Chez les mammifères, l'épithélium épididymaire, via ses activités de sécrétion et de réabsorption, participe à la maturation post-testiculaire des spermatozoïdes en créant un environnement luminal particulier, tout au long du trajet épididymaire. Les études visant à caractériser les activités de sécrétion de cet organe et à analyser la régulation des gènes impliqués, ont été freinées par l'absence de cellules en culture pour cet épithelium très différencié. Malgré de nombreuses tentatives, les systèmes de cellules en culture développés jusqu'à présent ne reflètent pas l'état de différenciation des cellules épididymaires in vivo. En particulier, des gènes, que l'on peut considérer comme des marqueurs terminaux de la différenciation épididymaire, ne sont pas exprimés dans les cellules en culture. gpx5, gène modèle du laboratoire, codant pour une protéine sécrétée de la famille des glutathion peroxydases est un bon exemple de gène épididyme-spécifique, que l'on ne retrouve pas dans les systèmes de cellules en culture disponibles à ce jour. Dans cette étude, nous avons utilisé gpx5, PEA3 et l'indoleamine 2, 3-dioxygénase (IDO) et divers autres gènes, exprimés dans l'épididyme des mammifères, comme indicateurs de l'état de différenciation de lignées cellulaires établies de tête d'épididyme murin. Ces dernières sont issues de cultures primaires, qui se sont naturellement immortalisées par accumulation de mutations aléatoires. Dans un deuxième temps, nous avons tenté d'optimiser les conditions de culture de ces cellules afin d'améliorer le niveau d'expression de certains gènes épididymaires, en particulier gpx5, pris comme référence.

L'oxaliplatine est un médicament de référence dans les traitements des cancers colorectaux métastatiques. Toutefois, l'oxaliplatine occasionne une toxicité d'ordre neurologique qui retentit sur la qualité de vie de certains patients prédisposés. Nous avons analysé pour la première fois la neurotoxicité de l'oxaliplatine par une approche protéomique. Un protocole expérimental, associant marquage iTRAQ et fractionnement par IEFOFFGEL a tout d'abord été mis en place afin d'améliorer la couverture protéomique d'échantillons complexes. Puis, l'expression protéique différentielle après traitement par I'oxaliplatine a été analysée globalement, à la fois dans le protéome intracellulaire et dans le sécrétome d'un modèle cellulaire humain de nerotoxicité. L'analyse du protéome intracellulaire a permis l'identification de plus de 2700 protéines et offre de nouvelles perspectives quant aux mécanismes moléculaires de la neurotoxicité de I ' o x aliplatine. Le médicament aItère l'expression de protéines impliquées dans la réponse aux dommages à l'ADN, le contrôle du cycle cellulaire, le stress oxydatif , le métabolisme énergétique, le stress protéotoxique, la résistance multidrogue, la plasticité neuronale et l'homéostasie calcique. L'analyse du sécrétome a mis en évidence la sur-expression, suite au traitement par l'oxaliplatine, de 23 protéines sécrétées. Nous proposons pour la première fois les protéines Calmoduline, Thymosine beta-10 et le facteur neurotrophique Neudésine comme candidats biomarqueurs de la neurotoxicité des traitements anticancéreux à base d'oxaliplatine.

Les microcystines (MCs), hépatotoxines produites par des cyanobactéries d'eau douce, sont incriminées dans des intoxications humaines et animales. L'ingestion est leur principale voie d'exposition chez l'homme. Parmi les quelques 90 variants décrits, la MC-LR constitue le variant le plus toxique et le mieux connu sur lequel est fondé l'évaluation du risque associé aux MCs. Afin de mieux caractériser le danger pour l'homme par ingestion, nous avons choisi d'étudier et de comparer l'absorption et la toxicité de deux variants, la MC-LR et la MC-RR, sur un modèle cellulaire intestinal humain, les Caco-2. Ces deux variants, de structure quasi identique, sont connus pour leur différence de toxicité aiguë. Nous avons montré que, contrairement aux cellules hépatiques, les Caco-2 absorbent les deux variants de manière similaire. De plus, nos travaux suggèrent l'existence d'un efflux actif de la MC-LR et de la MC-RR par les Caco-2. Enfin, une étude à l'échelle pangénomique a permis de mettre en évidence des différences de réponses cellulaires, avec des atteintes plus marquées de la MC-LR sur la réponse au stress oxydant, la régulation du cycle cellulaire, le stress du réticulum endoplasmique et la dégradation des protéines. Ainsi, les mécanismes de toxicité mis en jeu par les deux variants semblent diverger. Nos travaux soulignent donc la nécessité d'obtenir de données complémentaires sur d'autres variants que la MC-LR pour affiner l'évaluation du risque associé aux MCs.

Les cellules épithéliales sont à la base de nombreuses fonctions vitales chez les mammifères, en particulier grâce à leurs propriétés de polarisation et de cohésion dynamiques regroupées sous le terme de « Plasticité Epithéliale ». Une manifestation originale de cette plasticité est la Transition Epithélio-Mésenchymateuse (EMT, Epithelial-Mesenchymal Transition), un processus complexe qui permet à une cellule épithéliale (ou un groupe de cellules) de modifier sa composition et l'organisation de ses protéines pour se détacher de la masse cellulaire à laquelle elle appartient, et ainsi acquérir une organisation de type fibroblastique propice à la motilité cellulaire. Ce phénomène, initialement mis en évidence pour son rôle dans le développement embryonnaire, met en jeu une régulation fine, sous le contrôle de facteurs de transcription dont certains semblent également jouer un rôle au cours de la progression tumorale. Le facteur SNAIL1 (ou SNAIL), dont le rôle est déterminant au cours de la mise en place de nombreux organes, est également fortement exprimé au niveau du front invasif de certains carcinomes et pourrait participer à la dissémination des cellules cancéreuses au sein de l'organisme. Au cours de l'EMT, son expression, sa localisation et son activité sont soumises à une régulation complexe qui implique plusieurs modifications post-traductionnelles, en particulier la phosphorylation. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse a été de comprendre les mécanismes de régulation de SNAIL1 par la protéine-kinase CK2 au cours de l'EMT. Ce travail a été réalisé en deux étapes dont la première fût une caractérisation biochimique de la phosphorylation de SNAIL1 par CK2 et sa régulation par la sous-unité régulatrice CK2β. Dans un deuxième temps, je me suis penché sur l'étude des conséquences de l'inhibition du complexe CK2 par ARN interférence dans les cellules épithéliales mammaires MCF10A. Ce modèle a permis de mettre en évidence le rôle déterminant de CK2β dans le maintien de l'expression d'un phénotype épithélial et d'une architecture cohésive au sein des cellules MCF10A en culture in vitro. L'ensemble de ces résultats suggère en effet que la protéine-kinase CK2, sous le contrôle de sa sous-unité régulatrice CK2β, exerce une régulation négative sur le niveau d'expression transcriptionnelle et la stabilité protéique de SNAIL1 visant à s'opposer à l'induction de l'EMT.

Les systèmes de transduction du signal et les transporteurs ABC contribuent de façon conjointe à la réponse adaptative des bactéries aux changements d'environnement. Trois modules, associant un phosphorelais et un transporteur ABC, ont été répertoriés chez B. subtilis et sont impliqués dans la réponse à différents antibiotiques: BceRSAB, PsdRSAB et YxdJKLM. Ils sont caractérisés par une histidine kinase possédant une boucle extracytoplasmique courte et appartenant à la famille des Intramembrane Sensing - Histidine Kinase (IM-HK) et par un transporteur ABC possédant une Membrane Spanning Domain (MSD) à boucle extracytoplasmique exceptionnellement longue. En utilisant une approche phylogénomique, il a été établi que ce type de modules était restreint aux Firmicutes, où ils sont apparus et se sont largement répandus. De plus, cette analyse met en lumière une histoire évolutive très dynamique impliquant de nombreux transferts horizontaux, duplications et pertes de gènes, conduisant à un répertoire de modules Bce-like très varié chez ce phylum. Grâce à une analyse phylogénétique fine, il a été proposé une classification de ces modules en six sous-familles bien définies. Des études fonctionnelles ont été réalisées sur des membres de la sous-famille IV comprenant le module de résistance à la bacitracine BceRSAB de B. subtilis, dont l'expression des gènes codant pour le transporteur requiert, en présence de l'antibiotique, le système de transduction du signal aussi bien que le transporteur lui-même. Les résultats de ces études montrent que d'autres membres de la sous-famille IV, YtsCD de B. licheniformis et BceAB de B. halodurans, sont également impliqués dans la résistance à la bacitracine. Ils suggèrent aussi que dans ces modules le transporteur ABC est le premier senseur de la présence de l'antibiotique et qu'il active le système de transduction une interaction entre une sous unité du transporteur et la kinase du module. De plus, en présence de bacitracine, l'expression des gènes codant pour le transporteur BceAB ainsi que la résistance à cet antibiotique requièrent la présence de la boucle de la MSD BceB ce qui démontre l'importance de cette boucle aussi bien au niveau fonctionnel que structural. Par ailleurs, l'étude que nous avons réalisée suggère que le mécanisme original de régulation des gènes du transporteur BceAB de B. subtilis pourrait être généralisé à tous les modules équivalents présents chez les Firmicutes. Ces modules constitueraient ainsi un mécanisme important de résistance aux antibiotiques peptidiques chez les bactéries de ce phylum qui comprend de nombreux pathogènes.

Le diagnostic précis et précoce des tumeurs, ainsi que le développement de thérapies ciblées sont deux axes principaux de recherche en cancérologie. La génération de vecteurs spécifiques capables d'adresser un agent de contraste et/ou un médicament au niveau de la tumeur primaire et des métastases serait un atout majeur pour le diagnostic précoce et la thérapie des cancers. Dans une double optique de diagnostic et de thérapie, les nanoparticules sont apparues comme des candidats prometteurs pour la mise en place de protocoles thérapeutiques incluant le ciblage de la tumeur, son diagnostic par des techniques d'imagerie optique, ainsi que sa thérapie. Dans ce contexte notre laboratoire développe des appareils d'imagerie optique du petit animal (2D et 3D), afin de permettre le suivi de la biodistribution à long terme et de manière non invasive de sondes fluorescentes et de nanoparticules in vivo. La caractérisation du comportement de différentes nanoparticules (nanocapsules lipidiques, nanoparticules d'oxyde de Gadolinium et nanoparticules d'or) présentant différentes fonctionnalisations de surface a été réalisée in vitro et in vivo sur différents modèles tumoraux. Les résultats obtenus montrent l'influence de la fonctionnalisation et de la taille des nanoparticules sur leur biodistribution in vivo et sur leur voie d'élimination. D'autre part, la fonctionnalisation des nanoparticules par le motif RGD permet le ciblage spécifique des cellules exprimant l'intégrine alpha v beta3 in vitro et améliore l'accumulation tumorale in vivo.

La dérégulation des facteurs NF-κB, impliqués dans la survie cellulaire et l'inflammation, peut entraîner des pathologies inflammatoires chroniques et des cancers. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse était d'identifier des régulateurs négatifs des voies NF-κB conservées au cours de l'évolution, Toll et Imd, chez la drosophile. De nombreux éléments de ces voies sont régulés par ubiquitination. Les « Ubiquitine Specific Proteases » (USPs) constituent ainsi un nouveau champ d'investigation pour rechercher des régulateurs de ces voies. J'ai réalisé le crible d'une collection d'ARN interférents permettant l'inactivation des 21 USPs de drosophile en cellules S2. Ce crible a mis en évidence trois régulateurs négatifs de la voie Imd, dont un montre également une activité sur la voie Toll. Parmi ces candidats, dUSP36, un homologue de la protéine humaine USP36, avait été préalablement sélectionné par un crible génétique au laboratoire. Des études de l'équipe auxquelles j'ai contribué, montrent son rôle in vivo dans la régulation négative de la protéine adaptatrice Imd via son activité catalytique. Afin de caractériser la fonction des deux autres USPs, j'ai mené des expériences de transgénèse chez la drosophile qui prouvent que ces deux USPs répriment la voie Imd en cas d'infection et qu'elles sont requises pour maintenir l'état inactif de la voie Imd en l'absence d'infection. J'ai également entrepris de caractériser l'activité catalytique des deux USPs in vitro. L'originalité de mon travail a consisté à limiter le crible à une famille de gènes, ce qui a permis de détecter de nouveaux régulateurs qui n'avaient pas été mis en évidence dans des cribles antérieurs.

Dans les organismes photosynthétiques, la ferrédoxine:NADP oxydoréductase (FNR) fournit le NADPH nécessaire à l'assimilation du CO2, mais elle réduit aussi la ferrédoxine (Fd) à partir du NADPH. La cyanobactérie Synechocystis sp. PCC6803 contient deux isoformes de FNR : une forme courte (FNRS, 34 kDa) et une forme longue (FNRL, 46 kDa) qui est liée au phycobilisome (PBS), un complexe collecteur de lumière. Nous avons purifié un sous-complexe du PBS qui contient la FNRL (FNRL-PC) et comparé les propriétés enzymatiques de FNRL-PC à FNRS. Par rapport à FNRS, FNRL-PC présente des affinités plus faible/forte pour le NADPH/la Fd, conformément aux prédictions des activités relatives des deux isoformes. La plupart des différences observées sont attribuées à l'encombrement stérique amené par la phycocyanine dans FNRL-PC. En conditions de turnover multiple, les deux isoformes catalysent de la même manière la réduction de NADP+ et de plus le transfert d'électrons (TE) depuis Fdred est limitant à force ionique élevée. Lors d'études in vivo, nous avons observé une augmentation de l'oxydation du NADPH par TE respiratoire ou cyclique chez un mutant ne contenant que la FNRS et chez le type sauvage à faible CO2. Les mesures ont montré clairement que FNRS est impliqué dans ce TE alternative et nous proposons que FNRS constitue le module déshydrogénase de NDH-1. La localisation de la FNR et/ou la présence de substrats semblent être essentiels dans les rôles respectifs des isoformes de FNR in vivo. Des études futures devraient nous donner une vue plus complète des processus de TE in vivo et clarifier le rôle du TE dépendant du NADPH et favorisé par FNRS dans la réduction du pool de PQ

La bioénergétique moléculaire des systèmes est une nouvelle direction de recherche scientifique qui s'inscrit dans la Biologie des Systèmes. Elle étudie et décrit le métabolisme énergétique intégré cellulaire non seulement comme un réseau de réactions mais aussi décrit ses aspects spatiaux (organisation) et temporels (dynamique). La bioénergétique moléculaire des systèmes considère l'organisation spatiale intracellulaire comme un processus dynamique dont la topologie elle-même renferme des informations. Ce projet tend à mettre l'accent sur une approche expérimentale décrivant les réseaux de phospho-transferts intracellulaire. Le principal objectif de ce travail fut la description comparative de l'hétérogénéité de la compartimentation des nucléotides adényliques et la complexité structurale et fonctionnelle des communications entre la mitochondrie et d'autres structures ou processus intracellulaire (cytosquelette, glycolyse) dans les cellules nerveuses (synaptosomes) et cardiaques (cardiomyocytes adultes et lignée cancéreuse de cellules HL-1). Les résultats de ce projet ont démontré 1/ la régulation de la perméabilité de la membrane externe mitochondriale par le facteur X (association de la tubuline hétérodimérique avec la porine voltage dependent anion channel), 2/ le couplage fonctionnel entre la creatine kinase mitochondriale et l'adénine nucléotide translocase , 3/ les mécanismes de régulation de la respiration mitochondriale in vivo qui ont permis d'établir un schéma de l'Interactosome Mitochondrial, 4/ les variations de régulation métabolique associées au cancer et 5/ l'hétérogénéité de la diffusion des nucléotides adényliques et leur micro- voire nano-compartimentation après activation des créatines kinases (par spectroscopie à corrélation de fluorescence).

Le cancer bronchique non-à petites cellules (CBNPC) représente 80% des cancers du poumon et possède un pronostic extrêmement médiocre, avec une survie à 5 ans inférieure à 15%. Le gefitinib, une molécule appartenant à la famille des inhibiteurs de la tyrosine kinase de l'EGFR (EGFR-TKI) a montré de puissants effets anti-prolifératifs dans les CBNPC, mais la grande variabilité des réponses a incité la recherche de marqueurs capables de prédire une résistance ou une sensibilité à ce traitement. Les patients porteurs de CBNPC résistants au gefitinib ont des taux d'amphiréguline (AREG) sérique élevés, suggérant l'implication de l'AREG dans la résistance au gefitinib. Nous avons d'abord cherché à démontrer le rôle de l'AREG dans la résistance au gefitinib des cellules de CBNPC avant d'en décrire le mécanisme moléculaire. Notre travail montre que l'AREG permet de résister à l'apoptose induite par le gefitinib in vitro et in vivo en inactivant la protéine proapoptotique Bax. L'AREG induit une diminution du niveau d'expression de Bax et augmente son interaction avec la protéine Ku70, par un mécanisme dépendant de l'acétylation de Ku70. Nous décrivons ainsi un mécanisme original de résistance au gefitinib, dépendant de l'acétylation et contrôlé par un facteur de croissance, l'AREG. Dans un contexte où le cancer pulmonaire est un problème majeur de santé publique et où la résistance aux traitements reste une des principales préoccupations des professionnels de santé, nos travaux suggèrent des applications potentielles pour la prise en charge clinique des patients porteurs de CBNPC. Ces applications concernent à la fois les domaines diagnostique et thérapeutique. En effet, nous démontrons le rôle central de l'AREG dans la résistance au gefitinib et proposons son utilisation comme biomarqueur prédictif d'une résistance à ce traitement. De plus, nous proposons d'associer les EGFR-TKI à une thérapie anti-AREG ou aux inhibiteurs d'histone-déacétylases, notamment chez les patients porteurs de CBNPC résistants au gefitinib.