La thérapie photodynamique (PDT) est basée sur l’action d’un photosensibilisateur qui en présence de la lumière et de l’oxygène induit la synthèse d’espèces réactives de l’oxygène, toxiques pour les cellules. La PDT a été utilisée pour le traitement et la prévention du cancer de la vessie. Les études ont été réalisées in vivo. La PDT a été développé en utilisant l’Hexvix® précurseur de la protoporphyrine IX (PpIX). Les paramètres biologiques liés à la PpIX et qui régissent l’efficacité du traitement photodynamique des tumeurs vésicales ont été déterminés en fonction de deux concentrations d’Hexvix® (8 et 16 mM) induisant des effets photodynamiques diamétralement opposés. L’efficacité du traitement photodynamique obtenue pour 8 mM d’Hexvix® est liée à la localisation mitochondriale de la PpIX induisant des dommages pro-apoptotiques. La PDT entraîne la diminution significative du pourcentage de l’implantation tumorale après la TUR et permet ainsi de prévenir les récidives du cancer de la vessie. / Photodynamic therapy (PDT) is a treatment modality based on the cytotoxic effect occurring on target tissues by interaction of a photosensitizer with light in the presence of oxygen. The aim of this study was to optimise PDT for treatment and prevention of recurrence of bladder cancer. The study was performed in vivo. PDT was performed with Hexvix® a precursor of the photosentitizer protoporphyrin IX (PpIX). First, we executed a mechanistic analysis of differential PDT effects according to Hexvix® concentration. 8 or 16 mM induced diametrically opposed photodynamic effects. PDT efficacy is depends on the mitochondrial localization of PpIX and its concentration and leads to pro-apoptotic damages. Second, PDT was performed in a rat model mimicking post fluorescence guided TUR. The amount of viable tumor cell within the bladder lumen significantly decreased with PDT and resulted in a significant reduction of tumor implantation

Nous avons récemment découvert que le gène Gas1 agit comme un suppresseur de métastases chez le mélanome. Ce gène pourrait être utilisé pour d’éventuelles thérapies contre la métastase. Afin de découvrir le mécanisme réprimant l’expression de Gas1 chez les cellules métastatiques, nous avons utilisé des ChIP, des inhibiteurs chimiques et des petits ARN interférents contre des molécules susceptibles de réprimer Gas1. Chez le mélanome métastatique murin B16-F10, nous avons observé plusieurs groupements méthyles sur l’îlot CpG du promoteur de Gas1, ainsi que la marque de répression H3K9me3 et l’absence de la polymérase II. Chez les cellules humaines C8161 et Lox-IMVI, nous avons découvert qu’il y avait une forte présence d’acétylation au niveau de l’histone 3 et de polymérase II. Par ailleurs, nous avons prouvé que c-MYC et BRD4 étaient impliqués dans la régulation de GAS1. Finalement, ces résultats pourront être utilisés pour développer d’éventuelles thérapies contre la métastase.

L’ordinateur est de plus en plus utilisé afin d’accomplir les tâches reliées au travail, et cela est d’autant plus vrai chez les femmes de 25 à 54 ans. Avec ce nouvel outil de travail viennent de nouvelles blessures musculosquelettiques dites occupationnelles, et les douleurs à la région cervico-scapulaire semblent tenir à elles seules une place prépondérante. Comme beaucoup de travailleurs canadiens remplissent une partie considérable de leurs fonctions à l’aide d’un ordinateur, il est dès lors essentiel de mieux comprendre ces blessures et de trouver des façons d’y remédier. Plusieurs théories ou modèles ont tenté d’expliquer les douleurs associées à ces blessures occupationnelles, de même que plusieurs formes d’interventions préventives ou thérapeutiques ont été évaluées. L’une de ces théories, nommée l’hypothèse des fibres Cendrillon, stipule que la durée de la sollicitation des fibres musculaires lentes serait tributaire des dommages qui leur sont infligés, plutôt que le niveau de force que le muscle aurait à déployer. Comme le travail à l’ordinateur implique une faible contraction musculaire de longue durée, l’hypothèse des fibres Cendrillon représente une base crédible pour tenter de trouver des interventions efficaces qui limiteront les douleurs cervico-scapulaires dans ce contexte. Pour pallier à ce problème, une intervention qui semble être prometteuse est l’introduction de pauses actives dans la séance de travail. Ces pauses auraient pour effet d’augmenter la variabilité de l’activation des fibres Cendrillon afin d’éviter leur surutilisation. À ce jour, les recherches ayant porté sur ce sujet suivaient une méthodologie peu réaliste pour appliquer l’intervention en milieu réel. De plus, les tâches de travail à l’ordinateur n’étaient que de très courte durée, ce qui est peu représentatif d’une vraie journée de travail. L’objectif de cette étude était d’évaluer l’impact des pauses actives dans un contexte se rapprochant davantage de la réalité. Nous avons comparé une séance de travail à l’ordinateur sans pause avec une séance comprenant des pauses actives, et ce au niveau de la variabilité d’activation musculaire et du "4 degrés de douleur ressentie par les sujets. Nos hypothèses étaient: 1) la tâche avec des pauses actives comprenant un mouvement dynamique d’abduction des bras créera d’avantage de variabilité au sein du trapèze comparé à une séance de travail sans pause, 2) l’inconfort sera inférieur lors de la tâche comprenant les pauses actives comparées à la tâche sans pause. Nos sujets étaient 15 femmes droitières âgées de 20 à 35 ans. L’activité myographique des trapèzes droit et gauche était mesurée dans les divisions supérieures, transverses et inférieures. Les données ont été recueillies à l’aide d’un système d’EMG de surface Bagnoli-16 (Delsys Inc., Wellesley, MA, USA). Le niveau de douleur ressenti par les sujets était également mesuré à l’aide d’une échelle visuelle analogue. La tâche consistait à corriger un texte à l’aide de la souris tenue dans la main droite pendant une période de 90 minutes. Une séance avait lieu en continu, alors que l’autre séance incluait des pauses actives aux 15 minutes, consistant en une abduction dynamique des bras avec des poids de 1 kg dans chaque main. Aucune différence significative n’a été retrouvée au niveau de la douleur entre les deux types de séance. La division transverse du trapèze gauche (côté non utilisé) fut la seule à voir sa variabilité augmenter, et ce avec des classes de durées plus courtes (p < 0,05). Les pauses actives n’ont pas réussi à créer un changement dans la variabilité du trapèze supérieur, cette division étant normalement la principale visée par les douleurs. Dans le même sens, elles n’ont pas réussi à diminuer l’inconfort des sujets. Cependant, il y avait si peu de douleur chez les sujets qu’une différence significative à ce niveau était difficile à obtenir. Cette étude ne supporte pas pour l’instant le bénéfice que pourrait avoir l’implantation de pauses actives dynamique de faible intensité chez les travailleurs à l’ordinateur. Les résultats de notre étude ne supportent que partiellement notre hypothèse et ne vont que partiellement dans la même direction que la littérature. Le protocole utilisé n’a pas réussi à susciter une douleur considérable chez les sujets. Avec un protocole suscitant davantage de douleur, il est de mise de considérer que cette même intervention pourrait peut-être avoir un impact sur la variabilité du trapèze et le niveau de douleur. De la même manière, un protocole créant un certain stress chez les sujets pourrait modifier l’impact de l’intervention. D’autres études sont recommandées à cet effet.

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

Titre de l'écran-titre (visionné le 31 juillet 2023) / Depuis 2019, un nouvel outil biologique a le potentiel de faciliter le champ d'application du système CRISPR-Cas9. Le Prime editing utilise un pegRNA (prime editing guide RNA) et une protéine fusionnée (SpCas9n-RT) comprenant une transcriptase inverse (un synthétiseur de brin) et une SpCas9n (un coupeur de brin) pour éditer le génome sans nécessiter une cassure double de l'ADN. La protéine SpCas9n-RT reconnaît une séquence d'amarrage spécifique PAM (Protospacer Adjacent Motif) et le pegRNA, une séquence précise de 20 nucléotides qui peut être modifiée selon un modèle prédéterminé. Cette technologie semble être un candidat idéal pour de futures thérapies géniques visant les mutations ponctuelles en raison de sa capacité à corriger spécifiquement les mutations ponctuelles souhaitées tout en diminuant les mutations hors cibles en raison des étapes supplémentaires requises lors de l'édition. Dans un premier temps, la première partie de ce mémoire vise principalement à démontrer que le Prime editing est une avenue thérapeutique intéressante pour la dystrophie musculaire de Duchenne, soit en modifiant directement le gène de la dystrophine. Les expériences ont été réalisées sur des cellules HEK293T, puis sur des modèles murins. Nous avons déterminé que le gène de la dystrophine est facilement modifiable, et ce, efficacement sur des cellules HEK293T avec le Prime editing optimisé. La deuxième partie de ce mémoire est constitué d'un article traitant sur l'introduction de la mutation protectrice de l'Alzheimer (A673T) avec le Prime editing. Les expériences ont été réalisées sur des cellules HEK293T. Plusieurs techniques d'optimisation du système dérivé de CRISPR-Cas9 ont été comparées dans le but d'obtenir une édition génique efficace et avec un bas taux d'indels (insertion-deletion). Les résultats obtenus sur la dystrophie musculaire de Duchenne et la maladie d'Alzheimer seront des éléments importants dans le développement d'une approche unique, efficace et reproductible pour corriger différentes mutations ponctuelles responsables de milliers de maladies génétiques. / Since 2019, a new biological tool has the potential to facilitate the scope of the CRISPR-Cas9 system. Prime editing, consisting of a pegRNA (a guide for editing) and a fusion protein (SpCas9n-RT) including a reverse transcriptase (a strand synthesizer) and a SpCas9n (a strand cutter) enables editing of the genome without requiring a double DNA break. The SpCas9n-RT protein recognizes a specific PAM (adjacent protospacer motif) docking sequence and the pegRNA, a precise sequence of 20 nucleotides that can be modified according to a predetermined pattern. This technology appears to be an ideal candidate for future gene therapies targeting point mutations due to its ability to specifically correct desired point mutations while decreasing off-target mutations due to the additional steps required during editing. The first part of this thesis mainly aims to demonstrate that Prime editing is an interesting therapeutic avenue for Duchenne muscular dystrophy by directly modifying the dystrophin gene. The experiments were carried on HEK293T cells and then on mouse models. We have determined that the dystrophin gene was efficiently editable on HEK293T cells with the optimized Prime editing. The second part of this thesis consists of an article about the introduction of a protective mutation of Alzheimer's (A673T) with Prime editing. The experiments were carried on HEK293T cells. Several techniques for optimizing the CRISPR-Cas9-derived system were compared in order to obtain efficient gene editing with a low indel rate. The results obtained on Duchenne muscular dystrophy and Alzheimer's disease will be important elements in the development of a unique, effective and reproducible approach to correct various point mutations responsible for thousands of genetic diseases.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le but de cette thèse est de développer une stratégie pro-apoptotique à partir des paramètres pouvant moduler l’apoptose photoinduite par le Foscan® dans des modèles précliniques d’adénocarcinome humain. La PDT avec le Foscan® a été appliquée in vitro sur lignées cellulaires où une apoptose modérée a été obtenue via l’implication indirecte de la voie mitochondriale. La modulation de l’apoptose photoinduite par l’oxygénation a été démontrée sur sphéroïde, modèle de micro-tumeur non vascularisée. Une irradiance faible, garantissant le maintien de l’oxygénation du sphéroïde, favorise l’activation de la caspase-3 photoinduite par le Foscan®. Le deuxième paramètre favorisant l’apoptose photoinduite est l’accroissement du temps d’incubation du photosensibilisateur avec les cellules MCF-7, ce qui modifie sa localisation subcellulaire. Après 3h d’incubation, le Foscan® est essentiellement localisé dans le réticulum endoplasmique (RE) et l’appareil de Golgi. Après irradiation, le stress oxydant du RE évalué par l’induction de la protéine chaperone GRP78 suivie de la réponse apoptotique mitochondriale et de l’activation des caspases a été observée. Après 24h d’incubation, la localisation dans le RE est renforcée ainsi que l’expression photoinduite de GRP78 corrélée avec une augmentation de l’activation caspase-7 indépendamment de la réponse mitochondriale. Après PDT in vivo, l’estimation par immunohistochimie sur coupe tissulaire de l’activation des caspases -7 et -3 montre une activation prédominante de la caspase-3 ce qui suggère une apoptose majoritairement dépendante de cette dernière dans les tumeurs d’adénocarcinome colique HT29 traitées par Foscan®-PDT. / In order to develop a proapoptotic strategy in Foscan®-mediated photodynamic therapy (PDT) an evaluation of the parameters that govern the modulation of photoinduced apoptosis was performed on preclinical model from human adenocarcinoma. Moderate apoptosis was measured in Foscan® photosensitised tumour cells in vitro. The mitochondrial pathway was assumed to be indirectly induced by Foscan®-PDT. Spheroids were used to investigate the influence of oxygen consumption, through the modulation of fluence rate, on the induction of apoptosis. By using a low fluence rate, an oxygen conservative regimen, we demonstrated an increase in the activation of caspase-3 induced by Foscan®-PDT. The modulation of photoinduced apoptosis by extending the incubation time of Foscan® with MCF-7 cells was further investigated. After 3h incubation, the photosensitizer was mainly localised in the endoplasmic reticulum (ER) and Golgi apparatus. Following irradiation, ER oxidative stress through the induction of the chaperon protein GRP78 was observed. Subsequent apoptotic mitochondria response and caspase activation were induced. After 24h incubation with Foscan®, the ER localisation of the photosensitizer was intensified. As results, an increase in GRP78 expression correlated with an increase in caspase-7 activation independently of the mitochondria response was obtained. After in vivo PDT, immunohistochemistry was applied on tissue sections to evaluate the activation of caspases -3 and -7. Caspase-3 activation was found predominant suggesting a caspase-3 mediated apoptotic pathway in HT29 tumours subjected to Foscan®-PDT.

Pour améliorer les paramètres pharmacologiques d’un photosensibilisateur de seconde génération, la méta-tétra(hydroxyphényl)chlorine (mTHPC), plusieurs formules liposomales commerciales ont été élaborées, parmi elles le Foslip, qui correspond à la mTHPC dans des liposomes conventionnels. L’objectif de ce travail est d’étudier les caractéristiques photophysiques et photobiologiques du Foslip. L’exposition des suspensions de Foslip à de petites doses de lumière (10 mJ) a conduit à une baisse significative de la fluorescence, qui a cependant été restaurée après destruction des liposomes. Nous attribuons cette caractéristique au quenching de fluorescence photoinduite. Cet effet a été mis en évidence uniquement pour les concentrations locales élevées de mTHPC dans des bicouches lipidiques. Les résultats ont été interprétés en supposant une migration d’énergie entre les molécules rapprochées de mTHPC avec sa dissipation consécutive par les molécules du photoproduit se comportant comme des pièges d’énergie. Le quenching de fluorescence photoinduite ainsi que les techniques de polarisation et de chromatographie liquide ont été appliquées successivement pour estimer le taux de redistribution des molécules de mTHPC des liposomes vers les protéines du plasma et les membranes lipidiques. Les processus de redistribution de la mTHPC après injection intratumorale de mTHPC dans un modèle de récidive de cancer du sein sont en corrélation avec les résultats obtenus dans une étude in vitro de la redistribution du Foslip dans les liposomes DPPC. Il a été démontré que le phénomène de quenching de fluorescence photoinduite doit être pris en compte lors de l’utilisation de techniques optiques pour l’étude des applications in vivo et in vitro des formulations liposomales de mTHPC. / To improve the pharmacological parameters of a second-generation photosensitizer meta-tetra(hydroxyphenyl)chlorin (mTHPC) several commercial liposomal formulations were designed, among them Foslip, which corresponds to mTHPC in conventional liposomes. The objective of this work was to study photophysical and photobiological characteristics of Foslip. Exposure of Foslip suspensions to small light doses (10 mJ) resulted in a substantial drop in fluorescence, which however, was restored after destruction of liposomes. We attributed this behavior to photoinduced fluorescence quenching. This effect was revealed only for high local mTHPC concentrations in lipid bilayer. The results were interpreted supposing energy migration between closely located mTHPC molecules with its subsequent dissipation by the molecules of photoproduct acting as excitation energy traps. Photoinduced fluorescence quenching together with polarization techniques and liquid chromatography was successfully applied for estimation of the redistribution rate of mTHPC molecules from the liposomes to plasma proteins and lipid membranes. Foslip liposomes were shown to be stable in human blood serum for at least 3 hours. Such increased stability was attributed to incorporation of hydrophobic photosensitiser into lipid bilayer. The processes of mTHPC redistribution after Foslip intratumoral injection in a model of breast cancer recurrence were found to be in good agreement with the results obtained from in vitro study of mTHPC redistribution from Foslip to pure DPPC liposomes. It was demonstrated that photoinduced fluorescence quenching phenomena should be taken into account while using optical techniques for studying in vivo and in vitro applications of liposomal mTHPC formulations.