Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le RadLV/VL₃ clone V-13 est un rétrovirus murin thymotrope, non défectif, fortement leucémogène et écotrope. Il induit des lymphomes des cellules T en s'intégrant dans le génome de l'hôte. Le virus peut causer une tumeur en modifiant le fonctionnement des gènes près desquels il s'est intégré. Ces intégrations, si retrouvées au même endroit dans plus d'une tumeur, définissent un site commun d'intégration. Ce projet a pour but de trouver un ou des nouveaux sites d'intégration du rétrovirus RadLV/VL₃ clone V-13. Pour ce faire, un oligonucléotide de séquence connue, nommé splinkerette, a été utilisé. L'ADN d'une souris tumorale est coupée puis une splinkerette y est ligasée. Ceci permet d'amplifier, par des réactions de PCR, les régions flanquantes aux intégrations rétrovirales. Une fois clonées, les produits des PCR sont séquencés, permettant de situer les intégrations dans le génome de la souris, qui est disponible dans les banques de données. Il est ainsi possible de repérer les gènes à proximité de l'intégration rétrovirale. Certains gènes d'intérêt ont déjà été retrouvés grâce à cette technique pour d'autres rétrovirus. Dans le cas du RadLV/VL₃, parmi une vingtaine de tumeurs et environ 70 bandes analysées, les gènes Notch l, Rasgrp1, Rorc, Lef1, Gfi1, Ncor2, Scarb1, Lfng, Mad, Myb, Ahi1, Supt4h, Bzrap1, Sept9, Fos, Jundm2, Myc, Pim1, Ccnd3, Bcl211 et Gpc3 ont été trouvés. Plusieurs de ces oncogènes n'ont jamais été associés au rétrovirus RadLV/VL₃. Deux régions potentiellement oncogéniques sur les chromosomes 7 et 11 ont été identifiées. La compréhension du fonctionnement des oncogènes permettra d'empêcher leur expression aberrante, ou d'utiliser des rétrovirus comme vecteurs dans la thérapie génique afin de corriger l'expression de gènes mutés. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : ADN, Clonage, Leucémie, Oncogène, PCR, RadLV/VL₃, Rétrovirus, Séquençage, Site commun d'intégration, Sonde radioactive, Splinkerette, Tumeur.

Les rétrovirus murins peuvent causer une grande incidence de leucémies par le processus de mutagenèse insertionelle. L'intégration d'un rétrovirus au niveau du même locus dans plus d'une tumeur définit un site commun d'intégration (CIS). L'identification des nouveaux sites communs d'intégration rétrovirale s'avère un outil important pour identifier de nouveaux gènes pouvant être impliqués dans l'apparition primaire du cancer chez l'être humain. Nous avons adapté une nouvelle technique pour isoler rapidement des sites d'intégration rétrovirale. Cette technique, appelée PCR-splinkerette, permet de mettre en évidence un grand nombre de ces sites et de trouver des nouveaux gènes impliqués dans les leucémies murines causées par le rétrovirus Graffi 1.4. En utilisant cette méthode, il nous a été possible de situer plusieurs intégrations du rétrovirus dans le génome de la souris et de repérer les gènes à proximité de l'intégration, à l'aide de banques de données (ENSEMBL). Nous avons cloné et analysé les séquences de 63 sites d'intégration rétrovirale (RISs) à partir de 12 tumeurs composées par des lymphomes de cellules T, B, myéloïdes, érythrocytaires et mégacaryocytaires, induits par Graffi 1.4. Les gènes Notch1, Ras Grp1, Myc, Ptpn6, Gse1, Lmo2 et Evi1 et Prdm16 dont le rôle est déjà connu dans le cancer, ont été trouvés à proximité de ces sites. Trois régions susceptibles de posséder plus d'une intégration dans le même locus, ont été identifiées sur les chromosomes 17D, 14B, 4E1. Plusieurs gènes trouvés autour de ces régions n'ont pas été rapportés comme étant des oncogènes connus. Une analyse plus profonde de ces sites et des gènes dont l'expression est modifiée dans ces tumeurs permettrait de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement du cancer. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Rétrovirus, Rétrovirus Graffi 1.4, Leucémie, Mutagenèse insertionelle, Réaction en chaîne de la polymérase, Splinkerette, Oncogènes, Gènes suppresseurs de tumeurs.

Les adénomes hépatocellulaires (AHC) sont des tumeurs hépatiques bénignes rares se développant chez la femme jeune suite à la prise de contraceptifs oraux et pouvant se compliquer d’hémorragie et de transformation maligne en carcinome hépatocellulaire (CHC). Une classification génotype/phénotype a mise en évidence trois groupes d’AHC : les AHC inactivés pour le facteur de transcription HNF1A, les AHC mutés pour la β-caténine et les AHC dit « inflammatoires » ayant une activation de la voie JAK/STAT. Nous avons identifiés des mutations activatrices du gènes GNAS, codant pour la sous unité alpha de la protéine Gs, dans un sous-groupe d’AHC inflammatoires ainsi que chez des patients avec des AHC et atteints d’un syndrome de McCune Albright, une maladie rare combinant des tumeurs endocriniennes, une dysplasie fibreuse osseuse et des taches cutanés café au lait. Cette découverte confirme les interactions entre la voie de l’AMP cyclique induite par les mutations GNAS et la voie JAK/STAT. Les CHC sont les tumeurs primitives du foie les plus fréquentes, survenant souvent sur un foie cirrhotique exposé à différents facteurs de risque comme l’hépatite B chronique, l’hépatite C chronique, l’alcool ou le syndrome métabolique. Le CHC est le résultat de l’accumulation d’altérations génétiques et épigénétiques. Premièrement, nous avons identifiés les mutations du promoteur de TERT (Telomerase reverse transcriptase) comme les altérations génétiques somatiques les plus fréquentes des CHC. Ces mutations ont été aussi retrouvées dans des lésions prénéoplasiques développées sur cirrhose suggérant leurs rôles précoces dans l’initiation tumorale et la transformation maligne. A l’inverse l’étude des mutations du promoteur de TERT et la réalisation de séquençage haut-débit dans les AHC et les transformation d’adénome en CHC nous a permis de disséquer les mécanismes de transformation maligne sur foie sain avec la présence de manière précoce d’une mutation de la β-caténine et dans un second temps l’apparition d’une mutation dans le promoteur de TERT. Par la suite, nous avons mis en évidence une signature moléculaire pronostique transcriptomique chez les patients avec CHC traités par résection hépatique. Cette signature moléculaire prédisant à la fois la récidive tumorale et le décès a été validée dans des cohortes de patients à l’étranger. Enfin, nous avons mise en évidence le rôle oncogénique de l’adeno-associated virus de type 2 dans la survenue de CHC sur foie sain via un mécanisme de mutagénèse insertionnelle dans des gènes clés de la carcinogénèse comme TERT, CCNA2, MLL4 ou TNFSF10. Ces résultats ont permit de mettre en évidence de nouveaux facteurs de risque viraux de survenue du CHC, d’identifier de nouvelles altérations génétiques impliquées dans la transformation maligne sur cirrhose et sur foie sain et permit de développer une signature moléculaire pronostique qui pourrait être utiliser dans le futur comme une aide à la stratification thérapeutique chez les patients atteint de CHC. / Hepatocellular adenomas (HCA) are rare benign liver tumors occuring in young women taking oral contraception and complications as haemorrhage or malignant transformation in hepatocellular carcinomes (HCC) could occur. A genotype/phenotype classification has defined different subgroups of tumors : HCA with inactivating mutations of HNF1A, HCA with activating mutations of β-catenin and inflammatory HCA with activation of the JAK/STAT pathway. We have identified activation mutations of GNAS, that codes for the alpha subunit of the Gs protein in a subgroup of inflammatory HCA and in patients with HCA and McCune Albright syndrom, a rare disease that combined endocrine tumor, bone fibrous dysplasia and « cafe au lait » skin macula. These findings highlight the crosstalk between the cyclic AMP pathway induced by GNAS mutation with the JAK/STAT pathway. HCC are the most frequent primary liver tumors worldwide and mainly occur on cirrhosis due to various risk factor as hepatitis B and C virus, alcohol consumption and metabolic syndrome. HCC is due to the accumulation of genetic and epigenetic alterations in the malignant hepatocytes. We have identified TERT (telomerase reverse transcriptase) promoter mutations as the most frequent somatic genetic alterations in HCC. These mutations were also found in cirrhotic premalignant nodules underlying their role in tumor initiation and malignant transformation. In contrast, the study of the different steps of malignant transformation of HCA into HCC using next generation sequencing and TERT promoter screening have shown that activatiing mutation of β-catenin is an early genetic alteration whereas TERT promoter mutation is required in a second step to promote a full malignant transformation. We have also identified a prognostic molecular signature, the 5-gene score, in patients with HCC treated by liver resection. The 5-gene score predicts tumor recurrence and disease specific survival and has been validated in different cohorts of patients worldwide. Finally, we have shown that adeno-associated virus type 2 is involved in liver carcinogenesis on normal liver through insertional mutagenesis in key cancer genes as TERT, CCNA2, MLL4 and TNFSF10. These results have underlined a new oncogenic virus involved in HCC development, identified new genetic alterations involved in malignant transformation on cirrhosis and normal liver and a new prognostic molecular signature that will help to guide treatment of patients with HCC in the future.