Th.--Méd.--Reims, 1981. N°: 44.

Le locus CDKN2A/B contient le gène codant le suppresseur de tumeur p16INK4a. Des études d’association de gènes ont identifiées que le locus CDN2A/B est associé à un risque de développement de maladies inflammatoires, dans lesquelles les macrophages jouent un rôle important. Les macrophages constituent une population cellulaire hétérogène dont la forme d’activation et les fonctions sont déterminées par les signaux environnants. Les cytokines Th1, tel que l’interféron gamma, et les antigènes bactériens, tel que le lipopolysaccharide, induisent une activation classique ou M1 des macrophages alors que les cytokines Th2, telles que les interleukines 4 et 13, induisent une activation alternative ou M2 des macrophages. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués dans l’acquisition de ces phénotypes sont encore mal connus. Cette étude montre que l’absence d’expression de p16INK4a (p16-/-) inhibe la réponse inflammatoire et favorise l’activation alternative des macrophages primaires murins in vitro. Afin de déterminer la relevance de ces observations in vivo, la fonction de p16INK4a dans les macrophages a été étudiée chez la souris lors d’une infection parasitaire, dans laquelle le rôle des macrophages alternatifs est connu, puis au cours du développement de l’athérosclérose dans lequel le rôle des macrophages alternatifs reste à déterminer, en utilisant la transplantation de moelle osseuse. Les souris transplantées avec de la moelle osseuse p16-/- présentent une induction de l’expression génique des marqueurs de macrophages alternatifs dans le foie après infection parasitaire, démontrant que p16INK4a influence l’activation des macrophages in vivo. Cependant, l’absence de p16INK4a dans les cellules hématopoïétiques n’influence pas le développement de l’athérosclérose dans nos conditions expérimentales. Enfin, l’invalidation de l’expression de p16INK4a par ARN interférence dans les macrophages primaires humains et la mesure d’expression de p16INK4a dans les macrophages isolés du tissu adipeux de patient obèses montrent que l’absence de p16INK4a favorise un phénotype alternatif des macrophages proche de celui des macrophages du tissu adipeux. Ces travaux de recherche identifient p16INK4a comme modulateur de l’activation des macrophages murins et humains. Mots clés : CDKI-activation alternative-inflammation-infection parasitaire-athérosclérose-obésité. / The CDKN2A/B locus, which contains the tumor suppressor gene p16INK4a, is associated with an increased risk of age-related inflammatory diseases, such as cardiovascular disease and type 2 diabetes, in which macrophages play a crucial role. Activation state and functions of macrophages are profoundly affected by environmental cytokines and microbial products. Indeed, Th1 cytokines, such as interferon gamma, and lipopolysaccharide induce a classical activation phenotype whereas Th2 cytokines, such as inteleukins 4 and 13, induce an alternative activation phenotype. However, the molecular mechanisms underlying the acquisition of these phenotypes are not well defined. In this study, we show that p16INK4a-deficiency (p16-/-) skews murine macrophages towards an alternative activation in vitro. The influence of p16INK4a-deficiency on macrophage activation in vivo was investigated using bone marrow transplantation, first in a parasite infectious model in which the role of alternatively activated macrophages is well characterized, then during atherosclerosis development, in which the role of alternatively activated macrophages is undefined. While mice transplanted with p16-/- bone marrow displayed higher hepatic marker expression levels of alternative activation upon parasite infection, no effect was observed on atherosclerosis development in our experimental conditions. Finally, confirming the data obtained in p16-/- macrophages, silencing of p16INK4a with siRNA in human blood-monocyte-derived macrophages also resulted in the induction of alternative activation. In addition, analysis of human adipose tissue macrophages from obese patients, which are typically alternatively activated, showed that p16ink4a expression levels were lower in ATM than in monocyte-derived macrophages of the same subjects. These findings identify a novel role for the tumor suppressor p16INK4a as modulator of murine and human macrophage activation. Keywords: CDKI-alternative activation-inflammation-parasite infectious-atherosclerosis-obesity.

Les nucléotides, et tout particulièrement l’ATP, sont capables de moduler la fonction de l’un des principaux acteurs de la réponse immunitaire à savoir les cellules dendritiques (DC). Les DC expriment à leur surface de nombreux récepteurs P2X et P2Y dont le P2Y11, couplé à la voie de l’AMP cyclique (AMPc) et impliqué dans l’immunomodulation. L’ATP est capable, par son action sur le P2Y11, d’induire une semi-maturation des DC caractérisée entre autre par une diminution de la sécrétion d’IL-12 et une augmentation de la sécrétion d’IL-10. De plus, des données antérieures obtenues au laboratoire montrent que l’ATP confère également des propriétés immunosuppressives aux DC en stimulant l’expression de la thrombospondine-1 (TSP-1) et de l’indoléamine-2,3-dioxygénase (IDO). Dans ce contexte, notre projet visait à établir un profil d’expression génique en réponse à l’ATP dans des DC humaines issues de monocytes (MoDC) afin d’avoir une vue globale de l’action de l’ATP sur les DC. Dans un premier temps, nous avons donc réalisé une étude cinétique comparant les profils d’expression génique en réponse à l’ATPγS, un agoniste plus stable que l’ATP, et à la prostaglandine E2 (PGE2), un activateur de l’AMPc induisant une semi-maturation des DC, par la technique de microarray. L’analyse de ces profils a mis en évidence une action précoce et large de l’ATPγS sur les MoDC. Un grand nombre de régulations obtenues ont confirmé les effets déjà connus de l’ATP sur les DC. Par ailleurs, nous avons confirmé par différentes techniques plusieurs nouvelles cibles de l’ATP impliquées dans l’inflammation et la réponse immunitaire (ex. CSF-1, NRP-1, VEGF). En analysant plus en détail ces profils, nous avons observés la régulation de plusieurs gènes dont VEGF, AREG, EREG et HB-EGF, intervenant dans les processus d’angiogenèse et de tumorigenèse. Parmi ceux-ci, le gène AREG codant pour l’amphiréguline, un ligand de l’EGF récepteur (EGFR) était le gène le plus régulé dans notre profil microarray. Pour la première fois, nous avons démontré que les DC traitées à l’ATPγS en présence de LPS constituaient une importante source d’amphiréguline capable de stimuler la croissance de cellules musculaires lisses et de cellules tumorales LLC (Lewis Lung Carcinoma) in vitro. Parallèlement, nous avons étudié l’implication des cellules dendritiques traitées à l’ATPγS sur la croissance tumorale in vivo. Pour ce faire, nous avons coinjecté, à des souris C57 black/6, des cellules tumorales LLC avec des surnageants issus de BMDC traitées au LPS ou au LPS+ATPγS. De cette façon, nous avons mis en évidence que des surnageants issus de BMDC traitées au LPS+ATPγS induisaient une augmentation significative de la masse tumorale par rapport aux surnageants issus de BMDC traités au LPS seul. Au moyen d’un anticorps bloquant anti-amphiréguline, nous avons démontré que cette augmentation de la masse tumorale était due à l’importante sécrétion d’amphiréguline par les BMDC traitées au LPS+ATPγS. De plus, nous avons observé une augmentation du nombre de vaisseaux positifs pour l’α-SMA, un des marqueurs des cellules musculaires lisses, dans les tumeurs issues de la coinjection de cellules LLC avec des surnageants de BMDC traitées au LPS+ATPγS. Pour finir, nous avons montré que les DC au sein des tumeurs LLC expriment non seulement le récepteur EGFR mais également l’amphiréguline. Ces différents résultats observés mettent en avant l’importance de l’ATP extracellulaire dans la croissance tumorale par son action sur les DC.

Parmi les composés pharmacologiques à moindres risques pouvant inhiber la prolifération de cellules tumorales, une faible proportion présentent un potentiel prometteur d'utilisation comme agent anti-cancéreux. Or, plusieurs études récentes réalisées majoritairement in vitro ont montré que la curcumine, la composante active du cari, présentait des propriétés chimiopréventives et anti-tumorales intéressantes. Nous avons donc évalué la curcumine comme agent anti-cancéreux dans le traitement de gliomes in vitro et in vivo. Le potentiel d'utilisation de la curcumine a d'abord été estimé sur une lignée de glioblastome en culture (U87) par des essais de prolifération. Ces essais ont permis de déterminer la concentration qui inhibait 50% de la prolifération cellulaire (IC5O), soit 11,6 µM pour ce composé. L'efficacité anti-cancéreuse de la curcumine a ensuite été démontrée in vivo en traitant des souris athymiques ayant subi des implantations sous-cutanées et intracrâniennes de U87. L'impact du traitement (60 mg/kg/jour et 120 mg/kg/jour respectivement) sur la croissance tumorale (taille des tumeurs) et la survie des animaux a été estimé. Les résultats ont montré que la curcumine exerce un effet anti-cancéreux sur les tumeurs sous-cutanées, provoquant un ralentissement significatif de la croissance tumorale. De plus, un accroissement du temps de survie moyen a été observé chez les souris traitées ayant subi une implantation intracrânienne de cellules cancéreuses. Cette action anti-tumorale de la curcumine serait potentiellement due à un effet anti-angiogénique. D'une part, une inhibition de la prolifération, de la migration et de la tubulogenèse a été observée sur une lignée de cellules endothéliales cérébrales ayant été traitée avec la curcumine. D'autre part, les résultats ont montré une inhibition de l'activation de métalloprotéases de la matrice, des enzymes importantes pour la croissance tumorale, chez les souris ayant reçu de la curcumine. De plus, le dosage du contenu en hémoglobine dans les tumeurs, qui permet de quantifier le niveau de prolifération des vaisseaux sanguins, a montré que les tumeurs sous-cutanées des souris ayant reçu de la curcumine avaient une concentration d'hémoglobine moindre que les tumeurs provenant des souris non-traitées. Par ailleurs, nos études ont aussi démontré que le passage de la curcumine au travers la barrière hémato-encéphalique est très élevé. Ces résultats suggèrent que la curcumine possède des propriétés anti-cancéreuses intéressantes sur les glioblastomes et peut être considéré comme un agent dans la prévention et le traitement des tumeurs cérébrales. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Curcumine, Gliome, Anti-tumorale, Anti-angiogénique, Barrière hématoencéphalique.

Thèse d'exercice : Médecine. Pédiatrie : Université de Nantes : 2005. / Bibliogr. f. 63-68 [67 réf.].

Th. 3e cycle--Biol. moléculaire et cell.--Toulouse 3, 1982. N°: 2634.

Le sujet des travaux de recherche effectués au cours de mon doctorat consiste à contourner la difficulté liée au seuillage utilisé pour visualiser les images obtenues en tomographie par émission de positrons (TEP), de manière à obtenir des images tumorales plus précises qui par la suite pourraient être utilisées en radiothérapie. Pour cela, nous avons proposé de mettre à profit la simulation Monte Carlo que nous avions développée pour décrire le transport d’électrons et de particules lourdes chargées dans l’eau. Lors de cette étude, nous avons donc cherché à décrire dans les détails les plus fins (à l’échelle de la cellule) les dépôts d’énergie induits par le positron dans la matière biologique, et ce à partir de la simulation Monte Carlo de suivi de trace que nous avons déjà mise au point pour les électrons et les ions et qui a été modifiée pour décrire le suivi des positrons, notamment par la prise en compte du processus de capture qui vient d’être récemment calculé par notre équipe. L’intérêt de ce travail est multiple. D’une part, il permet de mesurer les risques encourus par le patient soumis à une irradiation +, ce qui est le cas lors d’examens médicaux comme la Tomographie par Emission de Positrons. D’autre part, la simulation numérique de transport de positrons dans la matière biologique, couplée à une simulation de suivi de photons dans l’eau, a permis d’appréhender avec précision la détection des photons après annihilation des positroniums (paires électron-positron formées lors du ralentissement du positron dans la matière). Une modélisation simple des paramètres géométriques et physiques de l’appareil de détection nous a ainsi permis de quantifier le nombre d’événements de chaque type détectés sur l’anneau à savoir le nombre de paires de photons dits diffusés, fortuits et vrais. A partir de ces données, il nous est alors possible de construire un sinogramme nous permettant la reconstruction d’images TEP. / The subject of my PhD work is to outline the problem linked to threshold used to visualize PET images, in order to obtain more accurate tumoral volumes which could be treated more efficiently in radiotherapy. To do that, we have proposed to use the Monte Carlo code we have already developed to study the following-up of electrons and ions in water. During this PhD study, we have also tried to describe with the best accuracy (at a cellular scale) the deposited energy induced by positrons in the biological matter thanks to the Monte Carlo simulation previously cited that we have adapted to describe the following-up of positrons, especially in adding the capture process which has recently been calculated by our team. In one hand, the goal of this work is to measure the risks taken by the patient during a medical exam (such as a PET acquisition). In another hand, the simulation of the following-up of positrons in the biological matter coupled to the simulation of the following-up of photons in water, has allowed the detection of photons after the Positronium (electron-positron pair formed during the positron slowing-down in the matter) annihilation. Then a simple modelling of the geometrical and physical parameters of the medical device has allowed a quantification of the number of events detected on the ring. More precisely, we have access to the number of true, scattered and random pairs. Thanks to these data, we are thus able to reconstruct a sinogram as well as the initial radiative volume. Then a comparison with some experimental results gives access to a semi-empirical relation between the volume and the threshlod.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Th. 3e cycle--Pharm.--Paris 5, 1981. N°: 17.

Il est maintenant admis que l’activité anti-tumorale du TNF implique une destruction de la vascularisation de la tumeur par induction d’apoptose des cellules endothéliales. Si le traitement au TNF en thérapie humaine permet des rémissions complètes, il n’est applicable qu’aux membres isolés de la circulation systémique car les doses requises de TNF sont létales pour le patient. Mettre en évidence les mécanismes qui contrôlent l’apoptose de la cellule endothéliale devrait permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques favorisant l’effet thérapeutique du TNF tout en évitant le choc septique qu’il engendre. Nous avons abordé cette question en utilisant le modèle de la cellule endothéliale d’aorte bovine (BAEC) stimulée au TNF afin d’étudier les mécanismes qui contrôlent le processus apoptotique et ce au cours des phases précoces de celui-ci. D’une part, nous avons identifié par une approche pharmacologique au moins trois voies de contrôle négatif d’induction de mort cellulaire par le TNF dans les cellules endothéliales : la première faisant intervenir une des protéines kinases C, une seconde la PI3-kinase et une troisième la protéine kinase p38. Cette dernière semble spécifiquement activée par le TNF et pourrait donc constituer une nouvelle cible pharmacologique visant à sensibiliser les cellules endothéliales de la vascularisation de la tumeur à l’action apoptotique du TNF. D’autre part nous avons mis en évidence et identifié par une approche protéomique au moins deux protéines montrant une rapide diminution de phosphorylation lorsque les cellules endothéliales sont stimulées par le TNF en présence de cycloheximide. Ces deux événements semblent en aval de l’activation d’une protéase de la famille des caspases. La première protéine est la sous-unité régulatrice de type II alpha (RIIα) de la protéine kinase A. Cependant, la relation entre cette déphosphorylation et le processus d’apoptose n’a pas pu être mise en évidence, une stimulation de l’activité PKA n’affectant pas l’induction d’apoptose des BAEC. La seconde est la protéine HDGF, connue pour être sur-exprimée dans certains cancers, mais dont la régulation par phosphorylation ainsi que son implication éventuelle lors du processus apoptotique n’avaient encore jamais été envisagées. Enfin, nous avons voulu mettre en évidence le rôle potentiel de la protéine hnRNP K qui subit une modification post-traductionnelle précoce lors de l’apoptose des BAEC. Notre étude, menée après surexpression de la protéine étiquetée, suggère une modification autre qu’une dégradation. Cependant, il ne nous a pas été permis de lui attribuer un rôle puisque la surexpression de cette protéine n’affecte pas l’apparition de différents marqueurs associés à l’apoptose.