Cette thèse de doctorat s'inscrit dans la perspective de vouloir vérifier l'efficacité de la thérapie cognitivo-comportementale (TCC) auprès d'une population ayant un trouble panique (TP) avec paniques nocturnes (PN). Les PN sont relativement communes chez les individus souffrant du TP. Lorsqu'elles se manifestent de façon régulière et fréquente, elles peuvent entraîner de la détresse et des perturbations au niveau du sommeil. Malgré ceci, très peu d'études se sont attardées à vérifier leur réponse aux traitements. La TCC est démontrée comme étant efficace pour le TP, mais aucune étude n'a testé son efficacité pour les PN. Certaines caractéristiques particulières sont identifiées chez les gens ayant un TP avec PN comparativement à ceux sans PN. Toutefois, les données à cet égard sont contradictoires. La présente thèse vise donc d'une part, à mettre à jour les connaissances sur le phénomène du TP avec PN à l'aide d'une recension des écrits récente et exhaustive. D'autre part, elle a pour but d'examiner l'impact de deux modalités d'intervention pour les individus souffrant d'un TP avec PN, soit la TCC conventionnelle pour le TP et une TCC adaptée aux caractéristiques spécifiques de cette population. La thèse comporte trois chapitres. Le premier présente une recension des écrits sur le phénomène des PN. Il fait un survol général des principaux aspects ayant été étudiés en regard des PN, tout en accordant une attention toute particulière aux travaux portant sur les caractéristiques spécifiques à cette population. La recension met en évidence que les contradictions existantes quant aux caractéristiques particulières de cette population et le peu d'attention portée aux approches thérapeutiques justifient des recherches futures. Le deuxième chapitre de la thèse présente une étude portant sur l'efficacité de deux modalités d'une TCC auprès de patients ayant un TP avec PN. Trois participants ont pris part à chacune des modalités thérapeutiques. Deux devis à cas unique à niveaux de base multiples ont été employés. Les résultats montrent que le traitement conventionnel pour le TP et le traitement adapté sont tous deux efficaces pour les individus souffrant d'un TP avec PN. Les changements cliniques apportés par chacun des traitements semblent, à première vue, similaires. Ces constats génèrent un questionnement sur la réelle nécessité d'adapter la TCC spécifiquement pour les PN. Les résultats révèlent également que les traitements semblent avoir un impact limité sur la qualité du sommeil des participants et que celle-ci peut s'avérer affectée par d'autres facteurs, indépendamment de l'amélioration du TP avec PN. Le dernier chapitre propose une discussion générale des résultats obtenus dans cette thèse en fonction des implications pour la conceptualisation des PN et de leur traitement ainsi que pour les problèmes de sommeil chez cette population. Enfin, des considérations d'ordre méthodologique et des pistes de recherches futures sont évoquées. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Trouble panique, Attaques de panique nocturnes, Thérapie cognitive-comportementale, Sommeil, Devis à cas uniques à niveaux de base multiples.

Cette étude à cas unique a été conçue pour évaluer l'impact d'un traitement cognitif-comportemental sur le profil hallucinatoire, la qualité de vie, dépression, anxiété et insight d'une patiente souffrant de schizophrénie. La cliente faisant l'objet de cette étude a été référée au clinicien chercheur suivant plusieurs traitements pharmacologiques utilisant des antipsychotiques de première et seconde génération sans obtenir de réduction significative sur son profil hallucinatoire et délirant. Le traitement cognitif-comportemental utilisé dans cette étude est directement inspiré par les travaux de Chadwick, Birchwood et Trower (1994,1995, 1996, 2004). Leur perception de la schizophrénie opère un changement impératif du modèle traditionnel axé sur les symptômes vers un modèle axé sur la personne. Le modèle axé sur les symptômes introduit dans sa version initiale par Kraepelin (1907) et Bleuler (1911) est encore utilisé aujourd'hui sous plusieurs formes plus sophistiquées comme modèle dominant dans la classification des troubles de nature psychotique. Ce modèle est critiqué par certain auteurs pour son manque de définition, de fondement et surtout pour son manque de cadre conceptuel précis (Bentall, 1996). L'introduction d'un modèle centré sur la personne est présenté dans cette étude comme étant une alternative intéressante puisque les symptômes de la cliente atteint de schizophrénie sont perçus à travers un continuum axé sur sa vulnérabilité psychologique. L'approche cognitive-comportementale utilisée dans cette recherche semble efficace pour réduire l'anxiété (C=0.78, P=.006), la dépression (C=0.82, P=.004) augmenter la qualité de vie (c=0.83, P=.004) et le niveau d'insigbt (C=0.81), P=.004) en plus d'augmenter la capacité de la cliente à faire face au stress suivant les manifestations hallucinatoires et délirantes. Les gains obtenus durant la thérapie ont été maintenus aux mesures de suivi à 3,6 et 12 mois. Les résultats de cette recherche pointent vers l'insight de la cliente en ce qui concerne ses croyances reliées aux hallucinations et idées délirantes comme étant le point d'entrée permettant le progrès thérapeutique. Les recherches futures dans le domaine devraient se concentrer sur ces croyances, le lien et les interactions entre les symptômes psychotiques positifs et négatifs, ainsi que les aspects environnementaux et sociaux de la vie des individus souffrant de schizophrénie. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Thérapie, Cognitif, Comportemental, Schizophrénie, Hallucination, Qualité, vie, Anxiété, Dépression, Insight.

Les violences conjugales représentent un problème de santé public majeur. En 2011, en France, tous les 2,5 jours, une femme meurt sous les coups de son compagnon. Les violences conjugales résultent de la conjonction de facteurs individuels, conjugaux, sociaux mais également culturels, qui seront détaillés dans cette recherche qui présentera également l’état de l’art concernant les conséquences de ces violences, leurs possibilités de prise en charge et la thérapie EMDR. Quatre études ont été menées dans cette recherche. La première porte sur les conséquences des violences conjugales auprès d’un public de femmes bénéficiant d’un accompagnement social. Il s’agissait d’apporter une contribution aux résultats déjà observés dans la littérature. La seconde étude porte sur la prise en charge de 5 femmes ayant vécu un évènement traumatique en couple et s’étant séparées de leur agresseur. La thérapie EMDR donne des résultats véritablement encourageants, ce qui nous amène à la tester auprès d’un public plus lourdement traumatisé, ayant vécu des violences conjugales d’intensité et de nature variable, durant de nombreuses années (étude 3). Les résultats de l’étude 3 mettent en évidence l’importance de l’adaptation de l’outil thérapeutique à la problématique de la victime et les limites de l’utilisation de l’EMDR auprès de certains types de publics, dont les victimes de violences conjugales. Une analyse de contenu des séances EMDR nous a permis d’affiner nos analyses grâce à une vignette clinique présentée dans l’étude 4. De plus, des personnes n’ayant pas pu être intégrées dans le protocole expérimental ont malgré tout été suivies, ce qui permet une réflexion autour de l’adéquation de la méthode thérapeutique et du cadre expérimental à la victime grâce à une étude de cas, également présentée dans l’étude 4. Toutes ces observations permettront l’émergence de suggestions concernant la prise en charge des victimes de violences conjugales / Domestic violence represents a major problem for public health. In France, every 2,5 days, a woman dies by the hands of her partner. Domestic violence is the result of the conjunction of individual, domestic, social and also cultural factors to be detailed in this research that will also present the state of art, regarding the consequences of this violence, its means of management and EMDR therapy. Four studies were led in this research. The first one is about the consequences of domestic violence for a group of women benefiting from social support. The idea was to bring a contribution to the results already observed in literature. The second study is about the caretaking of five women who experienced a traumatic event during their couple life, and then split up with their molester. EMDR therapy gives really encouraging results, and it led us to test it with a public more heavily traumatized, who lived intensity and variable violence during many years (study 3). The results of the third study highlight the importance of the adaptation of the therapeutic tools to the problematic of the victim, and the limits of the use of EMDR with some public, included the victims of domestic violence. An analysis of the EMDR sessions content allowed us to refine our analyses thanks to a clinical “vignette” showed in study 4. Moreover, people that could not be included in the experimental protocol were all the same followed up, allowing a reflection around the appropriateness of the therapeutic method and of the experimental frame to the victim thanks to a case study, also presented in study 4. All these observations will allow the emergence of suggestions concerning the caretaking of the domestic violence victims

Doctorat en sciences psychologiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique qui touche environ 1 garçon sur 3500. Cette pathologie liée au chromosome X est caractérisée par l’absence de dystrophine au niveau des muscles. Ce manque de dystrophine fragilise le sarcolemme des fibres musculaires menant à une faiblesse progressive du muscle. Les patients décèdent généralement dans la vingtaine et il n’y a pas à l’heure actuelle de traitement curatif pour cette maladie. Une approche pour restaurer la dystrophine chez le patient DMD est d’introduire un transgène codant pour cette protéine dans ses muscles. Cela peut être fait par thérapie génique et particulièrement par la thérapie génique ex vivo et l’électroporation. Bien que ces deux techniques aient fait leurs preuves dans différents modèles animaux, elles n’ont jamais été utilisées chez le chien dystrophique alors que c’est le modèle le plus proche de la DMD en termes de phénotype. Deux versions de la dystrophine de chien ont été utilisées dans nos expériences : une version pleine longueur et une autre plus petite afin qu’elle puisse être incluse dans un lentivirus. La transplantation de myoblastes génétiquement modifiés par ce lentivirus (thérapie génique ex vivo) nous a permis d’obtenir l’expression de micro-dystrophine dans les muscles des souris immunodéficientes greffés. Néanmoins, l’autotransplantation de myoblastes de chien génétiquement modifiés a mené à un rejet spécifique des cellules greffées. L’électroporation, c.-à-d. l’injection de plasmide suivie d’un choc électrique, a également été utilisée pour introduire ce transgène ainsi que celui de la dystrophine pleine longueur dans des muscles de souris et de chien. Ces deux transgènes furent retrouvés avec succès chez la souris et le chien. Cependant, des infiltrations de cellules de l’immunité spécifique furent retrouvées au niveau des fibres exprimant le transgène chez le chien (pour l’utilisation de micro-dystrophine) et chez le chien dystrophique (pour la dystrophine pleine longueur). Bien que les résultats obtenus avec la thérapie génique ex vivo et l’électroporation soient très bons chez la souris, ceux obtenus chez le chien sont plus modérés. Il reste donc encore beaucoup d’améliorations à apporter à ces deux méthodes avant qu’elles puissent être utilisées comme approche thérapeutique dans le cadre de la DMD. / Duchenne muscular dystrophy is a genetic disease affecting 1 out of every 3500 boys. This X-linked pathology is characterised by the absence of dystrophin in myofibers. This lack of dystrophin leads to a progressive muscular degeneration. DMD patients die between 17 and 30 years of age. There are currently no curative treatments for this disease. An approach to restore dystrophin in DMD patients is to introduce a transgene coding for this protein into their muscles. This can be done by gene therapy, particularly by ex vivo gene therapy or by electroporation. Even if these 2 techniques have shown good results in mouse models, they have not been used in the dystrophic dog. Two different isoforms of the dystrophin were used in our experiments: the full length dog dystrophin and a shorter version, the dog micro-dystrophin, introduced in a lentivirus backbone. Myoblasts were transduced with this lentivirus and transplanted successfully in immunodeficient mouse. However, the autotransplantation of genetically modified dog myoblasts led to a specific rejection of the grafted cells. A non viral gene therapy (electroporation, i.e., injection of a plasmid followed by a sequence of electric pulses) was used to introduce these two different isoforms of dystrophin in mouse and (normal and dystrophic) dog muscles. The two transgenes were electroporated with success in these muscles. However, a specific immune response was found in some myofibers expressing the transgene in the normal dog (using micro-dystrophin) and in the dystrophic dog (using full length dystrophin). Although the results obtained with the ex vivo gene therapy and with the electroporation were relatively effective in the mouse model, those obtained with the dog model were much lower. Thus, lots of improvements remain to be made in order to consider these two techniques as potential approaches to restore dystrophin in a large animal model and eventually in DMD patients.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / L'ataxie de Friedreich (FRDA), une maladie neurodégénérative autosomique récessive, est l'ataxie héréditaire la plus fréquente dans le monde. Elle touche principalement les individus de race caucasienne, et sa prévalence est très variable entre les régions allant de 1/20 000 à 1/50 000. Cette pathologie est causée majoritairement par une insertion d'une série de répétition GAA (GAAr) dans le premier intron du gène de la frataxine (FXN) conduisant à une diminution de l'expression de cette protéine. Selon plusieurs auteurs, la délétion des GAAr par la technologie CRISPR/Cas9 permet d'améliorer la synthèse de la frataxine. Notre hypothèse est qu'il est possible de livrer les composants de la technologie CRISPR/Cas9 dans un seul AAV pour induire une délétion des GAAr afin de restaurer une transcription normale de la frataxine. Cependant, les virus adéno-associés (AAV) utilisés pour la livraison des composants du système CRISPR dans l'organisme font face à certains défis : une limite d'encapsidation (4,7 kb) et une expression constitutive de la nucléase qui peut entraîner des effets délétères. Mon premier article, vise à démontrer que pour supprimer la répétition GAA dans les cellules in vivo, il est possible d'utiliser certains composants de la technologie CRISPR/Cas9 suffisamment petits pour être incorporés dans un seul AAV. Ce traitement devrait restaurer une transcription normale et augmenter ainsi l'expression de la frataxine. La Cas9 dérivé de Campylabacter jejuni (CjCas9) est la plus petite Cas9 identifiée jusqu'à ce jour et peut permettre aux composants du système CRISPR d'être inclus dans un seul AAV. Ainsi, un AAV9 codant pour la protéine CjCas9 et deux ARNgs a été administré par voie intrapéritonéale à deux modèles de souris YG8sR (250 à 300 GAA) et YG8-800 (800 GAA) à l'âge de 10 - 11 jours. Quatre semaines après le traitement, les plus fortes concentrations de virus ont été détectées dans le foie et dans le cœur. Le taux de délétion des GAA était de 4,7 % et 2,4 % dans le cœur, 17,5 % et 14,5 % dans le foie pour les souris YG8sR et YG8-800 respectivement. L'ARNm de la frataxine n'a augmenté significativement que dans le foie des souris YG8-800, organe dans lequel une édition de 14,5 % avait été détectée. Au regard des taux d'édition observés, il nous a semblé nécessaire de proposer et tester une approche pour améliorer l'efficacité du système CRISPR. Ainsi, dans mon deuxième article, les inhibiteurs du protéasome ont été utilisés pour augmenter la stabilité de la protéine CjCas9. De ce fait, une analyse par western blot a révélé que le traitement des cellules avec le MG132 ou le bortézomib, 2 inhibiteurs du protéasome, augmentait significativement les niveaux de protéine CjCas9 dans les cellules HEK293T et HeLa. De plus, la quantification par ddPCR a montré que le traitement avec le bortézomib améliorait l'efficacité de la CjCas9 et augmentait le taux de correction du gène de FXN dans les cellules HEK293T. Finalement, les mutations hors cibles et la réaction immunitaire induite par la nucléase constituent un défi majeur pour le système CRISPR/Cas9. Dans mon troisième article, une approche par induction dénommée CRISPR-SCReT (CRISPR-Stop Codon Read Through) a été explorée pour réduire le temps d'expression de la CjCas9 afin de diminuer la réponse immune contre cette protéine et réduire les mutations hors cible (off-targets mutations). Pour valider ce système, des cellules HEK293T ont été co-transfectées avec un plasmide codant pour la CjCas9/2ARNgs, dans lequel le gène de la CjCas9 a été muté pour introduire un codon-stop prématuré (Premature Terminal Codon, PTC). Les cellules ont été traitées avec différentes doses de généticine (G418) pendant 48 h. Le western blot a confirmé que l'expression de la protéine Cas9, qui a été a réprimée par la mutation PTC, peut être induite par la G418. La délétion des GAAr a été détectée par PCR uniquement dans les cellules traitées avec la G418. L'approche a également été utilisée avec succès avec la SpCas9, une Cas9 provenant de Steptococcus pyogenes. L'ensemble de ces résultats montrent qu'il est possible d'enlever le GAAr dans certains organes avec la technologie CRISPR livrée par un seul AAV. La stabilisation temporaire de la CjCas9 a permis in vitro une augmentation du taux d'édition. La méthode CRISPR-SCReT a permis de contrôler l'expression de la Cas9 tout en permettant une édition génomique appréciable in vitro. Nos travaux contribuent à ouvrir une avenue pour le traitement de l'ataxie de Freidreich par la délétion des GAAr. / Friedreich's ataxia (FRDA), an autosomal recessive neurodegenerative disease, is the most common hereditary ataxia. It mainly affects individuals of the Caucasian race, and its prevalence is highly variable between regions ranging from 1/20,000 to 1/50,000 individual. This pathology is caused by an insertion of a series of GAA repeat (GAAr) in the first intron of the frataxin gene (FXN) leading to a decrease in the expression of this protein. According to several authors, the deletion of GAAr by CRISPR/Cas9 technology improves the expression of frataxin. Our hypothesis is that it is possible to deliver CRISPR/Cas9 technology components with a single AAV to induce deletion of GAAr to restore normal transcription of frataxin. However, the adeno-associated viruses (AAV) used for the delivery of the components of the CRISPR system in the organism face some challenges, i.e., the encapsidation limit of 4,7 kb and a constitutive expression of the nuclease, which can lead to deleterious effects. My first article aims to show that it is possible to develop components of CRISPR/Cas9 technology small enough to be delivered by a single AAV in vivo to suppress the GAAr. This treatment should restore normal transcription and increase frataxin expression. The CjCas9, a Cas9 derived from Campylabacter jejuni, was chosen because of its reduced size to meet the packaging limit challenge of using a single AAV. Thus, a single AAV9 encoding the CjCas9 protein and the two sgRNAs were administered intraperitoneally to two mouse models YG8sR (250 à 300 GAA) and YG8-800 (800 GAA) at 10-11 days of age. Four weeks after treatment, the highest concentrations of virus were detected in the liver and in the heart. The GAA deletion rate was 4.7% and 2.4% in the heart, 17.5% and 14.5% in the liver for YG8sR and YG8-800 mice respectively. The increase in frataxin mRNA did not reach a significant level except in the liver of YG8-800 mice, an organ in which a 14.5% edit was detected. In view of the editing rates observed, it seemed necessary to us to propose and test an approach to improve the efficiency of the CRISPR system. Thus, in my second article, proteasome inhibitors were used to increase the stability of the CjCas9 protein. In fact, protein analysis by western blot revealed that treatment of cells with MG132 or bortezomib, two inhibitors of proteasome, significantly increased CjCas9 protein levels in HEK293T and HeLa cells. More interestingly, quantification by ddPCR showed that bortezomib treatment improved the efficiency of CjCas9 to delete the GAAr region on the FXN gene in HEK293T cells. Off-target mutations and the nuclease-mediated immune response pose a major challenge for the CRISPR/Cas9 system. In my third article, an induction approach called CRISPR-SCReT (CRISPR-Stop Codon Read Through) was explored to reduce the expression time of Cas9 to reduce the immune response and off-targets. To validate this system, HEK293T cells were co-transfected with a plasmid encoding CjCas9/2gsRNA. The CjCas9 gene in that plasmid was mutated to introduce a premature terminal codon (PTC). The cells were treated with different doses of geneticin (G418) for 48 h. Western blot confirmed that the expression of the CjCas9 protein, which was repressed by the PTC mutation, can be induced by the drug. GAAr editing was detected by PCR only in cells treated with G418. The approach has also been used successfully with the SpCas9, a Cas9 derived from Steptococcus pyogenes. All these results show that it is possible to remove GAAr in certain organs with CRISPR technology delivered in a single AAV. The temporary stabilization of CjCas9 allowed an increase in the editing rate in vitro. The CRISPR-SCReT method has made it possible to control the expression of Cas9 with appreciable genomic editing in vitro. Our work contributes to opening an avenue for the treatment of Freidreich's ataxia by the deletion of GAAr.

L’ataxie de Friedreich (FRDA) est la plus fréquente des ataxies héréditaires autosomiques récessives. FRDA est due à une mutation du gène de la frataxine (FXN) situé sur le chromosome 9, q13. Cette mutation est une augmentation du nombre de répétitions du trinucléotide GAA au niveau du 1er intron du gène de la frataxine (FXN). Le nombre de trinucléotides augmente de moins 30 chez les sujets normaux jusqu’à 1300 chez les patients. Cela a pour conséquence de diminuer l’expression de la protéine frataxine, une protéine qui joue un rôle important dans le métabolisme du fer dans la mitochondrie. Monprojet traite de l’utilisation des protéines TALE-platinum (plTALE) fusionnées avec des systèmes permettant une stimulation de la transcription(FT), tel que VP64 ou P300. Ces plTALEs ciblent spécifiquement la région régulatrice du gène FXN pour augmenter sa transcription et ainsi induire une augmentation de l’expression de la protéine frataxine. Les plTALEs contiennent des variations au niveau des acides aminés 4 et 30 pour chaque RVD (Repeat Variable Di-residues) en plus des variations des acides aminés 12 et 13. Ces variations permettent d’augmenter la spécificité des plTALEs pour les séquences nucléotidiques ciblées. L’assemblage des RVD de plTALEs a été fait par 4-modules RVD ce qui permet d’obtenir un rendement d’assemblage de 100%. Nous avons produit 34 effecteurs plTALE-FT qui ciblent 14 séquences du gène FXN afin, de sélectionner 3 plTALE-VP64 et 2 plTALE-SunTag10X qui peuvent augmenter la transcription et l’expression du gène FXN de 2 fois jusqu’à 19 fois dans les différentes cellules modèles FRDA. Nous avons quantifié le taux de synthèse des ARNm et de la protéine FXN après le traitement in vitroavecces plTALEs-FT par qRT-PCR et westerns. Les résultats montrent que ces plTALES-FT sélectionnés induisent l’activité transcriptionnelle du gène endogène FXN, ainsi que l’expression de la protéine frataxine in vitro. L’augmentation de la frataxine augmente l’activité d’aconitase qui est modulée réversiblement par le niveau de la frataxine dans la mitochondrie. Nous avons utilisé un virus AAV9 pour livrer plTALE-FT dans les souris modèles de FRDA dans le but de valider l’efficacité de ces effecteurs in vivoavant de passer aux tests précliniques. Les résultats de ces traitements in vivo ne sont pas encore disponibles. / Friedreich's ataxia (FRDA) is the most frequent autosomal recessive hereditary ataxia. FRDA is due to a mutation of the frataxin gene (FXN) located on chromosome 9, q13. This mutation is an increase in the number of repetitions of the trinucleotide GAA in the 1st intron of the frataxine gene (FXN). The number of trinucleotides increases from less than 30 in normal subjects up to 1300 in patients. This decreases the expression of the protein frataxin, a protein which plays an important role in the metabolism of iron in the mitochondria. My project deals with the use of TALE-platinum (plTALE) proteins fused with transcription-enhancing systems (FT), such as VP64 or P300. These plTALEs specifically target the regulatory region of the FXN gene to increase its transcription and thusinduce an increase in the expression of the frataxin protein.The plTALEs contain variations in amino acids 4 and 30 for each Repeat Variable Diresidues in addition to the variations of amino acids 12 and 13. These variations make it possible to increase the specificity of the plTALEs for the targeted nucleotide sequences. The assembly of the RVDs of plTALEs was done using modules containing 4 RVDs, which makes it possible to obtain anassembly efficiency of 100%. We produced 34 plTALE-FT effectors that target 14 sequences of the FXN gene to select 3 plTALE-VP64 and 2 plTALE-SunTag10X, which increased FXN gene transcription and expression by up to 19-folds in different FRDA model cells. We quantified the synthesis of mRNAs and of FXN protein after in vitro treatment with these plTALEs-FT by qRT-PCR and westerns. The results show that these selected PlTAL-FT induced the transcription of the endogenous FXN gene as well as the expression of the frataxin protein in vitro. The increase in frataxin increased the aconitase activity, which is modulated reversibly by the level of frataxin in the mitochondria. We used an AAV9 virus to deliver plTALE-FT in FRDA model mice to validate the efficacy of these effectors in vivobefore proceeding to preclinical testing. The results of these in vivotreatments are not yet available.

L’effet de proximité est essentiel à la réussite de la stratégie thymidine kinase (HSV-tk)/ganciclovir (GCV) dans le traitement du cancer. Cette propriété correspond au transfert de GCV phosphorylé des cellules tumorales HSV-tk+ vers les cellules tumorales HSV-tk–, et est essentiellement médiée par les jonctions gap (JGs) constituées de molécules de connexine (Cx). Une perte d’expression et/ou une localisation périnucléaire des connexines est souvent décrite dans les tumeurs, ce qui pourrait conduire, en théorie, à une diminution de l’efficacité du traitement HSV-tk/GCV. L’approche HSV-tk/GCV a été testée au cours d’essais cliniques pour le traitement du glioblastome bien que l’expression de la Cx43 (principal constituant des JGs dans les astrocytes) ne soit parfaitement définie. Au cours de mes travaux, l’expression de la Cx43, sa localisation et sa fonctionnalité ont été étudiées dans des lignées établies, des biopsies et des cultures primaires de glioblastome. Dans les trois lignées immortalisées de glioblastome étudiées, la Cx43 se retrouve essentiellement localisée dans les endosomes et les lysosomes comparativement aux cellules HeLa/Cx43 qui présentent une localisation membranaire de la Cx43. Des JGs ont été observées dans la lignée U87, mais très peu dans les lignées SKI-1 et U251. De façon surprenante, les lignées SKI-1 et U87 présentent une capacité jonctionnelle supérieure à celle des cellules HeLa/Cx43. De plus, un important effet de proximité a pu être mesuré dans les cellules SKI-1 et U87 suite au traitement par le GCV. L’utilisation d’un inhibiteur spécifique de la perméabilité des JGs a confirmé que l’effet de proximité induit dans ces lignées est principalement dû aux JGs. De plus, la transfection d’un mutant dominant négatif de la Cx43 ou de siARN spécifiques des ARNm de la Cx43 a permis d’identifier la Cx43 comme le principal constituant des JGs dans ces lignées de glioblastome. L’expression de la Cx43 a été mesurée sur soixante-quatorze biopsies de glioblastome. Si son expression est souvent plus faible que dans le tissu sain, seulement 23% des échantillons sont dépourvus de Cx43. Huit lignées primaires ont été dérivées de résections de patients, et sept d’entre elles expriment la Cx43, cependant à différents niveaux d’intensité. Quatre lignées démontrent une localisation cytoplasmique de la Cx43. Malgré la localisation cytoplasmique prédominante de la Cx43, ces cellules sont capables de communiquer entre elles efficacement comme l’essai de double marquage en cytométrie de flux l’a démontré. Un vecteur lentiviral contenant le gène HSV-tk a été construit afin de mener les tests d’effet de proximité. Il a ainsi été mis en évidence que quelle que soit la localisation de la Cx43, l’effet de proximité est significatif dans toutes les lignées exprimant la Cx43 et inexistant lorsque la Cx43 n’est pas présente. Ces résultats démontrent que la Cx43 est exprimée dans la majorité des glioblastomes. La Cx43 peut être exprimée dans les lignées établies et les lignées primaires de glioblastome au niveau de la membrane plasmique ou dans le cytoplasme. Cette localisation aberrante ne bloque pas le transfert intercellulaire de molécules, ce qui suggère que les rares JGs présentes à la surface sont hautement fonctionnelles. Ces résultats indiquent que l’approche HSV-tk/GCV est un candidat valable pour le traitement du glioblastome, contrairement à d’autres tumeurs pour lesquelles la perte d’expression de Cx est bien documentée. Il serait ainsi intéressant que l’expression de la Cx43 soit étudiée dans les biopsies utilisées lors du diagnostic et constitue ainsi un prérequis pour le recrutement des patients lors d’essais cliniques. / The bystander effect is essential to the success of the Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk)/ganciclovir (GCV) strategy for cancer therapy. It consists of the transfer of phosphorylated GCV from HSV-tk+ cells to neighboring HSV-tk- cells, and it is mainly mediated via gap junctions that are made up of connexin molecules (Cx). Down-regulation and/or perinuclear localization of Cxs are common in tumors, and in theory it should decrease the efficacy of the HSV-tk/GCV treatment. The HSV-tk/GCV approach has been tested in glioblastoma patients although the status of Cx43 expression (the Cx member expressed in astrocytes) is unclear in this tumor type. In this study, we have carefully evaluated the Cx43 expression, specific localization and functionality in glioblastoma cell lines, biopsies and primary glioblastoma cell cultures. In the glioblastoma cell lines studied (SKI-1, U251 and U87), Cx43 accumulated mainly in late endosomes and lysosomes as compared to HeLa/Cx43 transfected cells that displayed Cx43 at the cellular membrane. Gap junctions were observed in U87 cells, but very few or rare plaques were present at the surface of SKI-1 and U251 cells, respectively. Surprisingly, calcein, a dye commonly used to assess the functionality of gap junctions, was able to diffuse more efficiently within U87 and SKI-1 cells than in HeLa/Cx43 cells. Furthermore, a strong bystander effect was mediated by HSV-tk+ SKI-1 and U87 cells treated with GCV. The use of a specific inhibitor of gap junction permeability, confirmed that the bystander effect in these cell lines was mainly due to gap junctions. Moreover, transfection of a Cx43 dominant negative mutant and specific siRNA against Cx43 mRNA defined this Cx subtype as the major component of gap junctions in these glioblastoma cell lines. The level of Cx43 expression was next assessed in seventy-four glioblastoma biopsies. Cx43 expression was mainly lower than in normal tissue, but only 23% of the glioblastoma samples studied lacked Cx43 expression. Eight glioblastoma primary cultures were derived from surgical resection, and seven of them expressed Cx43, although at different levels. A cytoplasmic localization of Cx43 was also observed in four primary cultures. Despite this predominant intracellular accumulation of Cx43, cells were able to communicate in an efficient manner as demonstrated with a dye transfer assay. A lentiviral vector containing HSV-tk has been constructed and bystander effect experiments with these primary glioblastoma cells were carried out. We noticed that the bystander effect was significative in primary cells expressing Cx43 wherever the Cx43 was localized, and no bystander effect was detected in cells without Cx43 expression. Our results indicate that Cx43 is expressed in the majority of glioblastomas. Cx43 can be found in glioblastoma cell lines and primary cultures at the cell surface, but also in perinuclear areas. This aberrant localization of Cx43 did not prevent the diffusion of molecules, suggesting that the few gap junction plaques present in glioblastoma cells are highly functional. These results suggest that glioblastoma is a suitable candidate for the HSV-tk/GCV approach contrary to some other tumor types in which the lack of Cx has been well documented. According to these results, the level of Cx43 should be tested in patient biopsies used for diagnostics and considered for patient enrollment in clinical trials.

Les anticorps (Ac) marqués à l'aide de phthalocyanines (Pc) ont un grand potentiel d'applications pour des essais d'immunofluorescence tout comme pour la thérapie photodynamique (PDT). La PDT est une forme relativement nouvelle de traitement du cancer ou d'autres maladies bénignes tel le psoriasis. Cette technique implique l'administration et l'activation par la lumière d'un photosensibilisateur localisé préférentiellement au niveau des cellules cancéreuses ou en croissance intense. La plupart des photosensibilisateurs utilisés pour la PDT sont de type porphyrine tels les Pcs. Dans cette étude, nous utilisons différentes phthalocyanines hautement solubles dans l'eau. Notre étude est basée sur l'utilisation d'anticorps monoclonaux comme vecteur des Pcs et comporte deux volets distincts. Tout d'abord l'utilisation des Pcs comme fluorochrome et finalement l'utilisation des complexes OKT3-AlPcS[indice inférieur 3]A[indice inférieur 1] dans l'amélioration de la PDT. Les Pcs sont liés de façon covalente aux Ac monoclonaux via une chaîne carboxy activée du Pc par la méthode de carbodiimide/N-hydroxysulfosuccinimide. Le complexe OKT3-AlPcS[indice inférieur 3]A[indice inférieur 1] lié à l'antigène de la surface cellulaire des cellules Jurkat CD3+ est visualisé par un trieur en cryométrie de flux (FACSCAN) et la phototoxicité in vitro est déterminée par un essai colorimétrique (test MTT). Nous avons donc produit un Ac de très bonne pureté et confirmé par cryométrie de flux la conservation de l'activité et de la spécificité de la liaison de l'Ac pour le récepteur après liaison covalente avec le Pc. Nous sommes ainsi les premiers à proposer l'utilisation des Pcs comme fluorochrome. Nous avons de plus vérifié la cytotoxicité médiée par le complexe qui s'est avérée non spécifique au clone cellulaire exprimant le récepteur CD3 reconnu par l'Ac. Nous proposons deux mécanismes de liaison du complexe OKT3-AlPcS[indice inférieur 3]A[indice inférieur 1] au niveau des cellules."--Résumé abrégé par UMI.

Il est maintenant admis que l’activité anti-tumorale du TNF implique une destruction de la vascularisation de la tumeur par induction d’apoptose des cellules endothéliales. Si le traitement au TNF en thérapie humaine permet des rémissions complètes, il n’est applicable qu’aux membres isolés de la circulation systémique car les doses requises de TNF sont létales pour le patient. Mettre en évidence les mécanismes qui contrôlent l’apoptose de la cellule endothéliale devrait permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques favorisant l’effet thérapeutique du TNF tout en évitant le choc septique qu’il engendre. Nous avons abordé cette question en utilisant le modèle de la cellule endothéliale d’aorte bovine (BAEC) stimulée au TNF afin d’étudier les mécanismes qui contrôlent le processus apoptotique et ce au cours des phases précoces de celui-ci. D’une part, nous avons identifié par une approche pharmacologique au moins trois voies de contrôle négatif d’induction de mort cellulaire par le TNF dans les cellules endothéliales : la première faisant intervenir une des protéines kinases C, une seconde la PI3-kinase et une troisième la protéine kinase p38. Cette dernière semble spécifiquement activée par le TNF et pourrait donc constituer une nouvelle cible pharmacologique visant à sensibiliser les cellules endothéliales de la vascularisation de la tumeur à l’action apoptotique du TNF. D’autre part nous avons mis en évidence et identifié par une approche protéomique au moins deux protéines montrant une rapide diminution de phosphorylation lorsque les cellules endothéliales sont stimulées par le TNF en présence de cycloheximide. Ces deux événements semblent en aval de l’activation d’une protéase de la famille des caspases. La première protéine est la sous-unité régulatrice de type II alpha (RIIα) de la protéine kinase A. Cependant, la relation entre cette déphosphorylation et le processus d’apoptose n’a pas pu être mise en évidence, une stimulation de l’activité PKA n’affectant pas l’induction d’apoptose des BAEC. La seconde est la protéine HDGF, connue pour être sur-exprimée dans certains cancers, mais dont la régulation par phosphorylation ainsi que son implication éventuelle lors du processus apoptotique n’avaient encore jamais été envisagées. Enfin, nous avons voulu mettre en évidence le rôle potentiel de la protéine hnRNP K qui subit une modification post-traductionnelle précoce lors de l’apoptose des BAEC. Notre étude, menée après surexpression de la protéine étiquetée, suggère une modification autre qu’une dégradation. Cependant, il ne nous a pas été permis de lui attribuer un rôle puisque la surexpression de cette protéine n’affecte pas l’apparition de différents marqueurs associés à l’apoptose.