Thèse de doctorat : Physico-chimie : Paris 12 : 2003. / Titre provenant de l'écran-titre.

Abstract: Concomitant chemoradiation therapy based on platinum chemotherapeutic drugs (Pt-drugs) is a common treatment modality for several types of cancers and has dramatically improved patient survival. The radiosensitization capacity of Pt-drugs results essentially from their binding to nuclear DNA. Although several mechanisms such as increase in the radiation damage to DNA and inhibition of their repair have been proposed, the contribution and efficiency of the underlying molecular mechanisms of the radiosensitization remain unknown. This PhD thesis determines the relative efficiency of Pt-drugs, in terms of the type of drug and the quantity of Pt-DNA adducts, in the sensitization of DNA to the direct and indirect effects of ionizing radiations, and elucidates the major mechanism responsible for this radiosensitization. In particular, it addresses the role of low-energy electrons (LEEs), hydroxyl radicals and hydrated electrons in the radiosensitization of DNA modified by Pt-drugs. This thesis includes a review of the literature on the molecular basis of radiotherapy, Pt-based chemotherapy, and their combination in cancer treatment. Five articles, on which I am first author, are presented, and followed by a comprehensive discussion that integrates all results and their implications in the clinic and future research. With respect to the direct effect of radiation, LEEs are found to be the main species responsible for the enhancement in DNA damage, particularly cluster damage including DSB and interduplex cross-links. Irradiation of a 3199-bp plasmid DNA modified by an average of 2 Pt-drug adducts with 10-eV electrons results in significant increases in DSB formation by factors of 3.1, 2.5 and 2.4, respectively, for carboplatin, cisplatin and oxaliplatin relative to unmodified DNA. Irradiation of these samples with subexcitation-energy electrons (i.e., 0.5 eV) generates substantial number of DSB in the modified DNA, while no DSB is observed in the unmodified DNA. Since 0.5 eV is well below that energy required for the electronic excitation of organic molecules, dissociative electron attachment must be the main mechanism responsible for the formation of strand breaks in the presence of Pt-adducts. For indirect effects of radiation, our results show that both hydroxyl radicals and hydrated electrons are responsible for the enhanced formation of damage in modified DNA. In the presence of Pt-adducts, hydroxyl radicals mainly contribute to the SSB formation, while hydrated electrons are the main species responsible for the DSB formation. Our results indicate that carboplatin and oxaliplatin have higher efficiency than cisplatin in the enhancement of radiation damage to DNA. At low frquencies of Pt-DNA adducts (i.e., less than 3.1x10-4 adducts per nucleotide), radiosensitization of DNA, in terms of the damage per adduct, increases by an order of magnitude compared with that at large frquencies of adducts. In conclusion, Pt-drug modification is an extremely efficient means of enhancing the formation of DNA DSBs by both LEEs and hydrated electrons created by ionizing radiation.//Résumé: La radiochimiothérapie concomitante, basée sur les médicaments antinéoplasiques platinés (Pt-antinéoplasiquesm), est une modalité de traitement utilisé contre plusieurs types de cancers et a considérablement amélioré la survie des patients. Parmi ces médicaments anticancéreux, les analogues de platine sont les plus couramment utilisés. Leur capacité à radiosensibiliser résulte essentiellement de leur liaison à l'ADN nucléaire. Bien que plusieurs mécanismes aient été proposés telles que l'augmentation des dommages induits à l'ADN et l'inhibition de leur réparation, la contribution et l’efficacité des mécanismes moléculaires sous-jacents à la radiosensibilisation restent inconnus. La présente étude examine l'efficacité Pt-antinéoplasiques à sensibiliser l'ADN aux rayonnements ionisants et détermine le rôle des électrons secondaires, des radicaux d'hydroxyles et des électrons hydratés dans ce processus. Cette thèse comprend un revue des données scientifiques concernant la base moléculaire de la radiothérapie, de la chimiothérapie Pt-antinéoplasiques et de leur combinaison dans le traitement de cancer. Cinq articles, donc je suis premier auteur, sont présentés suivis d'une discussion qui intègre mes résultats et leurs implications dans la clinique et la recherche future. En ce qui concerne l'effet direct des radiations, les électrons de faible énergie s'avèrent être la principale espèce responsable de l’augmentation des dommages à l’ADN, en particulier les dommages multiples localisés, les CDBs et les pontages inter-brin. L'irradiation de plasmides de 3199 paires de bases, contenant en moyenne deux adduits Pt-ADN, avec des électrons de 10 eV conduit à une augmentation significative des CDBs par des facteurs de 3.1, 2.5 et 2.4, respectivement, pour le carboplatine, le cisplatine et l'oxaliplatine par rapport à l’irradiation des plasmides non modifiés. L'irradiation avec des électrons de 0.5 eV genère un nombre substantiel de CDBs dans les plasmides modifiés, alors qu'aucune CDB n'est observée dans les plasmides non modifiés. Puisque 0.5 eV est une énergie bien inférieure à celle nécessaire à l'excitation électronique des molécules organiques, l'attachement dissociatif de l’électron doit être le principal mécanisme responsable de la formation de cassures en présence de Pt-antinéoplasiques. Pour les effets indirects des rayonnements, nos résultats montrent que les radicaux hydroxyles et les électrons hydratés sont, tous les deux, responsables de la formation accrue des dommages dans l'ADN modifié. En présence d'adduits Pt-ADN, les radicaux hydroxyles contribuent principalement à la formation de cassures simple brin, tandis que les électrons hydratés sont les principales espèces responsables de la formation de CDBs. Nos résultats indiquent que le carboplatine et l'oxaliplatine sont plus efficaces que le cisplatine pour augmenter les dommages à l'ADN. À faible concentration de Pt-ADN (soit moins de 3.1x10[indice supérieur -4] adduit par nucléotide), la radiosensibilisation de l'ADN, en termes de dommages par adduit, est d'un ordre de grandeur supérieure à celle aux concentrations élevées. En conclusion, l’ajout de Pt-antinéoplasiques est un moyen extrêmement efficace d'augmenter la formation de CDBs dans l’ADN par l’intermédiaire des électrons de faible énergie et des électrons hydratés produits par les rayonnements ionisants. [symboles non conformes]

Abstract: Advances in curing rectal cancer came from successful chemoradiotherapy. Platinum-based drugs such as oxaliplatin have also been studied and integrated in treatment strategies against rectal cancer. Although platinum-based drugs can act as radiosensitizers, their radiosensitizing activity is limited by their narrow therapeutic index which avoids the dose escalation. In addition, it is important also to optimize the schedule of drug administration with radiation treatment to gain advantage of drug-radiation interactions and maximize tumor response. We evaluated the new liposomal formulation of cisplatin and oxaliplatin (Lipoplatin and Lipoxal, respectively) that should increase the anticancer effectiveness while minimizing the side effects. We investigated different chemoradiation schedules to assess the best antitumor efficacy with regard to our hypothesis of the "true" concomitant chemoradiotherapy which consist in the addition of radiation at the time of maximum accumulation of platinum in the DNA of cancer cells. We performed in vitro studies using human colorectal carcinoma HCT116, and in vivo using nude mice HCT116 xenograft. Pharmacokinetic studies on platinum accumulation were measured by inductively coupled plasma mass spectrometry. Regarding the results of DNA-platinum concentrations, the synergy with radiation was assessed for in vitro and in vivo studies. Cytotoxicity was determined by a colony formation assay, while the resulting tumor growth delay in animal model was correlated to induction of apoptosis and histophatology analyses. The synergism of combined treatments was evaluated using the combination index method. In this study, a radiosensitizing enhancement was observed with combining radiation treatment with cisplatin, oxaliplatin and their liposomal formulations in both in vitro and in vivo studies. Variations of platinum accumulation with incubation time in normal and tumor tissues and in different cell compartments, as well as platinum-DNA were measured. A higher level of synergism was observed when radiotherapy was performed in vitro at 8 h of exposure and in vivo at 4 and 48 h after drug administration, which corresponded to the times of maximal platinum binding to tumor DNA. These results were correlated to a highest induction of apoptosis and a low mitotic activity. In conclusion, the optimal treatment schedule of chemoradiotherapy is dependent on the time interval between drug administration and radiation, which was closely associated to the kinetics of platinum accumulation to DNA and the intracellular concentration of the platinum drugs. Regarding our hypothesis, administered radiotherapy to the time intervals of maximum synergism could improve efficacy of chemoradiation treatment. This should be confirmed in clinical trials. //Résumé: Les progrès des traitements du cancer colorectal proviennent principalement des succès en chimio-radiothérapie. Toutefois, l'augmentation de l'activité radiosensibilisante du cisplatine et de l'oxaliplatine est principalement limitée par leur toxicité ce qui limite la dose administrée. Par conséquent, l’optimisation de la séquence et de la cédule d’administration entre la chimiothérapie et la radiothérapie devient essentielle pour maximiser l’interaction du rayonnement ionisant et de la chimiothérapie et ainsi optimiser la réponse tumorale. Notre objectif est de développer une cédule optimale de la chimio-radiothérapie pour obtenir la meilleure efficacité anti-tumorale tout en minimisant les effets secondaires aux tissus sains. Pour atteindre ce dernier objectif, nous avons également évalué la nouvelle formulation liposomale de cisplatine et d’oxaliplatine (Lipoplatin™ et Lipoxal™, respectivement) qui ont pour but d'accroitre l'efficacité anticancéreuse tout en réduisant les effets secondaires. Nous avons étudié la séquence optimale de radio-chimiothérapie en lien avec notre hypoThèse de "vraie" concomitance qui favorise l'ajout de rayonnement au moment de l'accumulation maximale de platine dans l'ADN des cellules cancéreuses. Nous avons effectué des études in vitro utilisant le carcinome colorectal humain HCT116, et in vivo sur des souris nue HCT116 xénogreffe. Les études pharmacocinétiques sur l'accumulation de platine ont été mesurées par spectrométrie de masse couplée au plasma induit. La cytotoxicité a été déterminée par un essai de formation de colonie, tandis que le retard de croissance tumorale obtenue en modèle animal est corrélé à l'apoptose et analyses histopathologiques. La synergie des traitements combinés a été évaluée en utilisant l'indice de combinaison. Dans cette étude, nous avons observé une amélioration de la radiothérapie combinée avec le cisplatine, l'oxaliplatine et leurs formulations de liposomes à la fois in vitro et in vivo. Des variations entre l'accumulation du platine dans les cellules cancéreuses, de tissus normaux et tumoraux, ainsi que des adduits du platine à ADN en fonction de la cédule d'administration du médicament ont été observées. Un fort effet concomitant in vitro a été observé lorsque la radiothérapie a été délivrée à 8 h et in vivo à 4 et 48 h après l'administration du médicament, ce qui correspondait au temps de liaison maximale du platine à l'ADN tumoral. L'augmentation de la radiosensibilisation a été corrélée à une élévation de l’apoptose et une réduction de l’activité mitotique. La cédule de traitement optimal de la chimio-radiothérapie dépend de l'intervalle de temps entre l'administration de la radiation et de la drogue, ce qui a été étroitement associé à la cinétique d’accumulation de platine à l’ADN et de leurs concentrations intracellulaires. En conclusion, les meilleurs résultats in vitro et in vivo pourraient être ultérieurement confirmés en essai clinique pour valider ces concepts.

L'oxaliplatine, largement utilisé dans le traitement du cancer colorectal, se singularise par la survenue très précoce, dés le début du protocole de chimiothérapie de troubles douloureux associés à la perception du froid (hypersensibilité au froid). De nombreux traitements ont été testés pour ces symptômes sans grand succès, c'est pourquoi le développement de nouveaux analgésiques est nécessaire. Le but de ce travail est de développer un modèle souris reproduisant cette hypersensibilité au froid et d'en rechercher les mécanismes physiopathologiques. Comme chez les patients, l'administration aigüe d'oxaliplatine entraîne une amplification importante de la perception du froid chez la souris. Nous montrons que ces symptômes sont médiés par les nocicepteurs exprimant le thermorécepteur TRPM8. Sur le plan du mécanisme physiopathologique, l'oxaliplatine favorise l'excitabilité de ces nocicepteurs en diminuant de manière drastique l'expression des plusieurs canaux potassiques (TREK1 et TRAAK en particulier), et en augmentant l'expression de canaux proexcitateurs tels que les canaux cationiques activés par l'hyperpolarisation (HCN1 notamment). Ces constatations sont confortées au niveau comportemental par l'analyse de la lignée de souris double KO pour TREK1 et TRAAK, et par l'utilisation de l'Ivabradine, un inhibiteur pharmacologique spécifique des canaux HCNs. L'ivabradine, déjà utilisé en clinique pour le traitement de l'insuffisance cardiaque, entraîne une disparition de l'hypersensibilité au froid induite par l'oxaliplatine. Collectivement, ces résultats suggèrent que l'oxaliplatine exacerbe la perception du froid en remodelant le patron d'expression de plusieurs canaux ioniques qui coordonnent la réponse au froid. L'ivabradine peut ainsi représenter un traitement sur mesure pour les neuropathies induites par l'oxaliplatine. / The hallmark of oxaliplatin-induced neuropathy is a hypersensibility to cold that develops in nearly all patients ultimately leading to cessation of this chemotherapy treatment. To date, classical pain management strategies have failed to alleviate these painful symptoms, and hence there is a need for developing new and efficient analgesics. Here we report that, as in patients, oxaliplatin mediates a clear development of exaggerated perception of cold temperatures in mice. These symptoms are mediated by nociceptors expressing the thermoreceptor TRPM8. Mechanistically, we find that oxaliplatin promotes excitability in nociceptors drastically lowering the expression of distinct potassium channels (TREK1, TRAAK) that act as excitability brakes for cold perception, and by increasing the expression of pro-excitatory channels such as the hyperpolarisation-activated channels (HCNs). These findings are corroborated by the analysis of the TREK1-TRAAK null mice, and by the use a specific HCN channel inhibitor abolishing the oxaliplatin-induced cold hypersensibility. Collectively, these results suggest that oxaliplatin exacerbates cold perception in cold sensing neurons by transcriptionally remodeling a combination of ionic conductances that together shape the final response to cold. A direct promising clinical consequence of these findings for patients would be that the HCN inhibitor ivabradine could represent a tailored treatment for oxaliplatin-induced neuropathy.

L'oxaliplatine est un médicament anticancéreux utilisé dans la chimiohyperthermie intrapéritonéale (CHIP), pour le traitement des carcinoses péritonéales (CP). En dépit de l'efficacité de la CHIP, l'infiltration de l'oxaliplatine dans les tumeurs traitées est très peu connue. L'étude de la pénétration du médicament dans des tumeurs prélevées à partir de patients atteints de CP et traités CHIP, a fait l'objet de la première partie du projet de recherche. Par ailleurs, les mécanismes de transport du médicament jusqu'à l'ADN cellulaire n'ont pas été bien déterminés. Néanmoins, des hypothèses suggèrent que certains métabolites soufrés de l'oxaliplatine pourraient constituer des "formes réservoirs", capables de transporter le médicament jusqu'à l'ADN. La deuxième partie du projet a consisté à étudier de manière plus approfondie la réactivité d'un des métabolites soufrés de l'oxaliplatine. Nous avons développé une méthode d'imagerie par spectrométrie de masse MALDI/TOF, qui permet de déterminer la distribution de l'oxaliplatine et ses métabolites, dans les tumeurs humaines traitées CHIP. Nos résultats révèlent une pénétration du médicament limitée à quelques millimètres et une détection exclusive du métabolite oxaliplatine-méthionine (Ox-M) : un métabolite considéré « inactif », puisqu'il serait stable et incapable d'interagir avec l'ADN. Afin de démontrer la réactivité de ce métabolite, nous avons tout d'abord étudié son interaction avec les cibles de l'oxaliplatine, à savoir la guanine et l'ADN. Nos résultats démontrent la capacité de Ox-M à libérer la partie réactive de la molécule pour interagir avec la guanine, et former des adduits sur des duplexes d'oligonucléotides qui miment la structure de l'ADN. De plus, les adduits formés par Ox-M induisent un arrêt de l'élongation de l'ADN. Ces résultats démontrent la réactivité du métabolite Ox-M de l'oxaliplatine, et suggèrent son implication dans une nouvelle voie active du médicament. / Oxaliplatin is an anticancer drug used in Heated Intraoperative Chemotherapy (HIPEC) to treat peritoneal carcinomatosis. In spite of HIPEC efficiency, oxaliplatin penetration in treated tumors is not very well known. Study of oxaliplatin penetration in tumors of patients suffering from CP and treated with HIPEC, was the first part of the research project. Furthermore, transport mechanisms of the drug to cell DNA are not well established. Nevertheless, hypotheses suggest that some sulfur metabolites of oxaliplatin, could constitute "tanks" which are able to transport drug until DNA. The second part of this project aimed to study more deeply the reactivity of oxaliplatin sulfur metabolites. We have developed a MALDI imaging mass spectrometry method, which allows studying the distribution of oxaliplatin and its metabolites in human tumors. Our results reveal a drug penetration limited to few millimeters and an exclusive detection of the oxaliplatin- methionine metabolite (Ox-M): a supposed "Inactive" metabolite, because of its stability that prevents its interaction with DNA. To provide evidence of Ox-M reactivity, we studied its interaction with oxaliplatin targets: guanine and DNA. Our results showed that Ox-M is able to release the active part of the molecule to interact with guanine, and to form adducts on oligonucleotides duplexes that mimic DNA structure. Moreover, Ox-M adducts induce an arrest of DNA elongation. These results suggest the implication of Ox-M in a new active pathway of oxaliplatin cytotoxicity.

Les chimiothérapies à base de sels de platine exercent leurs effets anti-tumoraux en compromettant l'intégrité de l'ADN. Cette cytotoxicité conduit à une augmentation du stress oxydant qui, à son tour, favorise les processus de mort cellulaire. L'oxaliplatine indiquée dans les cancers métastatiques secondaires du colon et dans les cancers colorectaux, induit une augmentation des espèces réactives de l’oxygène en diminuant le glutathion réduit dans les cellules cancéreuses. Similairement aux autres chimiothérapies à base de sels de platine, elle doit être utilisée avec précaution. En effet, la majorité des patients recevant de l'oxaliplatine développent des neuropathies périphériques. Cette neurodégénérescence est un facteur limitant de cette chimiothérapie puisqu'elle peut nécessiter une réduction du dosage ou même une interruption du traitement si cet effet secondaire atteint une sévérité de grade 3. Les toxicités neurologiques peuvent se manifester dans les heures suivant l'injection sous forme aiguë. La forme chronique résulte d'injections cumulées de doses élevées. La forme aiguë, caractérisée par une paresthésie transitoire et une myotonie, est réversible et se résout généralement en quelques jours tandis que la forme chronique présente une paresthésie et une thermoalgie persistantes résultant de la dégradation axonale distale et de la démyélinisation des fibres nerveuses de gros diamètre. Les voies inflammatoires ont été incriminées dans l'étiologie de cette neurodégénérescence. Le niclosamide, un ténicide modulant les voies Stat3, Wnt, Notch et Beta-caténine, a été étudié in vitro et in vivo. Ayant déjà démontré les propriétés anti-inflammatoires de ce composé dans la sclérodermie systémique, nous avons cherché à déterminer si le niclosamide pourrait également prévenir la neurotoxicité de l'oxaliplatine. Le niclosamide a démontré une neuroprotection à la fois in vitro sur les neurones traités par l'oxaliplatine et in vivo dans les modèles de neuropathies périphériques induites par l'oxaliplatine. Le niclosamide est déjà utilisé en clinique avec des effets secondaires limités. L'association de cette molécule avec l'oxaliplatine pourrait augmenter l'indice thérapeutique de cette chimiothérapie. La benztropine est un inhibiteur des récepteurs muscariniques M1 et M3 possédant un potentiel de remyélinisation démontré dans le système nerveux central en favorisant la différenciation et la prolifération des cellules précurseurs des oligodendrocytes. La répartition différentielle entre les sous-types de récepteurs peut permettre le ciblage spécifique des cellules tumorales, notamment par l'inhibition de la signalisation autocrine de l'acétylcholine. La benztropine est un composé bien toléré qui ne provoque aucune réaction immunologique lors de son administration. Cette molécule présente un effet neuroprotecteur in vitro sur les neurones traités par l'oxaliplatine au cours d’études de viabilité cellulaire ainsi qu’in vivo dans les modèles murins de neuropathies périphériques induites par l'oxaliplatine et le diabète. L'association de cette molécule avec l'oxaliplatine pourrait augmenter l'indice thérapeutique de cette chimiothérapie, en potentialisant ses effets antitumoraux tout en diminuant la neurotoxicité. L’ubiquité des propriétés neuroprotectrices de la benztropine a été démontrée sur des neuropathies périphériques résultants d’autres étiologies. Nous avons ici décrit deux molécules permettant de conserver l’efficacité antitumorale du traitement par oxaliplatine tout en limitant ses effets neurotoxiques. Nous avons décrit les mécanismes par lesquels ces molécules exercent leur neuroprotection. Les résultats prometteurs obtenus au cours de ces travaux permettent d’envisager l’utilisation en clinique de ces molécules afin de prévenir non seulement les neuropathies périphériques induites par l'oxaliplatine, mais aussi les neuropathies périphériques résultant d'autres étiologies. / Platinum-based chemotherapies have been shown to elicit their anti-tumoral effects by compromising DNA integrity. These impairments ultimately lead to a burst in oxidative stress which in turn promotes cell death processes. Oxaliplatin, a platinum-based antineoplastic drug is usually indicated in secondary metastatic colon cancers and colorectal cancers and mediates a rise in reactive oxygen species through the depletion of reduced glutathione in cancerous cells. This chemotherapy is indicated as a frontline and an adjuvant treatment and similarly to other platinum-based chemotherapies, it warrants for particular caution. Most patients receiving oxaliplatin develop peripheral neuropathies. This neurodegeneration is a limiting factor of this chemotherapy since it may require the lowering of dosage or even the interruption of the treatment if this side-effect is assessed as a grade 3 peripheral neuropathy. Neurological toxicities may manifest within hours of injection as an acute form or as a chronic form resulting from cumulated high-dosage injections. The acute form, characterized by transient paresthesia and myotonia, is reversible and usually resolves within days while the chronic form presents persistent paresthesia and thermoalgia resulting from distal axonal degradation and demyelination of large fibers. Inflammatory pathways have also been incriminated in the etiology of this neurodegeneration. Niclosamide, a teniacide known to downregulate Stat3, Wnt, Notch and Beta-catenin pathways was investigated in vitro and in vivo. Having previously demonstrated this compound’s anti-inflammatory properties in systemic sclerosis, we sought to investigate whether niclosamide could also prevent oxaliplatin’s neurotoxicity. Niclosamide demonstrated neuroprotection both in vitro on oxaliplatin-treated neurons and in vivo in models of oxaliplatin-induced peripheral neuropathies. Niclosamide is used in humans with limited side-effects. The association of this molecule with oxaliplatin could increase the therapeutic index of this chemotherapy. Benztropine is an inhibitor of muscarinic M1 and M3 receptors with known remyelinating potential in the central nervous system by promoting oligodendrocytes precursor cells differentiation and proliferation. The differential distribution between subtypes of receptors can allow the specific targeting of tumor cells, namely through the inhibition of autocrine acetylcholine signaling. This compound is well tolerated and does not elicit any immunological reaction upon its administration. These observations of potential for both, preventing neurotoxicity as well as increasing the efficacy profile of neurotoxic chemotherapies, prompted us to investigate this M1 and M3 receptors inhibitor. Benztropine demonstrated neuroprotection in vitro on oxaliplatin-treated neurons as demonstrated by viability assays studies as well as in vivo in models of oxaliplatin-induced as well as diabetic peripheral neuropathies. The association of this molecule with oxaliplatin could increase the therapeutic index of this chemotherapy, potentiate this chemotherapy’s antitumoral effects against certain cancers as well as decrease the occurrence of diabetic neuropathies, a prevalent complication of diabetes. We have herein described two molecules which allow oxaliplatin treatment to exert its cytotoxic effects without eliciting its neurotoxicity. Furthermore, we have described the mechanisms by which these molecules exert their neuroprotection. The neuroprotective abilities of one of these molecules have also been broadened by the study of other types of peripheral neuropathies, namely diabetic neuropathies. The promising results obtained over the course of these works allow for optimism in the prospect of finding therapies to counteract not only oxaliplatin-induced peripheral neuropathies but peripheral neuropathies resulting from other etiologies.

La Chimiothérapie IntraPéritonnéale (CIP) est utilisée couramment pour traiter le cancer colorectal métastatique. Cependant il n'existe pas de protocole standardisé.Le but de ce projet a été de modéliser cette chimiothérapie in vitro et de comprendre le rôle de l'hypotonie dans ce modèle et son impact sur la mort des cellules cancéreuses.Nous avons déterminé les conditions optimales de traitement sur les cellules cancéreuses coliques humaines HCT116 à savoir une exposition des cellules pendant 30 minutes à 400µM d'oxaliplatine en conditions hypotoniques (G2.5%) à 37°C. Ces résultats ont été validés sur différentes lignées cancéreuses coliques humaines et murine. Nous avons également montré que ces conditions de traitements étaient également capables d’augmenter la cytotoxixité d’autres dérivés du platine comme le cisplatine et le carboplatine.La mort cellulaire induite par ce traitement en hypotonie est de type apoptotique, Et peut s’expliquer par une augmentation de l’incorporation intracellulaire d'oxaliplatine, en partie due à l'activation et à la trimérisation du transporteur du cuivre CTR1.Le traitement par l'oxaliplatine et le cisplatine (mais pas par le carboplatine) en hypotonie entraine également les stigmates de la mort immunogène, à savoir l'exposition de la calréticuline à la membrane, la libération d'ATP et le relargage d'HMGB1, suggérant que l'hypotonie permettrait d'entrainer la mort immunogène et une réponse du système immunitaire lors de cette modélisation de CIP.Enfin, in vivo nous avons pu mettre en évidence que le traitement de métastases intrapéritonéales de souris Balb/c par une injection intrapéritonéale d'oxaliplatine en hypotonie permettait un ralentissement de l’apparition de nodules tumoraux et une augmentation de la survie des souris.Ainsi, nous avons pu mettre en évidence dans ce travail que l'hypotonie est un des paramètres fondamentaux de la CIP et suggère que son utilisation pourrait permettre d'augmenter l’efficacité de la CIP et de prolonger la survie des patients. / IntraPeritoneal Chemotherapy (IPEC) is commonly used to treat colorectal cancer metastases. However there is no standardized protocol.The aim of this work was to model this chemotherapy in vitro and to understand the role of hypotonic conditions in this model and its impact on cell death.We determined that the optimal treatment parameters on HCT116 human colon cancer cells, were an exposure of the cells for 30 minutes to 400μM of oxaliplatin under hypotonic conditions (G2.5%) at 37 °C. These results have been validated on various human and murine colic cancer cell lines. We have also shown that these treatment conditions are also able to increase the cytotoxicity of other platinum derivatives such as cisplatin and carboplatin.The cell death induced by this treatment in hypotonia is apoptosis, and can be explained by an increase in the intracellular incorporation of oxaliplatin, partly due to the activation and trimerization of the CTR1 copper transporter.Treatment with oxaliplatin and cisplatin (but not carboplatin) in hypotonia also leads to the stigmata of immunogenic death, e.i. exposure of calreticulin at the membrane, release of ATP and HMGB1 in the supernatant, suggesting that hypotonia would entail immunogenic death and an immune system response during this IPEC modeling.Finally, we have been able to demonstrate in vivo that the treatment of intraperitoneal metastases of Balb/c mice by an intraperitoneal injection of oxaliplatin in hypotonia slowed down tumor nodules appearance and increased survival of the mice.Thus, in this work we highlighted that hypotonia is one of the fundamental parameters of IPEC which suggests that its use could make it possible to increase the efficacy of IPEC and maybe to prolong the survival of patients.

L'oxaliplatine est un médicament de référence dans les traitements des cancers colorectaux métastatiques. Toutefois, l'oxaliplatine occasionne une toxicité d'ordre neurologique qui retentit sur la qualité de vie de certains patients prédisposés. Nous avons analysé pour la première fois la neurotoxicité de l'oxaliplatine par une approche protéomique. Un protocole expérimental, associant marquage iTRAQ et fractionnement par IEFOFFGEL a tout d'abord été mis en place afin d'améliorer la couverture protéomique d'échantillons complexes. Puis, l'expression protéique différentielle après traitement par I'oxaliplatine a été analysée globalement, à la fois dans le protéome intracellulaire et dans le sécrétome d'un modèle cellulaire humain de nerotoxicité. L'analyse du protéome intracellulaire a permis l'identification de plus de 2700 protéines et offre de nouvelles perspectives quant aux mécanismes moléculaires de la neurotoxicité de I ' o x aliplatine. Le médicament aItère l'expression de protéines impliquées dans la réponse aux dommages à l'ADN, le contrôle du cycle cellulaire, le stress oxydatif , le métabolisme énergétique, le stress protéotoxique, la résistance multidrogue, la plasticité neuronale et l'homéostasie calcique. L'analyse du sécrétome a mis en évidence la sur-expression, suite au traitement par l'oxaliplatine, de 23 protéines sécrétées. Nous proposons pour la première fois les protéines Calmoduline, Thymosine beta-10 et le facteur neurotrophique Neudésine comme candidats biomarqueurs de la neurotoxicité des traitements anticancéreux à base d'oxaliplatine.

Le cancer colorectal représente un défi thérapeutique compte tenu de sa fréquence (38 000 nouveaux cas annuels dans notre pays), et de sa gravité (moins de 10 % de survie à 5 ans en situation métastatique). Sa prise en charge adéquate est avant tout multidisciplinaire associant les nouvelles techniques de chirurgie et de radiologie à la chimiothérapie. Celle-ci est représentée par trois cytotoxiques majeurs : le 5-Fluorouracile, pierre angulaire du traitement, l'oxaliplatine (L-OHP) et enfin l'irinotecan (CPT-11), auxquels se sont ajoutées ces dernières années les biothérapies ciblant le facteur angiogénique VEGF (bevacizumab) ou le récepteur épithélial de surface EGFR (cetuximab, panitumumab). Notre travail de Thèse d'Université a cherché à explorer, chez des patients atteints d'un cancer colorectal métastatique, le retentissement sur les taux de réponses, les survies et les toxicités, de génotypes enzymatiques impliqués dans les métabolismes des trois cytotoxiques principalement utilisés dans cette indication. Nos études translationnelles montrent l'optimisation des traitements à base de 5-FU par l'approche pharmacocinétique associée au dépistage préthérapeutique d'une population à haut risque de toxicité (DPYD mutés et/ou rapport UH2/U abaissé). Par ailleurs apparaissent de mauvais pronostic sur la survie globale et en cas de monochimiothérapie par 5-FU, les patients 3R/3R pour TYMS et homozygote sauvage pour MTHFR 1298 A>C ou 677 C>T, facteurs de risques génotypiques disparaissant avec l'adjonction de CPT-11. Concernant ce dernier, un schéma de traitement adapté au statut UGT 1A1, et combiné au cetuximab, aboutit à des taux de maladie contrôlée et de survie sans progression inégalés en deuxième ligne de traitement. Enfin, les patients homozygotes T/T pour ERCC1 118 C>T et C/C XPD 751 A>C apparaissent à risque de neurotoxicité chroniques à l'oxaliplatine. Considérant le génome tumoral, outre Kras et Braf, PI3KCA muté apparaît pour la première fois comme un facteur possible de résistance aux traitements anti-EGFR. En conclusion, la prise en compte des facteurs pharmacogénétiques et pharmacogénomiques devrait permettre à l'avenir une meilleure rationalisation des traitements de chimiothérapies en optimisant leurs efficacités tout en limitant leurs toxicités.

Le cancer colorectal est un cancer majeur en termes de fréquence et de mortalité. Il s’agit de la deuxième cause de décès par cancer, avec 17 500 décès en France en 2011. Le traitement des stades avancés repose sur différentes molécules anti-cancéreuses telles que l’oxaliplatine. Cependant le développement de résistances entraine des échecs thérapeutiques expliquant le faible taux de survie observé. Il est donc crucial d’identifier les mécanismes de résistance et ses acteurs et de découvrir de nouvelles pistes de traitements.Dans un premier temps, nous nous sommes donc intéressés aux rôles joués par les calpaïnes et NOX1 dans le développement de la résistance à l’oxaliplatine en étudiant des cellules tumorales colorectales résistantes à cette drogue. Ce qui nous a permis d'identifier une voie de signalisation impliquée dans la résistance à cette chimiothérapie.Dans un second temps nous nous sommes intéressés à étudier la réversion de cette résistance à l’oxaliplatine. En criblant différentes chimiothérapies ce qui a permis de mettre en évidence une inversion du statut résistant/sensible dans nos cellules sélectionnées.La première partie de nos données met en évidence de nouvelles régulations de Nox1 qui diffèrent en fonction de la sensibilité des cellules à l’oxaliplatine. Nos résultats montrent aussi que p38 MAPK pourrait être une cible thérapeutique de choix. Dans la deuxième partie nous avons identifié un nouveau traitement permettant l'induction de l'apoptose dans nos cellules résistantes. Ainsi la gemcitabine pourrait être une solution pour traiter les patients ne répondant pas ou plus aux protocoles basés sur l’oxaliplatine / Colorectal cancer is a major cancer in terms of frequency and mortality. This is the second leading cause of cancer death, with 17,500 deaths in France in 2011. The treatment of advanced stages is based on different chemotherapeuties including oxaliplatin. However, the development of resistance leads to therapeutic failures explaining the low survival rate. It is therefore crucial to identify the mechanisms of resistance and the actors involved and to discover new therapeutic approaches. We first investigated the role played by calpains and NOX1 in the development of resistance to oxaliplatin, studying oxaliplatin-resistant colorectal tumor cells. This allowed us to identify a signaling pathway involved in resistance to this chemotherapy.Secondly, we have studied the reversion of this resistance to oxaliplatin. A screening of different chemotherapies revealed a reversal of the resistant / sensitive status in our selected cells In the first part, our data highlight novel Nox1 regulations which differ according to the sensitivity of the cells to oxaliplatin. Our results also show that p38 MAPK could be a therapeutic target for treating colorectal cancers resistant to oxaliplatin. In the second part, we have identified a new treatment to induce apoptosis in our resistant cells. Indeed, gemcitabine may be a solution to treat patients who do not respond to oxaliplatin-based protocols.