Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / L'ataxie de Friedreich (FRDA), une maladie neurodégénérative autosomique récessive, est l'ataxie héréditaire la plus fréquente dans le monde. Elle touche principalement les individus de race caucasienne, et sa prévalence est très variable entre les régions allant de 1/20 000 à 1/50 000. Cette pathologie est causée majoritairement par une insertion d'une série de répétition GAA (GAAr) dans le premier intron du gène de la frataxine (FXN) conduisant à une diminution de l'expression de cette protéine. Selon plusieurs auteurs, la délétion des GAAr par la technologie CRISPR/Cas9 permet d'améliorer la synthèse de la frataxine. Notre hypothèse est qu'il est possible de livrer les composants de la technologie CRISPR/Cas9 dans un seul AAV pour induire une délétion des GAAr afin de restaurer une transcription normale de la frataxine. Cependant, les virus adéno-associés (AAV) utilisés pour la livraison des composants du système CRISPR dans l'organisme font face à certains défis : une limite d'encapsidation (4,7 kb) et une expression constitutive de la nucléase qui peut entraîner des effets délétères. Mon premier article, vise à démontrer que pour supprimer la répétition GAA dans les cellules in vivo, il est possible d'utiliser certains composants de la technologie CRISPR/Cas9 suffisamment petits pour être incorporés dans un seul AAV. Ce traitement devrait restaurer une transcription normale et augmenter ainsi l'expression de la frataxine. La Cas9 dérivé de Campylabacter jejuni (CjCas9) est la plus petite Cas9 identifiée jusqu'à ce jour et peut permettre aux composants du système CRISPR d'être inclus dans un seul AAV. Ainsi, un AAV9 codant pour la protéine CjCas9 et deux ARNgs a été administré par voie intrapéritonéale à deux modèles de souris YG8sR (250 à 300 GAA) et YG8-800 (800 GAA) à l'âge de 10 - 11 jours. Quatre semaines après le traitement, les plus fortes concentrations de virus ont été détectées dans le foie et dans le cœur. Le taux de délétion des GAA était de 4,7 % et 2,4 % dans le cœur, 17,5 % et 14,5 % dans le foie pour les souris YG8sR et YG8-800 respectivement. L'ARNm de la frataxine n'a augmenté significativement que dans le foie des souris YG8-800, organe dans lequel une édition de 14,5 % avait été détectée. Au regard des taux d'édition observés, il nous a semblé nécessaire de proposer et tester une approche pour améliorer l'efficacité du système CRISPR. Ainsi, dans mon deuxième article, les inhibiteurs du protéasome ont été utilisés pour augmenter la stabilité de la protéine CjCas9. De ce fait, une analyse par western blot a révélé que le traitement des cellules avec le MG132 ou le bortézomib, 2 inhibiteurs du protéasome, augmentait significativement les niveaux de protéine CjCas9 dans les cellules HEK293T et HeLa. De plus, la quantification par ddPCR a montré que le traitement avec le bortézomib améliorait l'efficacité de la CjCas9 et augmentait le taux de correction du gène de FXN dans les cellules HEK293T. Finalement, les mutations hors cibles et la réaction immunitaire induite par la nucléase constituent un défi majeur pour le système CRISPR/Cas9. Dans mon troisième article, une approche par induction dénommée CRISPR-SCReT (CRISPR-Stop Codon Read Through) a été explorée pour réduire le temps d'expression de la CjCas9 afin de diminuer la réponse immune contre cette protéine et réduire les mutations hors cible (off-targets mutations). Pour valider ce système, des cellules HEK293T ont été co-transfectées avec un plasmide codant pour la CjCas9/2ARNgs, dans lequel le gène de la CjCas9 a été muté pour introduire un codon-stop prématuré (Premature Terminal Codon, PTC). Les cellules ont été traitées avec différentes doses de généticine (G418) pendant 48 h. Le western blot a confirmé que l'expression de la protéine Cas9, qui a été a réprimée par la mutation PTC, peut être induite par la G418. La délétion des GAAr a été détectée par PCR uniquement dans les cellules traitées avec la G418. L'approche a également été utilisée avec succès avec la SpCas9, une Cas9 provenant de Steptococcus pyogenes. L'ensemble de ces résultats montrent qu'il est possible d'enlever le GAAr dans certains organes avec la technologie CRISPR livrée par un seul AAV. La stabilisation temporaire de la CjCas9 a permis in vitro une augmentation du taux d'édition. La méthode CRISPR-SCReT a permis de contrôler l'expression de la Cas9 tout en permettant une édition génomique appréciable in vitro. Nos travaux contribuent à ouvrir une avenue pour le traitement de l'ataxie de Freidreich par la délétion des GAAr. / Friedreich's ataxia (FRDA), an autosomal recessive neurodegenerative disease, is the most common hereditary ataxia. It mainly affects individuals of the Caucasian race, and its prevalence is highly variable between regions ranging from 1/20,000 to 1/50,000 individual. This pathology is caused by an insertion of a series of GAA repeat (GAAr) in the first intron of the frataxin gene (FXN) leading to a decrease in the expression of this protein. According to several authors, the deletion of GAAr by CRISPR/Cas9 technology improves the expression of frataxin. Our hypothesis is that it is possible to deliver CRISPR/Cas9 technology components with a single AAV to induce deletion of GAAr to restore normal transcription of frataxin. However, the adeno-associated viruses (AAV) used for the delivery of the components of the CRISPR system in the organism face some challenges, i.e., the encapsidation limit of 4,7 kb and a constitutive expression of the nuclease, which can lead to deleterious effects. My first article aims to show that it is possible to develop components of CRISPR/Cas9 technology small enough to be delivered by a single AAV in vivo to suppress the GAAr. This treatment should restore normal transcription and increase frataxin expression. The CjCas9, a Cas9 derived from Campylabacter jejuni, was chosen because of its reduced size to meet the packaging limit challenge of using a single AAV. Thus, a single AAV9 encoding the CjCas9 protein and the two sgRNAs were administered intraperitoneally to two mouse models YG8sR (250 à 300 GAA) and YG8-800 (800 GAA) at 10-11 days of age. Four weeks after treatment, the highest concentrations of virus were detected in the liver and in the heart. The GAA deletion rate was 4.7% and 2.4% in the heart, 17.5% and 14.5% in the liver for YG8sR and YG8-800 mice respectively. The increase in frataxin mRNA did not reach a significant level except in the liver of YG8-800 mice, an organ in which a 14.5% edit was detected. In view of the editing rates observed, it seemed necessary to us to propose and test an approach to improve the efficiency of the CRISPR system. Thus, in my second article, proteasome inhibitors were used to increase the stability of the CjCas9 protein. In fact, protein analysis by western blot revealed that treatment of cells with MG132 or bortezomib, two inhibitors of proteasome, significantly increased CjCas9 protein levels in HEK293T and HeLa cells. More interestingly, quantification by ddPCR showed that bortezomib treatment improved the efficiency of CjCas9 to delete the GAAr region on the FXN gene in HEK293T cells. Off-target mutations and the nuclease-mediated immune response pose a major challenge for the CRISPR/Cas9 system. In my third article, an induction approach called CRISPR-SCReT (CRISPR-Stop Codon Read Through) was explored to reduce the expression time of Cas9 to reduce the immune response and off-targets. To validate this system, HEK293T cells were co-transfected with a plasmid encoding CjCas9/2gsRNA. The CjCas9 gene in that plasmid was mutated to introduce a premature terminal codon (PTC). The cells were treated with different doses of geneticin (G418) for 48 h. Western blot confirmed that the expression of the CjCas9 protein, which was repressed by the PTC mutation, can be induced by the drug. GAAr editing was detected by PCR only in cells treated with G418. The approach has also been used successfully with the SpCas9, a Cas9 derived from Steptococcus pyogenes. All these results show that it is possible to remove GAAr in certain organs with CRISPR technology delivered in a single AAV. The temporary stabilization of CjCas9 allowed an increase in the editing rate in vitro. The CRISPR-SCReT method has made it possible to control the expression of Cas9 with appreciable genomic editing in vitro. Our work contributes to opening an avenue for the treatment of Freidreich's ataxia by the deletion of GAAr.

L’ataxie de Friedreich (FRDA) est la plus fréquente des ataxies héréditaires autosomiques récessives. FRDA est due à une mutation du gène de la frataxine (FXN) situé sur le chromosome 9, q13. Cette mutation est une augmentation du nombre de répétitions du trinucléotide GAA au niveau du 1er intron du gène de la frataxine (FXN). Le nombre de trinucléotides augmente de moins 30 chez les sujets normaux jusqu’à 1300 chez les patients. Cela a pour conséquence de diminuer l’expression de la protéine frataxine, une protéine qui joue un rôle important dans le métabolisme du fer dans la mitochondrie. Monprojet traite de l’utilisation des protéines TALE-platinum (plTALE) fusionnées avec des systèmes permettant une stimulation de la transcription(FT), tel que VP64 ou P300. Ces plTALEs ciblent spécifiquement la région régulatrice du gène FXN pour augmenter sa transcription et ainsi induire une augmentation de l’expression de la protéine frataxine. Les plTALEs contiennent des variations au niveau des acides aminés 4 et 30 pour chaque RVD (Repeat Variable Di-residues) en plus des variations des acides aminés 12 et 13. Ces variations permettent d’augmenter la spécificité des plTALEs pour les séquences nucléotidiques ciblées. L’assemblage des RVD de plTALEs a été fait par 4-modules RVD ce qui permet d’obtenir un rendement d’assemblage de 100%. Nous avons produit 34 effecteurs plTALE-FT qui ciblent 14 séquences du gène FXN afin, de sélectionner 3 plTALE-VP64 et 2 plTALE-SunTag10X qui peuvent augmenter la transcription et l’expression du gène FXN de 2 fois jusqu’à 19 fois dans les différentes cellules modèles FRDA. Nous avons quantifié le taux de synthèse des ARNm et de la protéine FXN après le traitement in vitroavecces plTALEs-FT par qRT-PCR et westerns. Les résultats montrent que ces plTALES-FT sélectionnés induisent l’activité transcriptionnelle du gène endogène FXN, ainsi que l’expression de la protéine frataxine in vitro. L’augmentation de la frataxine augmente l’activité d’aconitase qui est modulée réversiblement par le niveau de la frataxine dans la mitochondrie. Nous avons utilisé un virus AAV9 pour livrer plTALE-FT dans les souris modèles de FRDA dans le but de valider l’efficacité de ces effecteurs in vivoavant de passer aux tests précliniques. Les résultats de ces traitements in vivo ne sont pas encore disponibles. / Friedreich's ataxia (FRDA) is the most frequent autosomal recessive hereditary ataxia. FRDA is due to a mutation of the frataxin gene (FXN) located on chromosome 9, q13. This mutation is an increase in the number of repetitions of the trinucleotide GAA in the 1st intron of the frataxine gene (FXN). The number of trinucleotides increases from less than 30 in normal subjects up to 1300 in patients. This decreases the expression of the protein frataxin, a protein which plays an important role in the metabolism of iron in the mitochondria. My project deals with the use of TALE-platinum (plTALE) proteins fused with transcription-enhancing systems (FT), such as VP64 or P300. These plTALEs specifically target the regulatory region of the FXN gene to increase its transcription and thusinduce an increase in the expression of the frataxin protein.The plTALEs contain variations in amino acids 4 and 30 for each Repeat Variable Diresidues in addition to the variations of amino acids 12 and 13. These variations make it possible to increase the specificity of the plTALEs for the targeted nucleotide sequences. The assembly of the RVDs of plTALEs was done using modules containing 4 RVDs, which makes it possible to obtain anassembly efficiency of 100%. We produced 34 plTALE-FT effectors that target 14 sequences of the FXN gene to select 3 plTALE-VP64 and 2 plTALE-SunTag10X, which increased FXN gene transcription and expression by up to 19-folds in different FRDA model cells. We quantified the synthesis of mRNAs and of FXN protein after in vitro treatment with these plTALEs-FT by qRT-PCR and westerns. The results show that these selected PlTAL-FT induced the transcription of the endogenous FXN gene as well as the expression of the frataxin protein in vitro. The increase in frataxin increased the aconitase activity, which is modulated reversibly by the level of frataxin in the mitochondria. We used an AAV9 virus to deliver plTALE-FT in FRDA model mice to validate the efficacy of these effectors in vivobefore proceeding to preclinical testing. The results of these in vivotreatments are not yet available.

L’Ataxie de Friedreich est une maladie génétique rare et grave, associant une neurodégénérescence, une cardiomyopathie et un diabète. Elle est causée par une réduction drastique d’une protéine mitochondriale appelée frataxine. L’approche de notre laboratoire sera donc de développer sur des cellules en culture et dans un modèle animal une thérapie moléculaire qui aura pour but de fournir aux cellules une protéine frataxine recombinante et réduire si possible les symptômes de la maladie. Afin de permettre la transduction de la frataxine, nous l'avons fusionné à un domaine de transduction protéique (Cell Penetrating Peptides, CPP) comme Tat ou Pep-1. Ces peptides sont bien connus pour leur capacité d’acheminer, dans les cellules, les protéines auxquelles ils sont fusionnés par des vésicules d’endocytose, mais également d’être libérées de ces derniers pour participer au métabolisme de la cellule. Des observations préliminaires obtenues, nous concluons que les protéines Tat-Frataxine et Pep-1-Frataxine assurent in vitro et in vivo la viabilité des cellules déficientes en frataxine endogène. / Friedreich Ataxia is a rare and serious genetic disease involving neurodegeneration, cardiomyopathy and diabetes. It is caused by a drastic reduction of a mitochondrial protein called frataxin. The approach of the laboratory will be to develop on in vitro cells and in vivo mice models, a molecular therapy that will aim to provide the cells with a recombinant protein frataxin and if possible reduce the symptoms of the disease. To enable transduction of frataxin, we fused it to a protein transduction domain (Cell Penetrating Peptides, CPP), Tat or Pep-1. These peptides are well known for their ability to allow the penetration into the cells of the proteins to which they are fused through endocytosis vesicles, but also to be released from these vesicles to take part in the cell metabolism. Preliminary observations led us to conclude that the Tat-Frataxin and Pep-1-Frataxin protein enhance in vitro and in vivo the viability of cells deficient in endogenous frataxin.

L'ataxie de Friedreich (FRDA est la plus fréquente ataxie neurodégénérative invalidante. Elle est une maladie héréditaire récessive progressive qui touche sévèrement le système nerveux et cardiaque. La FRDA pose non seulement un défis de thérapie curative mais aussi celui du modèle animal reproduisant la symptomatologie. Dépendant du nombre de répétitions GAA, les souris modèles, telles que les souris YG8sR contenant entre 250-300 GAA, présentent un phénotype plus ou moins sévère. Notre étude a pour but d'accentuer le phénotype des souris YG8sR en utilisant des short hairpin ARNs (shARNs) ciblant l'ARNm de la frataxine pour réduire l'expression de cette protéine. Nous avons pu, après un test d'efficacité des shARNs in vitro dans les cellules HeLa et HEK 293T, choisir 2 shARNs parmi les 4 testés capables de réduire le taux de frataxine. Nous avons sélectionné les shARN6 et shARN1 qui étaient capables après la transfection dans les cellules à 2 µg d'ADN de réduire respectivement de 40% et 70% le taux de frataxine dans les cellules. Lorsque nous avons injecté en intraveineuse 1.2X10¹² ou 2.4X10¹² copies d'AAV-PHP.B codant pour ces shARNs, nous avons observé une perte de poids, des troubles de la motricité et de la coordination, ainsi qu'une diminution de la force motrice chez les souris YG8sR ayant reçu du shARN1 à 1.2X10¹². Nous avons donc développé un modèle amélioré de souris (Imp-YG8sR) en réduisant davantage l'expression de la frataxine avec cette dose de shARN1. Le phénotype plus sévère de ces souris est plus proche de celui des patients atteints de l'ataxie de Friedreich que le modèle original YG8sR utilisé sans les shARNs. Notre modèle de souris Imp-YG8sR sera donc bénéfique pour des tests de thérapies géniques actuellement en développement. / Friedreich's ataxia (FRDA) is the most common disabling neurodegenerative ataxia. It is a progressive recessive inherited disease that severely affects the nervous and cardiac systems. FRDA poses not only a challenge of curative therapy but also that of the animal model reproducing the symptomatology. Depending on the number of GAA repeats, mouse models, such as YG8sR containing between 250-300 GAA, exhibit a more or less severe phenotype. Our study aims to enhance the phenotype of YG8sR mice by using short hairpin RNAs (shRNAs) targeting the frataxin mRNA to reduce the expression of this protein. We were able, after an in vitro efficacy test of the shRNAs in HeLa and HEK 293T cells, to choose 2 shRNAs among the 4 tested, to reduce the frataxin level. We selected shARN6 and shARN1 which were able to reduce the frataxin level by up to 40% and 70%, respectively in cells, when injected intravenously at 1.2X10¹² or 2.4X10¹² copies of AAV-PHP.B encoding these shRNAs. We observed a loss of weight, a disturbance of the motor skills, a reduced coordination and force in the YG8sR mice, which received the shRNA1 at 1.2X10¹². We have therefore developed an improved mouse model (Imp-YG8sR) by further reducing the expression of frataxin with this dose of shRNA1. The more severe phenotype of the Imp-YG8sR is closer to that of patients with Friedreich's ataxia than the original model used without the shRNAs. Our Imp-YG8sR mouse model will therefore be beneficial for gene therapies currently in development.

La mitochondrie est une organite ayant un rôle central dans le métabolisme énergétique de la cellule. Bien que la mitochondrie exprime son propre génome, plusieurs protéines et ARN non-codants issus du génome nucléaire sont nécessaires à la biogenèse et aux fonctions mitochondriales. Les microARNs (miRNAs) sont de petits ARN non-codants qui s'associent à la protéine Argonaute 2 (Ago2) pour moduler l'expression génique au niveau post-transcriptionnelle par ARN interférence. Classiquement, les miRNAs s’apparient à des sites de liaison complémentaires situés dans le 3’-UTR de l’ARNm cible. Nous faisons l'hypothèse que les miRNAs seraient impliqués dans la communication entre le noyau et la mitochondrie. Notre travail a donc porté sur l’étude du rôle des miRNAs dans le contexte de maladies génétiques caractérisées par une dysfonction mitochondriale. Nous avons choisi d’étudier l’ataxie de Friedreich, la plus fréquente des ataxies héréditaires, qui est causée par un déficit d’expression de la protéine mitochondriale frataxine (FXN). Nous avons montré qu'environ 90% de patients étaient homozygotes pour un haplotype spécifique des variants génétiques du 3'-UTR du gène FXN. Ce résultat a été retrouvé dans deux cohortes de patients indépendantes. Par une combinaison d’approche bioinformatique et d’expériences de co-transfections, nous avons montré que les miRNAs, et en particulier miR-124, ciblent les variants du 3’-UTR. En parallèle, nous avons évalué la possibilité que les miRNAs ciblent directement la mitochondrie. Pour cela, nous avons analysé l’expression des miRNAs dans des fractions d'ARN mitochondriale et cytosolique isolées à partir de mêmes cellules HeLa. Nous avons identifié une signature de 13 miRNAs spécifiquement enrichis dans la fraction d'ARN mitochondriale que nous avons appelé «mitomiRs». Nos prédictions ont révèle des fonctions spécifiques de ces mitomiRs à la mitochondrie, y compris la modulation de l'activité de la chaîne respiratoire. Nous avons également montré une localisation de la protéine Ago2 à l’espace inter-membranaire mitochondriale.Notre travail définit ainsi les miRNAs et Ago2 comme un nouveau niveau de communication entre le noyau et les mitochondries. Nous discutons de la possibilité que la mitochondrie agisse comme acteur du ARN interférence ou plutôt comme organite cible. Notre travail ouvre la voie à un nouveau domaine de recherche, qui pourrait avoir une utilité thérapeutique pour palier les dysfonctions mitochondriales. / Mitochondria are organelles that have a central role in the energetic metabolism of the cell. Although mitochondria express their own genome, they rely on the expression of the nuclear genome for their biogenesis and function. microRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs that associate with Argonaute 2 (Ago2) protein to regulate gene expression post-transcriptionallythrough RNA interference. The ‘classic’ view of RNA interference describes the pairing of miRNAs with complementary binding sites within the 3’untranslated region (3’-UTR) of the target mRNA. We hypothesized that miRNAs might be instrumental to the cross-talk between the nucleus and the mitochondria. In the first part, we assessed the role of miRNAs in the context of a rare genetic disease involving mitochondrial dysfunction. We focused on Friedreich's ataxia, the most frequent of inherited ataxia in Europe, which is caused by reduced expression of the mitochondrial protein frataxin (FXN). Intwo independent cohorts of patients, we discovered that about 90% of patients were homozygous forone specific haplotype of genetic variants of the FXN3'-UTR. By a combination of computational target prediction analysis and co-transfection experiments, we showed that miRNAs, and specifically miR-124, are involved in the regulation of the FXN.We then challenged further the relationship between the miRNAs and mitochondria through questioning their localization at mitochondria. To this end, we studied miRNAs from mitochondrial and cytosolic RNA fractions isolated from the same HeLa cells. We identified a signature of 13 miRNAs specifically enriched in the mitochondrial RNA fraction that we termed ‘mitomiRs’. Through pathway-enrichement analysis, we observed a specific mitochondrial role for mitomiRs, including regulation of ATP synthesis coupled electron trasport. We also provided the evidence of Ago2 protein location inside human mitochondria at the inter-membrane space. Our work sketches miRNAs and Ago2 as a novel layer of the interplay between the nucleus and the mitochondria. We discuss whether mitochondria may be instrumental to RNA interference or a target per se. Our work paves the way to a new field of research, which may unravel therapeutic outcomes to rescue mitochondrial dysfunction.

L’ataxie de Friedreich (AF) est une maladie neurodégénérative récessive due à un déficit en frataxine, une protéine mitochondriale très conservée. Elle est souvent associée à une atteinte cardiaque. Le déficit en frataxine est responsable d’une diminution de l’activité des enzymes Fe-Set d’une accumulation mitochondriale de fer. Les cellules pluripotentes induites (iPS) générées par reprogrammation de cellules somatiques constituent un outil puissant pour le développement de modèles de maladies monogéniques. Les cardiomyocytes obtenus par différenciation des iPS de patients AF développent une atteinte mitochondriale après 1 mois en culture. Celle-ci se complète par l’apparition secondaire de dépôts de fer, visibles après 4 mois en culture, indiquant une progression dans la physiopathologie de la maladie. Notre étude montre la capacité de ces cardiomyocytes à modéliser le phénotype cardiaque de l’AF, offrant ainsi l’opportunité d’approfondir leur caractérisation physiopathologique. / Friedreich’s ataxia (FA) is a recessive neurodegenerative disorder due to a deficit of frataxin, a highly conserved mitochondrial protein. It is commonly associated with a hypertrophic cardiomyopathy. The main pathophysiological consequences are a decrease of Fe-S enzyme activities and mitochondrial iron accumulation. The recent technical advances in the generation of induced pluripotent stem cells (iPS) from somatic cells provide a powerful tool to create disease specific cellular models. Cardiomyocytes derived from FA-iPS present altered mitochondria after 1 month in culture. After four months in culture, iron deposits can be found in degenerating mitochondria, indicating a progression in the pathophysiology of the disease. Our study illustrates the ability of iPS-derived cardiomyocytes to model the cardiac phenotype associated with FA, and offers new opportunities to further investigate pathological mechanisms linked to frataxin deficiency.

Les protéines à centre Fe-S sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires. In vivo, la formation des centres Fe-S est réalisée par des machineries multi-protéiques dont ISC et SUF, conservées chez les eucaryotes et les procaryotes. D’autres composants participent à la formation des centres Fe-S chez les eucaryotes, comme la frataxine (FXN). La FXN est une protéine présente chez l’homme, les plantes, la levure ou encore les bactéries à Gram négatif. Chez les eucaryotes, l’absence de FXN conduit à des phénotypes drastiques comme une accumulation de fer dans la mitochondrie, une diminution drastique de l’activité d’enzymes à centre Fe-S ou encore des dommages oxydatifs. Chez l’homme, un déficit en FXN est responsable d’une maladie neurodégénérative, l’ataxie de Friedreich. A la différence des eucaryotes, chez les procaryotes comme Escherichia coli, l’absence de CyaY, homologue bactérien de la FXN, ne conduit à aucun des phénotypes évoqués ci-dessus.Durant ma thèse, je me suis intéressée au rôle de CyaY chez E. coli. J’ai montré que, in vivo, CyaY favorise la formation des centres Fe-S via la machinerie ISC. Un lien génétique entre CyaY et IscX a également pu être établi, montrant que ces deux protéines participent à la formation des centres Fe-S in vivo. Je me suis ensuite intéressée aux bases moléculaires pouvant expliquer la différence entre les phénotypes liés à l’absence de FXN chez les eucaryotes et les procaryotes. J’ai montré que le résidu 108 de IscU joue un rôle clé pour la dépendance de CyaY. Enfin, pour mieux comprendre le rôle de CyaY chez E. coli, j’ai réalisé une approche globale en caractérisant le transcriptome du mutant ∆cyaY. / Fe-S cluster containing proteins are involved in many cellular processes such as respiration, DNA repair or gene regulation. In vivo, Fe-S cluster biogenesis is catalysed by specific protein machineries, ISC and SUF, conserved in both eukaryotes and prokaryotes. Frataxin (FXN) is a small protein found in humans, plants, yeast and Gram negative bacteria. In eukaryotes, a defect in FXN leads to drastic phenotypes such as mitochondrial iron accumulation, drastic decrease of Fe-S cluster protein activity, sensitivity to oxidants. In humans, FXN deficiency is responsible for the neurodegenerative disease, Friedreich’s ataxia. In prokaryotes like E. coli, a defect in CyaY, the bacterial FXN homolog, does not lead to significant phenotypes compared to the wild-type strain. During my thesis, I investigated the role of the bacterial FXN CyaY in E. coli. I showed that, in vivo, CyaY assisted the ISC-catalyzed Fe-S cluster biogenesis. A genetic link was also observed between cyaY and iscX, demonstrating that these proteins participate in Fe-S cluster biogenesis. In a second part, I investigated the differences between the impact of the eukaryotic versus prokaryotic FXN. I showed that the IscU 108th residue is crucial for the CyaY-dependency. Finally, I used a transcriptomic approach to test whether CyaY has a global role in E. coli.

L’ataxie de Friedreich est une maladie neurodégénérative sévère causée par un défaut d’expression de la frataxine (FXN), une petite protéine mitochondriale impliquée dans la biogenèse des centres fer-soufre (Fe/S), des groupement prosthétiques aux fonctions cellulaires essentielles. Chez les mammifères, il a été montré que la frataxine stimule la synthèse in vitro de centres Fe/S sur la protéine d’échaffaudage ISCU, grâce à l’augmentation de la production d’ions sulfures par le complexe NFS1-ISD11-ISCU. Cependant, le mécanisme par lequel la frataxine active la biogenèse des centres Fe/S n’a pas encore été défini. Nous avons étudié les effets de FXN sur les cinétiques de formation et de réduction des persulfures, des intermédiaires clés de la production d’ions sulfures, générés par la cystéiene désulfurase NFS1, à l’aide d’un test de détection des persulfures basé sur l’utilisation de composés synthétiques peptide-maléimide et de la spectrométrie de masse. Nous avons montré que FXN active deux réactions très similaires : la réduction du persulfure de NFS1 par des réducteurs à thiols comme le DTT, la L-cystéine et le glutathion et le transfert de soufre de NFS1 vers ISCU, conduisant à l’accumulation de persulfure sur la cystéine C104 d’ISCU. Nous avons constaté que la vitesse de réduction du persulfure d’ISCU par les thiols n’est pas affectée en présence de FXN et que ce persulfure est réduit plus lentement que celui de NFS1. Nous avons corrélé l’activation par FXN de la réduction du persulfure de NFS1 par les thiols à une stimulation de l’assemblage d’un centre Fe/S sur ISCU. Dans nos conditions expérimentales, l’atome de soufre du persulfure d’ISCU n’est pas incorporé dans le centre Fe/S synthétisé, mais nos résultats ne permettent pas d’exclure que ce persulfure puisse être réduit par une réductase dédiée, encore non identifiée. L’ensemble de nos données indiquent que le rôle de la frataxine est de contrôler la réduction du persulfure de NFS1, en augmentant les vitesses de transfert de soufre vers ISCU et de réduction du persulfure de NFS1 par les thiols. / Friedreich ataxia is a severe neurodegenerative disease caused by reduced expression of frataxin (FXN), a small mitochondrial protein involved in iron-sulfur (Fe/S) cluster biogenesis which are prostetic groups with essential cellular functions. It has been shown in vitro that mammalian FXN activates Fe/S cluster synthesis on the scaffold protein ISCU, by rising up suflide ion production by NFS1-ISD11-ISCU complex. However, the mechanism by which frataxin stimulates Fe/S cluster biogenesis has not been yet defined. We have studied the effect of FXN on the kinetics of formation and reduction of persulfides that are key intermediates of sulfide ion production generated by NFS1, using mass spectrometry and a new detection assay for persulfide based on gel-mobility shift following alkylation by maleimide-peptide compounds. We demonstrate that frataxin activates two similar reactions : sulfur transfer from cysteine desulfurase NFS1 to ISCU leading to accumulation of a persulfide on ISCUcysteine C104 and reduction of NFS1 persulfide by thiol reducers such as DTT, L-cysteine and glutathion. We have observed that FXN does not stimulate the rate of ISCU persulfide reduction by thiols and that this persulfide is reduced much more slowly than NFS1 persulfide. We have then correlated the reduction of NFS1 persulfide with Fe/S cluster assembly. Under our experimental conditions, the sulfur from ISCU persulfide is not incorporated into the Fe/S cluster. However, we cannot exclude that an as yet not identfiied reductase could reduces ISCU persulfide and trigger Fe/S cluster assembly. Overall, our data point to a regulatory function of FXN as an enhancer of persulfide reduction, stimulating the rates of sulfur transfer to ISCU and NFS1 persulfide.

Titre de l'écran-titre (visionné le 5 juin 2023) / Les maladies neuromusculaires héréditaires n'ont généralement pas de traitement efficace à ce jour. Deux d'entre elles sont étudiées par le laboratoire, soit l'ataxie de Friedreich (FRDA) et la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Il existe plusieurs modèles de souris pour la FRDA, mais aucun ne reflétait la dégénération progressive de la maladie au niveau locomoteur et cardiaque. Le but de mes travaux était donc de trouver et caractériser un modèle murin qui rendrait possible l'étude des effets d'un traitement de thérapie génique sur ces symptômes. Deux modèles de souris ont été comparés : 1) le YG8sR auquel un petit ARN en épingle à cheveux (shRNA) ciblant l'ARNm de la frataxine est injecté en IV pour tenter de réduire l'expression de cette protéine pour augmenter la sévérité des symptômes de la maladie et 2) le YG8-800 qui est un nouveau modèle prometteur possédant 800 répétitions de GAA. Le YG8-800 présente un phénotype qui modélise mieux l'évolution de la maladie chez l'humain avec une détérioration graduelle de la coordination corrélée à une diminution de la frataxine plus marquée. En effet, les souris YG8-800 font plus de fautes et nécessitent plus de temps pour traverser une poutre et T inversé ou dentée et restent suspendues moins longtemps sur une grille. Elles présentent aussi significativement moins de frataxine dans tous les organes étudiés que les souris YG8sR. Pour la DMD, le traitement étudié est la greffe de myoblastes qui consiste à injecter une suspension de myoblastes sains dans un muscle n'exprimant pas la dystrophine. Cette méthode vise à briser les fibres musculaires existantes pour y faire fusionner les cellules injectées et de ce fait apporter le matériel génétique pour synthétiser la dystrophine dans la fibre musculaire malade. En moyenne, le taux de survie à la procédure des cellules greffées est de 5% dans la littérature. L'expérience vise donc à optimiser les conditions de greffe pour augmenter la survie des myoblastes après la greffe. Le Célastrol est un composé reconnu pour son effet anti-inflammatoire et protecteur, il a donc été testé pour protéger les cellules. La première greffe indiquait une amélioration significative de la survie des cellules, mais la deuxième n'a pas reproduit cette tendance. D'autres expériences seront nécessaires pour déterminer si le Célastrol peut améliorer la survie des cellules greffées. / Hereditary neuromuscular diseases generally have no effective treatment to date. Two of them are being studied by my laboratory: Friedreich's ataxia (FRDA) and Duchenne muscular dystrophy (DMD). There are several mouse models for FRDA, but none reflected the progressive degeneration of the disease at the musculoskeletal and cardiac level. My goal was thus to find and characterize a model that will make it possible to study the effects of gene therapy treatments on these symptoms. I have compared two mouse models: 1) the YG8sR to which a short hairpin RNA (shRNA) targeting frataxin mRNA was i.v. injected to reduce the expression of frataxin to increase the severity of the symptoms and 2) the YG8-800, a promising new model with 800 GAA repeats. The YG8-800 has a phenotype that better reproduces the disease progression in humans with a gradual deterioration in coordination correlated due to a more pronounced frataxin reduction. In fact YG8-800 mice make more foot faults and need more time to cross the inverted T beam or notched beam. They also hang for a shorter time on the grid and contain significantly less frataxin in all studied organs than YG8sR mice. For DMD, the treatment studied was myoblast transplantation, which consisted of injecting a suspension of healthy myoblasts into a muscle that does not express dystrophin, the absent protein in DMD patients. This method aims to damage the existing muscle fibers to permit the fusion of the injected cells and thus provide the gene to express dystrophin in the diseased muscle fibers. On average, the procedure survival rate of transplanted cells is 5% in the literature. My experiment therefore aimed to improve the transplant conditions to increase myoblast survival. I have evaluated the protective effects of Celastrol is a compound known for its anti-inflammatory. The first transplant indicated a significant improvement of cell survival, but a second did not confirm this effect. Further experiments will be needed to determine if Celastrol can improve the survival of transplanted cells.

L’Ataxie de Friedreich est une maladie génétique récessive neurodégénérative. Elle est due à un déficit dans l’expression d’une protéine mitochondriale, la frataxine. Cette protéine est impliquée dans l’assemblage des protéines fer-soufre (FeS). Le premier axe de ma thèse a consisté à mieux caractériser le rôle de la frataxine au sein du complexe précoce de biosynthèse des clusters FeS (NFS1/ISD11/ISCU). Mes résultats m’ont permis de mettre en évidence l’importance de la frataxine dans le contrôle de l’entrée du fer au sein du complexe de biosynthèse, sur l’activité enzymatique de NFS1 et sur le transfert des clusters FeS vers les apo-protéines. Le second axe a été le développement du programme de bioinformatique (PredISC) nous permettant des candidats de protéines FeS. Ce programme a permis de générer une liste de candidat qui pourra être compilée sous la forme d’une base de données. Par la suite, des approches transversales y seront associées à afin d’affiner les listes de candidats. / Friedreich Ataxia (FA) is the most prevalent form of autosomal recessive ataxia in the Caucasian population. Frataxin is implicated in the biosynthesis of iron-sulfur (FeS). The first axis of my work was to better characterize the function of Frataxin in the “early” complex of FeS clusters biosynthesis (NFS1/ISD11/ISCU). I was able to show the crucial involvement of Frataxin in the control of iron entry in this complex, on the enzymatic activity of NFS1 and on the transfert of FeS cluster to apo-proteins. Thesecond axis was the development of a bio-informatic software (PredISC) that is able to predict potential iron-sulfur containing proteins. The software allows us to generate a list of candidates that will be compiled in a database. In the future transversal approaches have to be associated in order to reduced the number of candidates, and increase their interest.