccaria bicolor" (Maire) Orton et identification de QTLs de mycorhization chez les peupliers, "Populus trichocarpa Torr. & A. Gray ex Hook. et "Populus deltoides (Bartr.) Marsh / Contribution to the study of the structure and the polymorphism of the genome of the ectomycorrhizal basidiomycete Laccaria bicolor (Maire) Orton and identification of QTLs of mycorrhization in two Poplars, Populus trichocarpa Torr. & A. Gray ex Hook. and Populus deltoides (Bartr.) Marsh

Labbé, Jessy 04 November 2009 (has links)
Les symbioses mycorhiziennes, entre champignons et racines de plantes, concernent 95 % des espèces végétales. Les arbres sociaux des forêts boréales et tempérées forment avec les champignons un type particulier d’association : la symbiose ectomycorrhizienne. Les ectomycorrhizes jouent un rôle essentiel dans la nutrition hydrominérale des arbres, le cycle des éléments minéraux et la production primaire. Cependant, leur complexité n’a pas permis à ce jour de déchiffrer leurs rôles et leurs fonctions précises. La récente disponibilité du génome du champignon ectomycorhizien Laccaria bicolor et de celui de l'arbre hôte Populus trichocarpa fournit une occasion inégalée d’approfondir nos connaissances du développement et du fonctionnement de cette symbiose. Les objectifs de cette étude ont donc été de participer à la caractérisation et au décryptage du génome de L. bicolor puis à la recherche des gènes impliqués dans la formation des ectomycorhizes chez les deux partenaires. Dans un premier temps et afin d’aider à l’assemblage de la séquence génomique de L. bicolor, nous avons identifié les séquences répétées et construit une carte génétique. Sur les 60 Mb de ce génome, nous avons mis en évidence 8 % de séquences microsatellitaires et 24 % d’éléments transposables. Une carte génétique a été construite à partir de 111 monocaryons issus de L. bicolor S238N. Cette carte comprend 326 marqueurs (8 RAPD, 243 AFLP, 59 SSR et 14 SNP) répartis sur 10 groupes de liaison ancrés à la séquence génomique de L. bicolor. Dans un second temps, nous avons tenté d’identifier les gènes impliqués dans l’établissement des ectomycorhizes chez le peuplier en combinant une approche de détection par QTLs et par puces à ADN. Nous avons ciblé 81 gènes potentiellement impliqués dans l’établissement et/ou le fonctionnement de la symbiose. / The mycorrhizal symbioses between fungi and roots concern 95 % of the plant species. Social trees of boreal and temperate forests form a particular type of root association with fungi: the ectomycorrhizal symbiosis. Ectomycorrhizas play a major role in tree hydromineral nutrition, nutrient cycles and primary production. However, their complexity have so far prevented from deciphering their precise function and role. The recent availability of the genome of the ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor and that of the host-tree Populus trichocarpa provides an unprecedented opportunity to decipher the key components of development and functioning of this symbiosis. The aims of this study were to participate to the characterization and deciphering of the genome of L. bicolor, and to determine the genes involved in the formation of ectomycorrhizas in both partners. Firstly, in order to facilitate the assembly of the genomic sequence of L. bicolor, we have identified the repeated sequences and generated a genetic map. On the 60 Mb of this genome, 8 % are microsatellite sequences and 24 % transposable elements. A genetic map was built from 111 monokaryons issued from L. bicolor S238N. This map includes 326 markers (8 RAPD, 243 AFLP, 59 SSR and 14 SNP) distributed on 10 linkage groups anchored onto the genomic sequence of L. bicolor. Secondly, we have identified the genes involved in the establishment of ectomycorrhizas in poplar by combining QTL detection and DNA microarrays. We targeted 81 genes which can be involved in the establishment and/or the functioning of the symbiosis.
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Relocalisation nucléaire du gène mitochondrial ATP9 chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Bietenhader, Maïlis 22 December 2009 (has links)
L'ancêtre a-protéobactérie endosymbiotique à l'origine des mitochondries avait son propre génome, codant pour de nombreuses fonctions redondantes, voire totalement inutiles dans la cellule hôte. Ces informations ont disparu avec le temps, alors que les autres gènes indispensables ont en grande partie été transférés au noyau de la cellule eucaryote. Aujourd'hui, plus de quatre vingt quinze pourcents des protéines mitochondriales sont codées par le génome nucléaire. La question se pose de savoir pourquoi ces gènes sont maintenus dans les organites. Une manière de répondre expérimentalement à cette question consiste à relocaliser artificiellement au noyau les gènes des organites. Nous avons testé cette relocalisation nucléaire chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Une première étape de l'étude a consisté à déléter le gène mitochondrial ATP9 natif. La délétion du gène ATP9 mitochondrial chez S. cerevisiae conduit à de multiples effets délétères sur la stabilité du génome mitochondrial, son expression, le contenu en complexes de la chaîne respiratoire, mais aussi sur la morphologie des mitochondries. Des expériences antérieures, décrites dans la littérature, avaient échouées dans la relocalisation nucléaire du gène ATP9 de S. cerevisiae. J'ai réussi la relocalisation nucléaire de ce gène chez la levure par une approche différente, avec cette fois un gène ATP9 déjà nucléaire, celui de Podospora anserina. Malgré une différence de 30% dans la séquence primaire des protéines, la protéine Atp9p de P. anserina exprimée depuis le noyau chez S. cerevisiae peut complémenter la délétion mitochondriale du gène ATP9. La levure modifiée peut former des ATP synthases hybrides ayant une bonne activité in vitro. En parallèle de cela, le travail sur P. anserina a donné lieu à une collaboration qui nous a permis d'en savoir un peu plus sur l'expression des deux gènes ATP9 de ce champignon filamenteux. Notons que P. anserina a deux gènes ATP9, nativement nucléaires, chacun étant exprimés à des moments précis du cycle de vie de ce champignon filamenteux. Dans l'évolution, le transfert fonctionnel du gène ATP9 chez P. anserina, comme chez les mammifères, a permis l'acquisition d'un mécanisme de régulation de la quantité d'ATP synthase en fonction des conditions physiologiques de la cellule. / The endosymbiotic a-protéobacteria ancestor of mitochondria had its own genome, specifying rebounding functions, sometimes useless inside the host cell. This piece of information have been lost during the evolution, while other essential genes have in part been transferred to the nucleus of the eukaryotic cell. Nowadays, more than 95% of the mitochondrial proteins are encoded by the nucleus. We ask the question of why there is still genes remaining in the mitochondrial genome. One way to answer experimentally that question is to artificially relocalize those mitochondrial genes to the nucleus. We have tested the nuclear relocation in Saccharomyces cerevisiae. A first step consisted in deleting the mitochondrial ATP9 gene. This deletion led to multiple deleterious effects on the stability of the mitochondrial genome, its expression, on the content of the respiratory complexes, but also on the mitochondrial morphology. Previous studies, described in the literature, have failed in the nuclear relocation of ATP9 of S. cerevisiae. I succeeded in the nuclear relocation of ATP9 using an already nuclear version of the gene, that of Podospora anserina. Despite a 30% divergence of the proteic sequences, the Atp9p of P. anserina expressed from the nucleus in S. cerevisiae can complement the ATP9 deletion. The modified yeast can form hybrid ATP synthases with a rather good in vitro activity. In parallel to that work on P. anserina, this has led to a collaboration which gave us more information on the expression of ATP9 in P. anserina. It is to notify that P. anserina has two ATP9 genes, natively nuclear, each of them being expressed at different times during the life cycle of the fungus. During evolution, the functional transfer of ATP9 to the nucleus, like it is the case in mammals too, has allowed the acquisition of regulatory mechanisms to control the amount of ATP synthases depending on physiological constraints of the cell.
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Deciphering new nonribosomal peptide synthetases and their products from genomic data / Identification de nouvelles synthétases non ribosomiques et de leurs produits à partir de données de génomique

Esmaeel, Qassim Abdullah Ahmed 08 July 2016 (has links)
Les micro-organismes sont considérés comme l'une des sources les plus importantes de métabolites secondaires, y compris les peptides ribosomiques et non ribosomiques. La recherche de nouveaux peptides non ribosomiques a été motivée par leurs larges applications dans diverses industries telles que les secteurs pharmaceutiques et phytosanitaires. Ils sont produits par complexes enzymatiques appelés NRPSs. Plus de 70% des peptides non ribosomiques ont une structure complexe qui comprend un ou plusieurs cycles et des ramifications. Par conséquent, le développement d'outils spécifiques dédiés à la prédiction de ces peptides est nécessaire car ils ne peuvent pas être prédits et analysés comme les peptides classiques. Dans le but d'analyser les voies de biosynthèse et d'identifier de nouveaux peptides actifs, j'ai étudié principalement deux modèles bactériens: Burkholderia et Aeromonas. Le genome-mining est un’ approche très performante pour la découverte de nouveaux NRPs. En effet, pour 48 souches de Burkholderia analysées in silico à l’aide du workflow Florine, 228 clusters de gènes contenant des gènes de NRPS et hybrides NRPS-PKS ont été trouvés. Cette étude a permis de mettre en évidence de nouveaux peptides produits par des Burkholderia, incluant la phymabactin, un nouveau siderophore, et un lipopeptide cyclique que nous avons appelé burkhomycin. La présente étude a d’autre part permis d’éclaircir le mécanisme de fonctionnement des synthétases non ribosomiques, illustrés par la détection des domaines C/E dans des synthétases de lipopeptides cycliques et une utilisation originale des domaines et modules dans les NRPS impliquées dans la biosynthèse des amonabactines chez A.hydrophila. / Microorganisms are considered one of the most important sources of secondary metabolites including ribosomal and non ribosomal peptides. The search of new non ribosomal peptides has been motivated by their wide applications exploited by industries in different area including pharmaceutical and phytosanitary sectors. They are produced through complex synthetases called non ribosomal peptides synthetases. More than 70% of NRPs have a complex structure that includes one or more cycles and branches. Therefore, development of specific tools dedicated to the screening of these peptides is necessary as they cannot be predicted and analyzed as classical peptides. With the aim to further analyse biosynthesis pathways and to identify new active peptides, I mainly studied two bacterial models: Burkholderia and Aeromonas. The genome-mining is a very powerful approach for the discovery of new non NRPs. Indeed, among 48 strains of Burkholderia, 228 gene clusters containing NRPSs and hybrid NRPS-PKS were found via in silico analysis following Florine workflow. The current study lead to the discovery of new peptides in Burkholderia including a new siderophore named phymabactin and a cyclic lipopeptide we have called burkhomycin. It also gave new insights on the mechanism of nonribosomal synthetases, exemplified by the detection of dual C/E domains in NRPSs involved in the production of cyclic lipopeptides by Burkholderia and the identification of a unique use of domains and modules in the pathway responsible for synthesis of amonabactins in A. hydrophila.
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Développement d'outils moléculaires pour faciliter l'ingénierie des génomes

Raymond Fleury, Alexandre January 2018 (has links)
Malgré les progrès récents associés à l’utilisation des nucléases d’ingénierie du génome, certaines problématiques persistent. Par exemple, l’isolement des cellules génétiquement modifiées est un travail long et parfois laborieux. De plus, la spécificité des nucléases est aussi un point souvent mal caractérisé. Cette dernière peut avoir des conséquences importantes in vitro, mais particulièrement in vivo. Le but de mon projet de maitrise était de développer des techniques permettant d’adresser ces deux problématiques. Ici, nous avons créé une cassette de sélection auto-excisable qui exploite le processus de réparation par appariement simple brin (SSA) et qui permet une isolation simple de clones modifiés sans laisser de « cicatrices » dans l’ADN. Le procédé se base sur une sélection à la puromycine, une contre sélection au ganciclovir et une excision de la cassette de résistance via l’utilisation de nucléases thermosensibles. Nous avons démontré la faisabilité de cette approche en intégrant la protéine fluorescente EGFP au locus AAVS1 et en insérant une étiquette de purification au locus EZH2. Ce locus code la protéine Enhancer of Zeste Homolog 2 (EZH2). Dans un deuxième temps, nous avons évalué la possibilité d’utiliser deux paires de nickases pour créer deux cassures simple brin (SSB) et ainsi induire indirectement une cassure double brin dans l’ADN. Cette approche permet de diminuer de façon importante la possibilité de créer des mutations à des sites non-ciblés. Nous avons déterminé que deux SSBs doivent avoir lieu sur des brins opposés et à proximité afin de stimuler la modification génique voulue. Toutefois, ces paires de nickases ont une efficacité plus faible que les nucléases clivant au même endroit. Les nouveaux outils décrits dans ce mémoire permettront éventuellement de simplifier l’ingénierie du génome en diminuant la charge de travail nécessaire à l’enrichissement des cellules modifiées génétiquement et en augmentant la spécificité des nucléases, ce qui permet de réduire les probabilités de mutations à des loci hors cible. / Despite recent advances in the use of engineered nucleases, some issues remain. For example, isolation of genetically engineered cells is a long and sometimes laborious process. Moreover, the specificity of nucleases is often poorly characterized. The latter may have important consequences in vitro, but particularly in vivo. We aimed to develop techniques for addressing these two problems. Here we have created a self-excisable selection cassette that exploits the single-strand annealing (SSA) repair process and allows for simple isolation of modified clones and scarless genome editing. The method is based on puromycin selection, ganciclovir counter-selection and excision of the resistance cassette via the use of heat-sensitive nucleases. We demonstrate the feasibility of this approach by integrating the fluorescent protein EGFP at the AAVS1 locus and by inserting a purification tag at the EZH2 locus. This locus encodes the protein Enhancer of Zeste Homolog 2 (EZH2). Secondly, we evaluated the possibility of using two pairs of nickases to create two single-strand breaks that could be repaired as a double strand break. As a proof of concept, we created two single-strand breaks at a distance of 513 bp at the CCR5 locus. When they take place on opposite strands, the latter can recreate the effect of a double-strand break, but with a lower efficiency than the nucleases cleaving at the same site. We determined that the double-strand break effect created by two single-strand breaks increases as the distance between the two single-strand breaks decreases. The new tools described here make it possible to simplify genome engineering by reducing the workload necessary for the enrichment of genetically modified cells and by increasing the specificity of the nucleases by decreasing the potential for off-target mutagenesis.
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Histoire évolutive d’un groupe mésopolyploïde chez les Brassicaceae : approches transcriptomiques et phylogénomiques pour évaluer les conséquences de la polyploïdie sur l’évolution du système d’auto-incompatibilité / Evolutionary history of a mesopolyploid group in Brassicaceae : transcriptomic and phylogenomic approaches to evaluate the consequences of polyploidy on the evolution of the self-incompatibility system

Hénocq, Laura 19 June 2018 (has links)
La plupart des plantes à fleurs ont connu au moins un évènement de duplication de génome entier (WGD) au cours de leur histoire évolutive et en particulier les membres des Brassicaceae. Ainsi, l’ancêtre commun de la tribu des Brassiceae aurait subi deux évènements successifs de WGD, générant une triplication de génome (WGT). Les évènements de WGD sont généralement suivis d’une diploïdisation impliquant des modifications génétiques, épi-génétiques et transcriptionnelles aboutissant à la formation d’un génome diploïde. Par ailleurs, après un événement de WGD, la dynamique des éléments transposables est perturbée, ce qui peut conduire à une augmentation des évènements de translocation. Dans une lignée de Brassiceae, une réduction de la divergence moléculaire entre allèles ainsi qu’une translocation génomique ont été observées au locus d'auto-incompatibilité (locus S). On suspecte ces patrons d’être associés aux évènements de WGD. A partir d’approches phylogénomiques et d’analyse de la diversité du locus S dans la tribu des Brassiceae, nous souhaitons déterminer si le goulot d’étranglement observé au locus S chez les Brassiceae est contemporain à l’événement de WGT et s’il est associé à une translocation du locus S. Mes analyses suggèrent que toutes les espèces de Brassiceae partagent un même événement de WGT mais aussi que la perte de diversité phylogénétique au locus S semble précéder la diversification des Brassiceae. Néanmoins, mes données ne me permettent pas de conclure fermement quant au lien entre translocation génomique du locus S et événement de WGT, bien qu’elles indiquent que la translocation observée chez Brassica est partagée par plusieurs clades de Brassiceae. / Whole genome duplication events are common in flowering plants and especially within the Brassicaceae family. For example, the common ancestor of the Brassiceae tribe has experienced two successive WGD events, generating a whole genome triplication (WGT). WGD events are generally followed by a diploidization process involving genetic, epigenetic and structural changes leading to a diploid genome. Furthermore, after such an event, the dynamic of transposable elements is disturbed, which can lead to an increase in translocation events. In one lineage of the Brassiceae tribe, a decrease of molecular divergence among alleles and a genomic translocation have been observed at the self-incompatibility locus (S locus). We suspect that these patterns are associated with the allopolyploidy events. Using phylogenomic approaches combined with S-locus diversity analyses, we aim at determining whether the bottleneck observed at the S-locus in the Brassiceae tribe is contemporaneous with the inferred whole genome triplication and whether these events are also associated with the translocation of the S-locus. My analyses suggest that all Brassiceae species share the same whole genome triplication event as well as a loss of phylogenetic diversity at the S-locus predating the divergence of Brassiceae lineages. Nevertheless, my data do not allow me to conclude about the association between the genomic translocation of the S locus and the whole genome triplication event, although they indicate that the translocation found in Brassica is shared by several Brassiceae clades.
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Deinococcus geothermalis genome scale structure study to design and engineer heterologous metabolic pathways / Etude de l'architecture du génome de Deinococcus geothermalis pour la conception et l'ingénierie de voie métaboliques hétérologues

Zaworski, Julie 23 November 2017 (has links)
Deinococcus geothermalis est un organisme non-model intéressant pour les bio-productions de part sa résistance extrême et ses capacités de fermentation partant de diverses sources de carbone. Cependant les outils d’ingénierie permettant une fine maîtrise des voix métaboliques restent limités pour cet organisme. Le but de ce travail de thèse, est d’essayer de surpasser cet obstacle à travers l’observation des motifs génétiques et de leur organisation. L’analyses de ces motifs a été menée via deux approches. La première est l’étude de l’impact de la position dans le génome sur l’expression d’une cassette reportrice. Grâce à une collection de 150 souches, nous avons observé que l’expression est plus forte au niveau de l’origine de réplication que du terminus. Une autre observation concerne la présence de zone de forte expression réparties symétriquement le long du chromosome. La seconde approche est l’analyse des motifs génétiques en cas de stress grace outil GREAT:SCAN:patterns. Ces motifs sont fortement liés régulation de l’expression des gènes et sont des points intéressant pour l’ingénierie du génome. En analysant les résultats de différentes conditions de stress ainsi que les régulons décrits dans la littérature, nous avons pu observer que des stress voisins partagent les mêmes motifs et que ces motifs semblent conservés chez des organismes distants. Ces deux approches ont permis de déterminer des positions d’insertion dans le génome intéressantes pour l’ingénierie métabolique. / Deinococcus geothermalis is a non-model organism of high interest for bio-manufacturing since it shows a extreme resistance and good capacities for fermentation process on different carbon sources. However the engineering tools are limited to finely tuned metabolic pathways for bio-productions. This PhD work aims at contributing to overcome this obstacle through a whole-genome approach to the issue of understanding the genomic organization of D. geothermalis and defined interesting genomic locations. The whole-genome approach is based on the existence of genome-scale patterns that were analyzed in two different ways. A first approach consisted of studying the influence of the genome location on the expression of a reporter cassette. On a library of over 150 strains, the expression is higher near the origin of replication than near the terminus, a common observation. However, other hot spots of expression along the genome additionally appeared with a symmetric distribution about the origin of replication. The second approach consisted of analyzing the genomic patterns under stress through the in-house GREAT:SCAN:patterns software. These patterns interrelate with gene expression regulation and are an interesting key for genome engineering. Testing different stress conditions and considering the matching regulons as described in the literature, it appeared that related stresses share genomic patterns. Moreover these patterns tend to be conserved between distant organisms. These two approaches lead to define interesting genome loci for inserting genes encoding the enzymes of a pathway, with a view to metabolic engineering.
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Etude des gènes de classe I non classiques du complexe majeur d'histocompatibilité chez le porc

Rui, Hu 13 May 2011 (has links) (PDF)
Chez le porc, les trois gènes du CMH de classe I non classiques (gènes SLA-Ib) SLA-6, -7 et -8 sont peu étudiés alors que ce sont des candidats majeurs comme homologues fonctionnels des gènes humains HLA-E, -F et -G qui font l'objet de travaux soutenus de par leur rôle dans la tolérance fœto-maternelle lors de la grossesse chez la femme notamment. Notre objectif a consisté à analyser le polymorphisme, la transcription et l'expression des protéines de ces trois gènes d'intérêt. Nous avons montré que les trois gènes sont transcrits dans une large gamme de tissus, avec une expression prépondérante dans les tissus lymphoïdes, le système digestif et les poumons. Les trois gènes expriment des transcrits qui codent pour des protéines de pleine longueur dont la traduction et la prédiction de conformation sont compatibles avec la présentation de peptides à la surface cellulaire. Les gènes SLA-6 et -7 expriment des transcrits alternatifs qui pourraient coder pour des isoformes solubles, alors qu'un unique transcrit a été trouvé pour le gène SLA-8. Un épissage alternatif dans la région 3' non codante en aval du codon de terminaison a également été identifié pour SLA-7, suggérant l'existence de mécanismes de régulation post-transcriptionnelle pour ce gène. Les analyses de polymorphisme ont confirmé des variations nucléotidiques limitées mais mis en évidence une variation du nombre de copies du gène SLA-7 selon les animaux. Des analyses sont encore en cours pour caractériser la spécificité d'anticorps monoclonaux dirigés contre les molécules SLA-Ib dans des expériences de transfections transitoires en cultures de cellules. Nos résultats sont une contribution importante à la caractérisation des gènes SLA-Ib chez le porc et permettront de poursuivre avec des approches plus fonctionnelles visant l'analyse de leurs possibles fonctions dans des mécanismes liés à l'immuno-tolérance.
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Développement d'un traitement thérapeutique pour la dystrophie musculaire de Duchenne à l'aide des protéines TALENs ou Cas9

Agudelo, Daniel January 2017 (has links)
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie héréditaire liée au chromosome X. Elle est principalement causée par la délétion d’un ou plusieurs exons du gène DMD, ce qui entraine un changement du cadre de lecture et l’obtention d’une protéine dystrophine tronquée et inactive. L’édition de génome par les systèmes TALEN ou CRISPR/Cas9 est devenue dans les dernières années un grand espoir pour le développement de traitements pour ce type de maladie. Dans ce travail, nous illustrons la faisabilité d’un traitement pour la DMD en utilisant les protéines TALENs ou le complexe CRISPR/Cas9 purifiés. Ces protéines sont donc transduites afin de générer des cassures double brin dans l’ADN génomique. Ainsi, la correction de cette mutation par recombinaison non homologue pourra corriger le cadre de lecture du gène codant pour la protéine dystrophine, produisant ainsi une protéine tronquée, mais active, telle que pour les patients Becker. Bien que les protéines TALENs montrent une bonne activité in vitro, l’efficacité de coupure n’a pas pu être observée dans les cellules, ce qu’indiquerait un défaut lors de la transduction protéique. Toute fois, dans le cas du système CRISPR/Cas9, l’essai surveyor a permis d’observer les produits de coupure attendus lors de la transduction de ce système avec des lipides cationiques. Ceci indique donc que le système CRISPR/Cas9 peut être utilisé de façon efficace sous forme protéique tout en ciblant le gène DMD. Finalement, l’utilisation de ce système a été confirmée in vivo chez la souris hDMD, où il a été possible d’observer la présence des délétions ciblées. La transduction de protéines en utilisant le système CRISPR/Cas9 illustre donc une approche thérapeutique prometteuse dans le but de développer un traitement pour les maladies génétiques. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is an hereditary disease linked to chromosome X. It is mainly caused by the deletion of one or more exons of the DMD gene, which causes a change in the reading frame, obtaining a truncated and inactive protein. Genome editting by TALEN or CRISPR/cas9 systems has become in the recent years a powerfull tool for developing treatments for this type of disease. However, the use of plasmids encoding these systems leads to a prolonged expression, which may increase the off-target risk. Thus, it is important to note that today, viruses vectors remain the most effective delivery system for these plasmids, which always entails a risk of integration into the genome, increasing the probability of side effects for a treatment. In this work, we illustrate the development of a genome edditing treatment for DMD, but using purified protein TALENs or Cas9. These proteins are transduced in order to generate double strand breaks in the genomic DNA. Thus, the correction of this mutation by non-homologous end joining can correct the reading frame of the gene, producing a functional Dystrophin protein, as for Becker patients. Although TALEN proteins show a good activity in vitro, the cut-effectiveness has not been observed in the cells. It would indicate a defect in the protein transduction. However, in the case of CRISPR/cas9 system, we have obtained the expected cleavage products during the transduction with cationic lipids in both cell lines. These results are similar with those obteined when the plasmids coding for both systems were transfected. This indicates that the CRISPR/cas9 system can be used effectively in protein form while targeting a gene specifically. Protein therapy using the CRISPR/cas9 system can be a promising method in order to develop an alternative treatment for genetic diseases. Finally, in order to confirm that this system can be used in vivo, we will soon test it in the hDMD mouse model, containing the complete human DMD gene.
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Cartographie des complexes multiprotéiques humains suite à la modification ciblée du génome

Loehr, Jérémy January 2017 (has links)
La purification par affinité couplée à l’analyse par spectrométrie de masse (AP-MS) est une méthode de choix pour l’étude des interactions protéines-protéines chez les cellules humaines. Par contre, cette technique est sensible aux perturbations causées par la surexpression ectopique des protéines cibles. Des effets anormaux, tels que la formation d’agrégats et la délocalisation des protéines cibles, peuvent mener à des conclusions erronées. Il est donc important de reproduire le plus précisément possible les niveaux physiologiques normaux des protéines à l’étude. Les travaux présentés dans ce mémoire décrivent le développement d’un système robuste et rapide couplant l’édition du génome et la protéomique permettant l’isolation de complexes protéiques natifs exprimés à des niveaux quasi physiologiques. L’approche a servie de tremplin afin d’atteindre l’objectif ultime qui est de caractériser les protéines exprimées à partir de leur contexte génomique naturel. À l’aide des outils d’édition génomique, nous avons introduit de façon ciblée au locus AAVS1 une cassette permettant l’expression de protéines d’intérêt étiquetées avec une séquence permettant la purification par affinité. Ainsi, nous avons purifié de nombreuses holoenzymes impliquées dans la réparation de l’ADN et la modification de la chromatine. Nous avons identifié de nouvelles sous-unités et interactions au sein de complexes déjà bien caractérisés et rapportons l’isolation de MCM8/9, soulignant ainsi l’efficacité et la robustesse de notre approche. La technique présentée dans ce mémoire améliore et simplifie l’exploration des interactions protéiques ainsi que l’étude de leur activité biochimique, structurelle et fonctionnelle. / Conventional affinity purification followed by mass spectrometry (AP-MS) analysis is a broadly applicable method to decipher molecular interaction networks and infer protein function. However, it is sensitive to perturbations induced by ectopically overexpressed target proteins and does not reflect multilevel physiological regulation in response to diverse stimuli. Here, we developed an interface between genome editing and proteomics to isolate native protein complexes produced from their natural genomic contexts. We used CRISPR/Cas9 and ZFNs to insert cDNA of interest in the endogenous genomic safe harbor locus AAVS1 and purified several DNA repair and chromatin modifying holoenzymes to near homogeneity. We uncovered novel subunits and interactions amongst well-characterized complexes and report the isolation of MCM8/9, highlighting the efficiency and robustness of the approach. These methods improve and simplify both small and large-scale explorations of protein interactions, as well as the study of biochemical activities and structure-function relationships.

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