La thérapie photodynamique (PDT) associe la lumière à un agent photosensibilisateur, qui dans l’idéal se localise spécifiquement dans les tissus cancéreux. Illuminé dans le visible, ce photosensibilisateur génère de l’oxygène moléculaire singulet (1O2) et des espèces radicalaires toxiques pour les cellules. Sa fluorescence peut également servir à diagnostiquer les lésions néoplasiques : il s’agit du photodiagnostic (PDD). Les extraits de Millepertuis, connus pour leur activité antidépressive, contiennent également des composés photoactifs, dont l’hypéricine, objet de nombreux travaux dans le cadre de la PDT et du PDD. Cependant, son coût de production est élevé et son utilisation limitée par un manque de solubilité en milieu physiologique. Dans ce contexte, la présente étude vise à évaluer le potentiel des extraits de Millepertuis pour la PDT et le PDD. Le matériel végétal utilisé a dans un premier temps fait l’objet d’analyses par Spectrométrie de Masse (SM) in situ afin de caractériser les molécules photoactives au niveau même des structures végétales impliquées dans leur production. Ces composés ont ensuite été extraits par un solvant organique, et ce mélange a fait l’objet d’études photochimiques visant à quantifier sa production d’1O2 sous illumination laser. La composition des extraits a ensuite été étudiée par désorption/Ionisation Laser couplée à la SM (TOF et FTICR), et par Ionisation Electropray couplée à la FTICRMS. Puis, ils ont fait l’objet d’études en milieu cellulaire (cancer de la vessie), visant à déterminer leur cytotoxicité à l’obscurité, les cinétiques d’internalisation des composés photoactifs, leur phototoxicité et la nature des composés internalisés / Photodynamic therapy (PDT) combines light with a drug called photosensitizing agent, which preferentially accumulates in cancerous cells. Irradiated with visible light, this photosensitizing agent generates singlet oxygen (1O2) and radicals that demonstrate cell toxicity. Fluorescence of this drug also allows diagnosing neoplasic lesions: this is photodynamic diagnosis (PDD).St John’s Wort extracts, mainly known for their antidepressant activity, also contain photoactive compounds, including hypericin which has been extensively studied for PDT and PDD. However, producing this molecule in large amounts is expensive and its use is restricted by a poor solubility in physiological medium. In this context, the present study deals with determining in what extent St John’s Wort extracts could be useful for PDT and PDD. Flowers that were used in this work were firstly in situ-analyzed by mass spectrometry in order to characterized photoactive compounds at the level of structures involved in their biosynthesis. These compounds were then extracted by organic solvent and the resulting mixture subjected to singlet oxygen production measurements under laser illumination. Qualitative analysis of the extracts was then performed either by Laser Desorption/Ionization or Electrospray Ionization coupled with Mass Spectrometry (TOF and FTICR). Finally, their behavior in cellular medium (bladder cancer) was investigated in terms of dark cytotoxicity, intracellular accumulation of photoactive compounds, phototoxicity and characterization of compounds absorbed by cells

Selon un modèle récent du trouble d'anxiété généralisée (TAG), l'intolérance à l'incertitude (Il)s'avère être la principale variable responsable des inquiétudes excessives (Dugas, Gagnon,Ladouceur & Freeston, 1998). Le but de cette étude est de vérifier l'impact de l'intolérance à l'incertitude sur les inquiétudes et ce, à partir d'événements quotidiennement vécus par les individus. Trente participants ont été soumis à une augmentation et une diminution de leur niveau d'intolérance à l'incertitude à une semaine d'intervalle. La manipulation a été effectuée à partir d'une séance de visualisation où le participant devait construire et imaginer une mise en situation.Les résultats démontrent qu'une augmentation du niveau d'intolérance à l'incertitude entraîne une augmentation des inquiétudes et, qu'au contraire, sa diminution fait diminuer les inquiétudes.Ces résultats confirment que l'intolérance à l'incertitude joue un rôle crucial au niveau de l'acquisition des inquiétudes et valident le modèle conceptuel récemment proposé (Dugas et al.,1998).

Le développement d’une thérapie génique pour la dystrophie myotonique de type 1 (DM1) implique l’utilisation d’un système de livraison musculaire efficace. L’évaluation d’oligonucléotides antisens (ASO) en conformation gapmer nous a permis d’identifier deux ASO, un de chimie 2’-O-méthoxyéthyle et l’autre avec des acides nucléiques bicycliques avec éthyle contraint, dont l’efficacité dans les modèles cellulaires et de souris de la DM1 était suffisante pour réduire significativement l’ARNm étendu de la DMPK. Il fut possible d’observer une réduction des foci nucléaires menant à une redistribution d’un régulateur d’épissage séquestré au noyau, ainsi corrigeant des erreurs d’épissage caractéristiques de la DM1. Plus particulièrement chez la souris DMSXL, l’injection systémique bihebdomadaire a mené à une maturation des fibres musculaires ainsi qu’au rétablissement de la force musculaire des sujets. Ce projet est la preuve de principe in vitro et in vivo qu’une thérapie génique par les ASO est concevable pour le traitement de la DM1. / A gene therapy for myotonic dystrophy type 1 (DM1) implies an effective muscular delivery method. The evaluation of antisenses oligonucleotides (ASO) enabled us to identify two gapmer ASOs, one with a 2’-O-methoxyethyl chemisty and the other with a constrained ethyl bicyclic nucleic acid, whose efficacy in DM1 cell and mouse models was sufficient to significantly reduced expanded hDMPK mRNA levels. Furthermore, reduction in DMPK induced nuclear foci resulted in redistribution of a sequestered alternative splicing regulator, leading to correction of mis-splicing events characteristic of DM1. In DMSXL mouse, biweekly systemic injection of ASOs induced muscle fiber maturation and a gain in forelimb strength. This project is the in vitro and in vivo proof of the principle that an ASO gene therapy is conceivable for treatment of DM1.

Les thérapies cognitives comportementales transdiagnostiques (TCC-T) semblent prometteuses pour le traitement des troubles anxieux hétérogènes. Toutefois, peu d'études existent sur leur efficacité et faisabilité en milieu clinique. L'objectif principal de la thèse était de documenter la faisabilité et l'efficacité clinique d'un protocole de thérapie cognitive-comportementale transdiagnostique (TCC-T) de groupe, adapté par les cliniciens du milieu, tel qu'appliqué dans leur pratique courante. La première étude avait pour but d'évaluer cet objectif auprès d'une population présentant des troubles anxieux principaux hétérogènes et des troubles concomitants. Cette étude s'est déroulée à la clinique externe des troubles anxieux de l'Institut Universitaire en santé mentale de Montréal (IUSMM). Ce sont 42 participants qui ont été référés à l'étude, dont 37 d'entre eux ayant débuté le traitement. À la suite du traitement, des améliorations significatives ont été observées parmi les 24 participants ayant complété le traitement (anxiété, dépression, fonctionnement quotidien et qualité de vie physique et psychologique). Ces gains ont été maintenus jusqu'à trois mois après la fin du traitement. L'effet du traitement n'a toutefois pas été significatif pour la qualité de vie sociale et environnementale. De plus, le taux d'abandon s'est avéré plus élevé qu'attendu (35 %). La deuxième étude avait pour but d'évaluer l'objectif de la thèse auprès d'une population ayant des troubles anxieux concomitant au trouble bipolaire. Lors de cette étude, seuls quatre participants ayant un trouble bipolaire et un/des trouble(s) anxieux concomitant(s) ont été recrutés à la clinique externe des troubles de l'humeur de l'IUSMM. Trois d'entre-deux ont débuté et complété le traitement tel qu'attendu. Les résultats obtenus dans cette étude étaient très hétérogènes, limitant ainsi l'appui de l'efficacité clinique du traitement auprès de ces patients. En somme, même si la TCC-T pourrait éventuellement être une avenue de traitement envisageable pour les patients ayant des troubles anxieux hétérogènes concomitants au trouble bipolaire, l'efficacité clinique de ce traitement auprès de cette population nécessitera des appuis empiriques supplémentaires. Le taux d'abandon plus élevé qu'attendu dans la première étude ainsi que les difficultés de recrutement de la deuxième étude ont été des obstacles considérables à la faisabilité du traitement. Cette thèse se démarque positivement par l'utilisation d'un protocole de traitement adapté par les cliniciens du milieu ainsi que par la collaboration étroite de ces derniers avec l'équipe de recherche. Elle souligne aussi la pertinence de réaliser des études pragmatiques, afin de documenter la transportabilité (avantages et obstacles) des protocoles de traitement de la recherche vers la pratique. Ce type d'étude a le potentiel d'influencer concrètement les décisions des cliniciens dans leur pratique courante. / The development of transdiagnostic cognitive-behavioural therapy (T-CBT) is a promising avenue for the treatment of heterogeneous anxiety disorders. However, few studies exist about their effectiveness in clinical settings. The main objective of the thesis consisted in evaluating the feasibility and effectiveness of a group transdiagnostic cognitive-behavioural therapy (T-CBT), adapted by practising clinicians, as delivered in routine care. In the first study, this objective was assessed in a sample of patients with heterogeneous principal and comorbid anxiety disorders. The study was conducted at the anxiety disorders' clinic of the Institut Universitaire en Santé Mentale de Montréal (IUSMM). There were 42 participants referred to this study, from whom, 37 started the treatment. Significant improvements were observed, after treatment, among treatment completers (n = 24) (anxiety, depression, daily functioning as well as physical and psychological domains of quality of life). Gains were maintained up to three months after the end of treatment. No significant improvement was observed on environmental and social quality of life's domains. Moreover, the dropout rate (35%) was higher than expected. In the second study, the same objective was assessed using a sample of patients with heterogeneous anxiety disorders, comorbid to bipolar disorder. The second study was carried out at the mood disorders' clinic of the IUSMM. Four participants with anxiety disorders comorbid to bipolar disorder were referred to the study. Three of them began and completed the treatment, as expected. Results from this study were highly heterogeneous, preventing a clear conclusion about the effectiveness of the treatment in patients with anxiety disorders comorbid to bipolar disorder. Therefore, T-CBT could be an effective treatment avenue for patients with heterogeneous anxiety disorders. However, the effectiveness of the treatment for patients with anxiety disorders comorbid to bipolar disorder will need further empirical support. The dropout rate in the first study, higher than expected, as well as the recruitment issues in the second study, were both significant barriers to the feasibility of the treatment. The current thesis positively stands out by using a treatment protocol adapted by practising clinicians, collaborating closely with the research team. It also stresses the usefulness of conducting pragmatic trials, in order to inform the transportability of treatment protocols from research to practise. This type of study has the potential to directly influence clinicians' decision in their routine practice.

Thèse ou mémoire avec insertion d’articles / La complexité et le coût de production à grande échelle des rAAV présentent un sérieux obstacle à la commercialisation des thérapies géniques. Des améliorations dans la fabrication des vecteurs rAAV sont réalisables à l'aide de lignées cellulaires d'empaquetage ou productrices, qui, dans le cas des rAAV, sont difficiles à générer en raison de la toxicité des protéines AAV Rep et des gènes auxiliaires d'adénovirus nécessaires à la production. Le gène AAV REP code pour quatre protéines Rep (Rep -78, -68, -52, -40) qui ont de multiples fonctions et rôles qui se chevauchent dans la production d'AAV. Les gènes auxiliaires adénoviraux utilisés dans la production de rAAV sont E2A, E4 et VA et jouent des rôles uniques dans le cycle de vie de l'AAV. Pour générer une lignée cellulaire d'empaquetage de AAV, tous ces composants doivent être intégrés de manière stable dans le génome des cellules. L'expression doit être étroitement régulée en raison de la cytotoxicité et lorsque l'expression est induite, les niveaux doivent être adéquats pour soutenir la production de rAAV. Une telle lignée cellulaire d'empaquetage serait un point de départ pour créer une lignée cellulaire productrice pour la production d'un sérotype spécifique d'AAV et d'un gène thérapeutique spécifique en intégrant un gène CAP d'intérêt et une séquence thérapeutique flanquée d'ITR. Le travail présenté dans cette thèse décrit le processus de génération et de caractérisation des lignées cellulaires d'empaquetage 293SF-CymR/λR-GyrB AAV exprimant les protéines Rep et les conceptions et tentatives de création d'une lignée cellulaire d'empaquetage Rep/Helper. Nous avons identifié et intégré avec succès une combinaison de deux protéines Rep (Rep68 et Rep40) exprimées à partir de deux promoteurs inductibles par le cumate et la coumermycine. Les lignées cellulaires créées ont démontré leur capacité à produire des titres à des niveaux comparables aux productions par transfection transitoire avec les lignées cellulaires parentales et se sont avérées stables en culture sans sélection. Nous décrivons également notre conception et nos travaux de recherche sur la faisabilité pour générer des lignées cellulaires d'emballage Rep/Helper où les séquences codant pour les protéines E4orf6 et E2A DBP sont également exprimées à partir de promoteurs inductibles par le cumate et la coumermycine. / The complexity and cost of large-scale rAAV production present a serious obstacle in commercialization of rAAV gene therapies. Improvements in rAAV vector manufacturing are achievable using packaging or producer cell lines, which in case of rAAVs are difficult to generate due to the toxicity of AAV Rep proteins and adenovirus helper genes required for production. The AAV REP gene encodes four Rep proteins (Rep -78, -68, -52, -40) which have multiple overlapping functions and roles in AAV production. The adenoviral helper genes used in rAAV production are E2A, E4 and VA and serve unique roles in the AAV lifecycle. To generate an AAV packaging cell line all these components must be stably integrated into the genome of the cells. Expression must be tightly regulated due to cytotoxicity and when expression is induced, the levels must be adequate to support rAAV production. Such a packaging cell line would be a starting point to create a producer cell line for production of a specific serotype of AAV and specific therapeutic gene by integrating a CAP gene of interest and ITR flanked therapeutic sequence. The work presented in this thesis describes the process of generating and characterizing 293SF-CymR/λR-GyrB AAV packaging cell lines expressing the Rep proteins and the designs and attempts of creating a Rep/Helper packaging cell line. We successfully identified and integrated a combination of two Rep proteins (Rep68 and Rep40) expressed from two cumate and coumermycin inducible promoters. The created cell lines demonstrated ability to produce titers at levels comparable to transient transfection productions with the parental cell lines and were shown to be stable in culture without selection. We also describe our design and investigation into the feasibility of Rep/Helper packaging cell line generation where the E4orf6 and E2A DBP protein coding sequences are also expressed from cumate and coumermycin inducible promoters.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie génétique liée au chromosome X qui atteint un garçon sur 3 500. Cette maladie est caractérisée par l'absence de dystrophine à la surface des fibres musculaires. Sans cette protéine, les fibres se brisent plus fréquemment et une faiblesse musculaire progressive apparait. Les patients décèdent généralement au début de la vingtaine. Il n'y a présentement aucun traitement pour cette pathologie. La greffe de cellules myogéniques est une thérapie possible, mais se heurte à un rejet par le système immunitaire du patient. Pour contourner ce problème, il est possible de développer une thérapie génique ex vivo, basée sur la greffe de cellules autologues modifiées génétiquement. Malheureusement, aucune technique efficace de modification génétique des cellules n'était disponible il y a quatre ans. Nous avons testé deux nouvelles techniques de modification génétique. Une première est non virale et la seconde utilise les lentivirus. La première consiste à transfecter un plasmide d'expression de la dystrophine par Nucléofection. Pour intégrer les séquences, un second plasmide, codant pour l'intégrase PhiC31, est aussi introduit dans les cellules. Cette technique nous a permis de stabiliser des plasmides allant de 7 kb à 21 kb, ce qui en fait les plus grosses séquences jamais stabilisées dans des cellules de culture primaire humaine. Cette expression a pu être détectée dans les fibres musculaires après une greffe. Nous avons aussi utilisé des lentivirus pour effectuer une modification génétique des cellules. Ce vecteur viral est très efficace pour introduire des cassettes d'expression pour des versions tronquées de la dystrophine. L'expression de cette dystrophine est détectable in vitro, mais aussi in vivo après la transplantation. De plus, une cassette servant à faire le saut d'exon thérapeutique a aussi été introduite dans des cellules myogéniques et a permis de faire exprimer une dystrophine presque complète par des cellules issues de patients DMD. Cette expression a aussi été détectée dans des modèles murins. Ces travaux constituent une preuve de principe de la faisabilité d'une thérapie génique ex vivo pour la DMD. Plusieurs améliorations restent à apporter, mais il semble que ces travaux laissent croire qu'un essai clinique sera réalisable. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe X-linked muscle genetic illness that afflicts one boy per 3 500. Cell therapy is a possible cure for this illness that usually kills patients around age 25. Transplantation of the heterologus myogenic cells is, however, restricted by the immune rejection by the patient. Ex vivo gene therapy offers an evasion to this problem. Introduction of the therapeutic gene into the patient’s own myogenic precursor cells, followed by transplantation is the base of this therapeutic. Four years ago, no efficient procedure to stably modify myogenic cells was available. New gene introduction techniques were thus tested in the present thesis. The first one is a non-viral method. We used a new transfection technology (Nucleofection) to introduce plasmid DNA coding for dystrophin with success. To stabilize the expression, human myogenic cells were co-nucleofected with a PhiC31 expressing plasmid. This integrase was capable of stabilising expression plasmids ranging from 7 kb to 21 kb. This very large sequence was the largest plasmid ever stabilised into human primary cultured cells. The presence of full-length dystrophin protein was detected in vitro and confirmed in vivo, after the transplantation of the myogenic precursor. Another technique was used: the lentiviral vectors. These viral vectors were designed to deliver an expression cassette for a truncated version of the dystrophin gene. The viral vector was efficient at modifying the cells. The expression was shown in vitro and in vivo after the transplantation of the modified cells. The lentiviral vectors were also essayed to deliver a U7 exon skipping cassette into DMD cells. It was then possible to demonstrate that this introduction led to the expression of a quasi normal dystrophin protein in vitro. The expression was also shown in vivo after the transplantation into SCID mice model. A non-viral approach combining nucleofection and the PhiC31 integrase may eventually permit safe auto-transplantation of genetically modified cells. The utilisation of lentiviral vectors also provided evidences that an ex vivo gene therapy is possible for DMD. We believe these results are paving the way to an eventual clinical trial for ex vivo gene therapy.

L'anémie de Fanconi (AF) est une pathologie génétique rare (1/350 000 naissances), transmise selon le mode récessif. Son tableau clinique regroupe de nombreuses malformations congénitales, une aplasie médullaire, une pancytopénie et une prédisposition accrue aux cancers. Au plan cellulaire, une mutation sur l'un des treize gènes Fanconi suffit à induire une instabilité chromosomique et une hypersensibilité aux agents pontant l'ADN. La perte de fonction des protéines Fanconi est probablement responsable du défaut d'autorenouvellement des cellules souches hématopoïétiques (CSH) et de l'état pro-apoptotique des progéniteurs médullaires. Les principaux traitements ont une très faible efficacité et induisent de dangereuses complications (toxicité, leucémies). La thérapie génique qui consiste à introduire ex vivo dans les CSH, une copie fonctionnelle du gène Fanconi altéré, apparaît ici comme le traitement alternatif le plus prometteur. Les premiers travaux effectués dans le laboratoire et confirmés pas d'autres, ont montré que la correction génique ex vivo est néfaste pour les CSH Fanconi. Une nouvelle approche thérapeutique a été mise en place, consistant à introduire la copie fonctionnelle du gène altéré directement in vivo, par injection intra-fémorale (IIF). Cette technique novatrice permet de délivrer le gène dans le milieu natif des CSH, leur évitant le stress induit par la culture. Après l'IIF de virions porteurs du gène EGFP (enhanced green fluorescent protein), des analyses sanguines mensuelles montrent une augmentation régulière de la fluorescence, confirmant l'efficacité technique du transfert génique in vivo. L'étape suivante consistait en l'injection du gène correcteur FancC, en fusion avec le marqueur EGFP (FancC-EGFP), dans des souris FancC-/-, FancA-/- et sauvages. L'expression sanguine de la protéine FANCC-EGFP confirme la transduction de cellules médullaires. L'efficacité de correction est évaluée lors de tests de survie des souris aux injections intra-péritonéales d'un agent pontant l'ADN : la mitomycine-C (MMC), sur une période de quinze semaines. Ce traitement vise à évaluer l'effet correcteur de la transduction et la fonctionnalité de la protéine transgénique, seules les cellules corrigées seront en mesure de restaurer l'intégrité de leur ADN et de proliférer. La nature des cellules corrigées a été analysée au cours de transplantations successives. Les résultats démontrent que les CSH FancC-/- recouvrent, après correction in vivo, par le transgène FancC-EGFP, une fonctionnalité semblable à celle des sauvages. Les résultats préliminaires obtenus dans le modèle murin aplasique confirment l'efficacité de la correction génique et sont particulièrement encourageants puisqu'ils permettent d'envisager l'IIF comme une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement de l'AF.

Titre de l'écran-titre (visionné le 25 octobre 2023) / L'insomnie persistante est un trouble du sommeil fréquent qui touche environ 10 % à 15 % de la population adulte générale. La thérapie cognitive-comportementale de l'insomnie (TCC-I) est le traitement recommandé en première ligne pour ce trouble. Les écrits scientifiques suggèrent un manque de connaissances vis-à-vis certaines composantes de la TCC-I, dont le contrôle par le stimulus (SCT). Le présent mémoire s'intéresse à mieux comprendre le SCT afin d'en améliorer la portée thérapeutique. D'abord, une recension systématique a été réalisée afin de documenter les variantes dans les consignes du SCT ainsi que leur efficacité chez les adultes souffrant d'insomnie. Ensuite, trois méta-analyses en réseau ont été effectuées afin d'estimer et comparer l'efficacité du SCT à d'autres interventions psychologiques utilisées pour le traitement de l'insomnie. Une recherche documentaire a été effectuée dans les bases de données MEDLINE, PsycINFO, Embase, CINAHL, Psychology & Behavioral Sciences Collection, Web of Science et Cochrane Library sans restriction de langues entre la date de la première parution du SCT en 1972 et le 6 juin 2022. Vingt-trois études comprenant 1 603 participants ont été incluses. Les résultats indiquent que le SCT est une intervention individuelle efficace lorsque comparée à des conditions contrôles pour diminuer la latence d'endormissement et le temps total d'éveil pendant la nuit ainsi que pour augmenter le temps total de sommeil. Également, l'efficacité du SCT est comparable à plusieurs autres interventions psychologiques qui comprennent parfois des consignes contraires à celles proposées dans le SCT. Ces résultats suggèrent que certaines consignes du SCT (c.-à-d., réserver la chambre à coucher aux activités sexuelles et à dormir ainsi que sortir du lit après 10 à 15 minutes d'éveil) semblent être les moins optimales. De nouvelles études testant l'efficacité des différentes consignes du SCT sont nécessaires afin de comprendre davantage les mécanismes d'action du SCT et augmenter son efficacité. / Persistent insomnia is a common sleep disorder that affects approximately 10-15% of the general adult population. Cognitive-behavioral therapy for insomnia (CBT-I) is the recommended first-line treatment for this disorder. The scientific literature reveals a lack of knowledge regarding certain characteristics of CBT-I, including stimulus control (SCT). This doctoral dissertation focuses on better understanding SCT in order to improve its therapeutic scope. First, a systematic review was conducted to document the variations in the SCT instructions and their effectiveness in adults with insomnia. Next, three network meta-analyses were performed to estimate and compare the effectiveness of SCT to other psychological interventions used for the treatment of insomnia. A literature search was performed in MEDLINE (Ovid), PsycINFO (Ovid), Embase (Elsevier), CINAHL (EBSCO), Psychology & Behavioral Sciences Collection (EBSCO), Web of Science and Cochrane Library (Wiley) databases without language restriction between the date of the first publication of the SCT in 1972 and June 6, 2022. 23 studies with 1603 participants were included. The quality of the included studies was generally poor. The results indicate that SCT is an effective individual intervention when compared to control conditions in decreasing sleep onset latency and wake after sleep onset as well as increasing total sleep time. Also, the effectiveness of the SCT is comparable to several other psychological interventions that sometimes include instructions contrary to those proposed in the SCT. These results suggest that certain SCT instructions (i.e., reserve the bedroom for sexual activities and sleeping and getting out of bed after 10 to 15 minutes) seem to be the least optimal. Also, the results further support the hypothesis of cognitive or emotional activation regarding the mechanism of action of SCT. Further studies testing the effectiveness of different SCT instructions are needed to better understand the mechanism of action of SCT and to increase its effectiveness.

Titre de l'écran-titre (visionné le 25 juillet 2023) / La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est la plus fréquente des dystrophies musculaires chez l'adulte avec une prévalence de 1/8,000. Il s'agit d'une maladie multisystémique qui touche non seulement le muscle, mais aussi de nombreux organes et systèmes comme le cœur, le cerveau, les poumons, les yeux, les systèmes endocrinien et digestif. Une particularité de cette maladie est l'existence de la forme congénitale sévère responsable de 20 % de décès. La DM1 est causée par une expansion d'un triplet CTG dans la région 3' non codante du gène DMPK et que les ARNs mutés s'accumulent dans les noyaux formant des foci nucléaires. Ces foci séquestrent un facteur d'épissage de la famille des protéines muscle blind (MBNL) et perturbent la fonction de CUGBP-Elav-like (CELF), conduisant à une dérégulation de l'épissage alternatif et à des symptômes cliniques. La DM1 est une maladie qui affecte la qualité de vie, conduit à l'invalidité et réduit l'espérance de vie des sujets atteints, et actuellement il n'existe aucun traitement curatif. Notre hypothèse stipule que la destruction des ARNm DMPK mutés par l'utilisation des oligonucléotides antisens (ASOs) empêchera la fixation du MBNL, et améliorera ainsi le phénotype DM1 dans des modèles in vitro et in vivo. La première partie de ma thèse consiste à développer un modèle cellulaire de la DM1. Nous avons d'abord élaboré une procédure standardisée pour dériver les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs) à partir de lignées cellulaires lymphoblastiques (LCL) en utilisant la méthode Sendeï. Nous avons généré des hiPSCs d'un homme atteint de la forme adulte de la DM1 avec 200 répétitions CTG. Les hiPSCs obtenues conservent la mutation génétique de la DM1, présentent un caryotype normal, expriment les marqueurs de pluripotence et sont capables de se différencier en trois couches germinales. Par la suite, nous avons développé un modèle de cellules neuronales humaines de patients DM1 ayant 1300 CTG pour vérifier l'efficacité des ASOs. Les cellules neuronales récapitulent les principaux phénotypes moléculaires de la DM1 par la présence de foci nucléaires qui se co-localisent avec les protéines MBNL1 et MBNL2 et l'existence des défauts d'épissage alternatif. La deuxième partie est consacrée à améliorer l'efficacité des ASOs pour le traitement des manifestations musculaires, cardiaques et cérébrales en étudiant l'ASO IONIS-486178 conjugué à un acide palmitique via un linker HA (C16-HA): le IONIS-877864. Nos résultats montrent que C16-HA améliore considérablement l'absorption des ASOs dans les muscles striés des souris DMSXL après administration systémique. L'injection sous-cutanée de IONIS-877864 entraîne une destruction de 92 % des ARNm de hDMPK mutés dans les muscles squelettiques et de 78 % dans le cœur. Toutefois, aucun effet n'a été observé dans le cerveau. La diminution des transcrits mutés de hDMPK dans les muscles squelettiques causée par IONIS-877864 a été associée à une amélioration significative de la force musculaire, confirmant ainsi la pertinence des ASOs conjugués à l'acide palmitique C16-HA pour le traitement aussi bien des tissus musculaires que cardiaques. Dans la troisième partie du travail, nous testons l'administration intrathécale des ASOs comme traitement des déficits cérébraux observés chez les patients DM1, étant donné qu'aucune chimie à ce jour n'a été capable de franchir la barrière hémato-encéphalique. IONIS-486178 a été évalué à la fois in vitro dans les cellules neurales DM1 et in vivo chez les souris DMSXL. L'ASO a détruit 80 % des foci nucléaires dans les cellules neurales. Cette destruction a permis la redistribution de MBNL1 et 2 et la correction de certaines anomalies d'épissage. L'injection intracérébroventriculaire de IONIS-486178 chez des souris DMSXL adultes a permis une diminution de jusqu'à 70 % des ARNm de hDMPK mutés dans les différentes régions du cerveau, un effet maintenu pendant douze semaines, et une biodistribution de l'ASO dans toutes les régions cérébrales. Enfin, l'analyse de l'activité globale des souris DMSXL par le test Open field montre qu'une seule injection intracérébroventriculaire des souris DMSXL néonatales par IONIS-486178 améliore significativement les anomalies comportementales 3 semaines après le traitement. Dans l'ensemble, cette thèse soutient la faisabilité d'un traitement par injections systémiques d'ASO pour les manifestations musculaires et cardiaques, et par administration intrathécale pour le traitement des déficits cérébraux chez les patients DM1. / Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is the most common muscular dystrophy in adults with a prevalence of 1/8,000. It is a multisystem disease that affects not only the muscle, but also many organs and systems such as the heart, brain, lungs, eyes, endocrine and digestive systems. A particularity of this disease is the existence of the severe congenital form responsible for 20 % of deaths. DM1 is caused by an expansion of a CTG triplet in the 3' non-coding region of the DMPK gene and the mutated RNAs accumulate in the nuclei forming nuclear foci. These foci sequester a splicing factor of the muscle blind protein family (MBNL) and disrupt CUGBP-Elav-like (CELF) function, leading to deregulation of alternative splicing and clinical symptoms. DM1 is a disease that affects quality of life, leads to disability, and reduces life expectancy of affected individuals and currently there is no curative treatment. Our hypothesis states that the destruction of mutated DMPK mRNAs using antisense oligonucleotides (ASOs) will prevent MBNL binding, and thus improve the DM1 phenotype in in vitro and in vivo models. The first part of my thesis consists in developing a cellular model of DM1. We first developed a standardized procedure to derive human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from lymphoblastic cell lines (LCL) using the Sendeï method. We generated hiPSCs from a man affected by an adult form of DM1 with 200 CTG repeats. The resulting hiPSCs retained the DM1 genetic mutation, had a normal karyotype, expressed pluripotency markers and were able to differentiate into three germ layers. Subsequently, we developed a human neuronal cell model of DM1 patients with 1300 CTG to verify the efficacy of ASOs. The neuronal cells recapitulate the main molecular phenotypes of DM1 by the presence of nuclear foci that co-localize with MBNL1 and MBNL2 proteins and the existence of alternative splicing defects. The second part is devoted to improving the potency of ASOs for the treatment of muscle, heart and brain events by studying the IONIS-486178 ASO conjugated to a palmitic acid (C16) via an HA linker (the IONIS-877864). Our results show that C16-HA significantly enhances ASO uptake in striated muscles of DMSXL mice after systemic administration. Subcutaneous injection of IONIS-877864 results in 92 % destruction of mutant hDMPK mRNAs in skeletal muscle and 78 % in heart. However, no effect was observed in the brain. The decrease in mutant hDMPK transcripts in skeletal muscles caused by IONIS-877864 was associated with a significant improvement in muscle strength, thus confirming the suitability of C16-HA palmitic acid-conjugated ASOs for the treatment of both muscle and cardiac tissues. In the third part of the work, we test intrathecal administration of ASOs as a treatment for brain deficits observed in DM1 patients, as no chemistry to date has been able to cross the blood-brain barrier. IONIS-486178 was evaluated both in vitro in DM1 neuronal cells and in vivo in DMSXL mice. ASO destroyed 80 % of nuclear foci in neural cells. This destruction allowed the redistribution of MBNL1 and 2, and the correction of some splicing defects. Intracerebroventricular injection of the IONIS-486178 in DMSXL mice adult resulted in a decrease of up to 70 % in hDMPK mutated mRNA levels in different brain regions, an effect maintained for twelve weeks, and biodistribution of ASO in all brain regions. Finally, analysis of the global activity of DMSXL mice by the Open field test shows that a single intracerebroventricular injection of neonatal DMSXL mice with IONIS-486178 significantly improves behavioral abnormalities 3 weeks after treatment. Overall, this thesis supports the feasibility of treatment with systemic injections of ASO for muscle and cardiac manifestations, and intrathecal administration for the treatment of brain deficits in DM1 patients.

La thérapie génique sans transfert de gène utilisant les endonucléases de restriction spécifiques est une des approches thérapeutiques qui visent à la mise au point d’un traitement curatif de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Afin de corriger le gène de la dystrophine avec les nucléases à doigt de zinc (ZFNs) en ciblant l’exon 50, nous avons produit les protéines ZFNs dans les bactéries et les avons purifiées. Les résultats obtenus après les essais in vitro montrent que les ZFNs produites reconnaissent d’une manière spécifique la séquence cible située au niveau de l’exon 50 du gène DYS et peuvent y générer d’une manière précise les coupures double-brin. Ils montrent également que les protéines ZFNs produites peuvent être transfectées, avec ou sans agent de transfection, dans les myoblastes des patients dystrophiques Duchenne en culture. / Gene therapy without gene transfer using specific restriction endonucleases is a therapeutic approaches aimed at the development of a cure for Duchenne muscular dystrophy (DMD). To correct the dystrophin gene with zinc finger nucleases (ZFNs) targeting exon 50of DYS gene, we produced ZFNs proteins in bacteria and purified them. The results obtained after in vitro assays show that ZFNs produced specifically recognize a target sequence located in exon 50 of the gene DYS and can be generated in a precise manner the double strand breaks. They also show that ZFNs produced proteins can be transduced with or without agent transduction, in cultured myoblasts of patients’ Duchenne dystrophy.