Th.--Méd.--Reims, 1981. N°: 7.

Les feuillets de cellules épidermiques cultivés en laboratoire sont des substituts cutanés pour le traitement des grands brûlés. Notre équipe a démontré que la couche nourricière de fibrobiastes (CNF) murine accroît la survie des kératinocytes (cellules épidermiques) humains en y maintenant l'expression du facteur de transcription Spl. Notre hypothèse est que l'utilisation d'une CNF irradiée accroit la survie des cellules souches épithéliales cutanées en culture, ce qui permet d'augmenter le potentiel de prolifération et de retarder la différenciation des kératinocytes en culture. Le but de ce projet est d'analyser l'effet des CNF d'origine humaine sur la prolifération et la différenciation des kératinocytes et de comprendre les mécanismes par lesquels Spl influence la survie de ces cellules, notamment en évaluant la régulation de la transcriptase inverse de la télomérase (hTERT). Des kératinocytes ont été cultivés sur une CNF humaine ou murine irradiées ainsi que sans CNF pendant une vingtaine de passages ou jusqu'à différenciation terminale. Des extraits de protéines, d'ARN et de cellules ont été prélevés à chaque passage. Le niveau d'expression de la protéine Spl ainsi que l'activité de la télomérase ont été analysés en fonction des passages. Les résultats obtenus montrent que la CNF humaine possède des caractéristiques similaires à la CNF murine tel que vérifié par le nombre de passages atteints avant différenciation ainsi que par l'expression du facteur de transcription Spl. De plus, il existe une forte corrélation entre l'expression de Spl et le taux de croissance des cellules, ce qui suggère un mécanisme par lequel Spl aiderait la prolifération des kératinocytes. Sans couche nourricière, l'activité de la télomérase et l'expression de Spl sont nettement diminuées. Par contre, les CNF humaines permettent une bonne prolifération des kératinocytes ainsi que le maintien de l'expression de Spl et de l'activité de la télomérase. En conclusion, nos résultats suggèrent que la survie des cellules épithéliales souches en culture passe par des mécanismes moléculaires impliquant Spl et le maintien de l'activité de la télomérase.

Chez les mammifères, l'épithélium épididymaire, via ses activités de sécrétion et de réabsorption, participe à la maturation post-testiculaire des spermatozoïdes en créant un environnement luminal particulier, tout au long du trajet épididymaire. Les études visant à caractériser les activités de sécrétion de cet organe et à analyser la régulation des gènes impliqués, ont été freinées par l'absence de cellules en culture pour cet épithelium très différencié. Malgré de nombreuses tentatives, les systèmes de cellules en culture développés jusqu'à présent ne reflètent pas l'état de différenciation des cellules épididymaires in vivo. En particulier, des gènes, que l'on peut considérer comme des marqueurs terminaux de la différenciation épididymaire, ne sont pas exprimés dans les cellules en culture. gpx5, gène modèle du laboratoire, codant pour une protéine sécrétée de la famille des glutathion peroxydases est un bon exemple de gène épididyme-spécifique, que l'on ne retrouve pas dans les systèmes de cellules en culture disponibles à ce jour. Dans cette étude, nous avons utilisé gpx5, PEA3 et l'indoleamine 2, 3-dioxygénase (IDO) et divers autres gènes, exprimés dans l'épididyme des mammifères, comme indicateurs de l'état de différenciation de lignées cellulaires établies de tête d'épididyme murin. Ces dernières sont issues de cultures primaires, qui se sont naturellement immortalisées par accumulation de mutations aléatoires. Dans un deuxième temps, nous avons tenté d'optimiser les conditions de culture de ces cellules afin d'améliorer le niveau d'expression de certains gènes épididymaires, en particulier gpx5, pris comme référence.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2005. / Titre de l'écran-titre (visionné le 14 mai 2007). Bibliogr.

Contexte: Les cellules endothéliales cornéennes humaines (CECH) peuvent adopter un phénotype fibroblastique en culture, les rendant inutilisables en génie tissulaire de la cornée. Le facteur de croissance transformant β (TGF-β) serait impliqué dans ce phénomène, mais il est aussi connu pour maintenir les CECH en état de quiescence in vivo. Objectifs: Comparer l’effet du TGF-β1 sur le phénotype des CECH lors des phases de prolifération ou de maturation des cultures et optimiser les conditions de culture des CECH. Méthodes: Des CECH ont été cultivées en présence ou non de TGF-β1 et de facteur de croissance épidermal (EGF) dans une culture à deux phases. La morphologie, l’expression de marqueurs de fonctionnalité, la résistance trans-endothéliale et la perméabilité des cultures ont été analysées à l’approche de la confluence (phase de prolifération) et suivant la phase de maturation post-confluence. Résultats: L’ajout de TGF-β1 lors de la prolifération a généré des CECH fibroblastiques et la perte des marqueurs de jonctions cellulaires, indépendamment de la présence d’EGF. En phase de maturation, les CECH présentaient un phénotype endothélial et des jonctions cellulaires fonctionnelles. Elles avaient une forte résistance trans-endothéliale et une faible perméabilité. Les résultats démontrent que le TGF-β1 favorise la formation d’une barrière endothéliale semi-perméable lors de la maturation des cultures de CECH, se rapprochant ainsi de l’état physiologique des CECH in vivo. / Background: Human corneal endothelial cells (HCEC) easily become fibroblastic when cultured, rendering them unsuitable for tissue engineering of the cornea. Transforming growth factor β (TGF-β) could be a key factor in this phenomenon; however, it is also known to maintain the endothelium in a quiescent state in vivo. Purpose: To compare the effects of TGF-β1 on HCEC’s phenotype during either the proliferation or the maturation phase of the cultures and optimize culture conditions for HCECs. Morphology, functionality markers, trans-endothelial resistance and permeability of the cultures were analyzed at confluency (proliferation phase) and after the post-confluence maturation phase. Results: Adding TGF-β1 during proliferation produced fibroblastic HCECs and loss of the cell junction’s markers, independently from the presence of EGF. On contrast, during the maturation phase, HCECs had an endothelial phenotype and functional cell junctions. They produced a high trans-endothelial resistance and a low permeability. Overall, results show that TGF-β1 promotes formation of a typical leaky endothelial barrier during the maturation phase of cultured HCECs, thus approaching the physiological properties of in vivo HCECs.

L'endothélium cornéen est une monocouche de cellules endothéliales cornéennes (CECs) situé sur la face postérieure de la cornée. Il crée une barrière perméable, en partie grâce aux jonctions intercellulaires. Une atteinte à cette monocouche mène à un œdème cornéen et à une perte de vision. Le seul traitement est la greffe de cornée provenant de donneur. Une alternative serait de multiplier les CECs en culture et recréer un endothélium cornéen sur un biomatériau biocompatible. Cela permettrait de traiter plusieurs patients à partir des cellules d'une seule cornée. Par contre, la formation des jonctions intercellulaires de CECs en culture doit être améliorée afin d'assurer la fonctionnalité de l'endothélium reconstruit. *In vivo*, les CECs reposent sur la membrane de Descemet ayant une rigidité entre 20 et 80 kPa. L'objectif 1 a pour but de déterminer comment la culture de CECs sur un substrat de rigidité physiologique influence la formation de jonctions intercellulaires. Pour ce faire, deux types d'hydrogels à rigidité physiologique ont été utilisés. Nos résultats ont démontré que les hydrogels de polyacrylamide sont un meilleur candidat que les hydrogels « CytoSoft » pour la culture à long terme de CECs. Par la suite, la culture a été optimisée pour la formation de jonctions intercellulaires et les résultats ont favorisé un recouvrement de collagène IV, un milieu de maturation avec 5% de sérum de veau fœtal et TGF-β2 et une rigidité de 50 kPa. Ces conditions optimales ont été utilisées pour comparer la culture sur hydrogel à la culture sur verre (70 GPa). Nos résultats ont démontré que la rigidité physiologique ne peut pas rétablir un phénotype endothélial et que la culture de CECs conditionnées à la rigidité physiologique sur hydrogel permet une meilleure formation des jonctions intercellulaires que lors de la culture sur verre. Pour terminer, l'expansion de CECs fraichement isolées sur hydrogel a été évaluée et s'est trouvée impossible à exécuter en raison d'une absence de prolifération. L'objectif 2 évalue la formation d'un endothélium cornéen sur un hydrogel biocompatible composé de courts peptides mimant le collagène (CLP) lié, ou non, au polyéthylène glycol (PEG). Les résultats ont démontré qu'un recouvrement de laminine 511 est nécessaire à l'adhésion des cellules aux hydrogels CLP, mais pas CLP-PEG, mais qu'il n'est tout de même pas possible de reformer une monocouche, en raison d'un décollement précoce des cellules ou de l'hydrogel. Le motif IKVAV de la laminine a été réticulé aux hydrogels pour éviter le décollement des cellules, mais n'a pas permis de reformer une monocouche confluente. Ce mémoire démontre que la rigidité du substrat influence la formation de jonctions intercellulaires et ouvre des pistes sur l'optimisation d'un biomatériau pouvant éventuellement servir de support à la culture de CECs. / The corneal endothelium is a monolayer of corneal endothelial cells (CECs) located on the posterior part of the cornea. It creates a permeable barrier, in part due to intercellular junctions. Damage to this monolayer leads to corneal edema and vision loss. The only treatment available is a corneal graft from a donor. An alternative would be to multiply CECs in culture and recreate a corneal endothelium onto a biocompatible biomaterial. This could allow to graft several patients using the cells of a single cornea. On the other hand, intercellular junction formation of CECs in culture must be enhanced in order to ensure the reconstructed endothelium's functionality. *In vivo*, CECs rest on the Descemet's membrane, which has an average stiffness in between 20 and 80 kPa. Objective 1 aims to determine how culturing CECs on a substrate of physiological stiffness influences the formation of intercellular junctions. To do so, two types of substrates with physiological stiffnesses were used. Our results demonstrate that polyacrylamide hydrogels are a better candidate than "CytoSoft" hydrogels for long-term culture of CECs. Thereafter, cell culture was optimized for intercellular junction formation. The optimal culture conditions included a type IV collagen coating, a maturation media with 5% fetal bovine serum and TGF-β2, and a stiffness of 50 kPa. Those conditions were then used to compare the culture on hydrogels to the culture on glass (70 GPa). Our results demonstrated that physiological stiffness can't restore endothelial phenotype and that culture of physiological-stiffness-conditioned CECs on hydrogel led to better intercellular junction formation than culture on glass. Finally, freshly isolated CEC expansion on hydrogel was evaluated and was found to be impossible to execute due to lack of proliferation. Objective 2 evaluates the formation of a corneal endothelium on a biocompatible hydrogel composed of collagen-like peptides (CLP), linked or not to polyethylene glycol (PEG). The results demonstrated that a laminin 511 coating is necessary for cell adhesion on CLP, but not CLP-PEG hydrogels, and that it is still not possible to reform a monolayer because of early detachment of the cells or the hydrogel. The IKVAV laminin motif was crosslinked to the hydrogels to avoid cell detachment, but could not reform a confluent monolayer. This master thesis demonstrates that substrate stiffness has an impact on intercellular junction formation and opens avenues to optimize a biomaterial that could be used as a support to cultivate CECs.

Le génie tissulaire propose des solutions prometteuses aux problématiques de réparation et de remplacement des tissus du corps humain, notamment au niveau des composantes du système cardiovasculaire. L’une des approches préconisées est l’utilisation de la culture cellulaire afin de reproduire la structure, les propriétés et les fonctionnalités du tissu natif à réparer ou à remplacer. La culture dynamique des tissus dans un environnement recréant, dans le cas des substituts du système cardiovasculaire, les conditions physiologiques de débit et de pression que ces tissus doivent supporter, a démontré un grand potentiel à faire évoluer les propriétés et les fonctionnalités des substituts vers celles des tissus natifs qu’il sont destinés à réparer ou remplacer. Les objectifs de cette thèse ont donc été orientés vers le développement de différents outils reliés au conditionnement mécanique des substituts de la valve aortique et des artères par la culture dynamique. Un bioréacteur a tout d’abord été développé. Ce système a permis la reproduction d’une qualité sans précédent des conditions de débit et de pression à l’entrée de la circulation systémique du corps humain. Il permet ainsi d’effectuer un conditionnement mécanique sur des substituts de la valve aortique produits par auto-assemblage. Des outils ayant mené à l’établissement de protocoles rigoureux permettant l’évaluation de l’effet du conditionnement mécanique sur les propriétés mécaniques des substituts vasculaires ont ensuite été conçus et mis en service. Finalement, ces différents outils de conditionnement et d’évaluation ont été utilisés afin d’amorcer la mise en place d’un protocole de conditionnement mécanique, permettant la modulation des propriétés mécaniques et l’accélération de la maturation des substituts vasculaires produits par auto-assemblage. / Tissue engineering offers promising solutions to problems related to repair and replacement of tissues of the human body, especially those of the cardiovascular system. One of the preferred approaches consists in using cell culture to reproduce the structure, the properties and the functionalities of the tissue to be repaired or replaced. Dynamic culture in an environment reproducing, in the case of cardiovascular system substitutes, blood flow and pressure conditions imposed on these tissues in the body, has demonstrated a great potential for the properties and functionalities of the substitutes to evolve into those of the native tissues they are destined to repair or replace. The objectives of this thesis have therefore been oriented towards the development of different tools related to the mechanical conditioning of aortic valve and artery substitutes through dynamic culture. A bioreactor allowing reproduction of the blood flow and pressure conditions at the entrance of the systemic circulation in the human body with an unprecedented quality was first developed, in order to perform mechanical conditioning on aortic valve substitutes produced by auto-assembly. Tools leading to the establishment of rigorous protocols for the evaluation of the effect of mechanical conditioning on the circumferential mechanical properties of vascular substitutes were then designed and commissioned. Finally, these different tools of mechanical conditioning and evaluation were used to initiate the development of a mechanical conditioning protocol which would modulate the mechanical properties and accelerate the maturation process of vascular substitutes produced by auto-assembly.

L'activité cellulaire répond à la stimulation électrique (SE). Le but de cette thèse était le développement d'un composite multifonctionnel et l'étude de la réponse des ostéoblastes à la SE transmise par un tel composite. Les objectifs spécifiques étaient les suivants: a) synthèse des particules de haute conductivité en polypyrroles (PPy) avec des rendements élevés en contrôlant la taille et la régularité moléculaire; b) bioactivation des particules PPy par dopage à l'héparine (HE); c) préparation de composites multifonctionnels électriquement stables et présentant une haute affinité biologique; d) étude de la prolifération et de la minéralisation des ostéoblastes sur un échafaudage conducteur sous SE. Le chapitre I résume les phénomènes bioélectriques chez l'humain à différents niveaux, les mécanismes possibles de l'action de l'électricité sur les cellules, et l'étude de la SE en génie tissulaire osseux. Ce chapitre propose également une revue critique des différentes techniques et des différentes méthodologies de SE utilisées pour des études environnementales, scientifiques et pour les soins cliniques. Les hypothèses et les objectifs de la thèse sont présentés. Le chapitre II décrit la synthèse des nanoparticules en PPy par polymérisation en emulsion en utilisant le réactif de Fenton comme oxydant. Ces nanoparticules présentent une morphologie polygonale creuse, avec une épaisseur approximative de 50 nm et un diamètre de 400-500 nm. Les caractéristiques cristallines de ces nanoparticules ont été démontrées. Un mécanisme plausible de synthèse est proposé. Le chapitre III rapporte la bioactivation des particules en PPy en utilisant F héparine (HE) comme dopant, la préparation d'une membrane conductrice biodégradable, et la culture de fibroblastes sur ces membranes. Le dopage avec HE améliore la stabilité électrique de la membrane conductrice et augmente l'adhésion et la prolifération de cellules. Le chapitre IV démontre que la SE induite par la membrane conductrice peut moduler l'activité des ostéoblastes et accélérer la formation osseuse. Un champ électrique optimal de 200 mV/mm avec une durée de stimulation entre 2 et 8 h a favorisé la prolifération des ostéoblastes et augmenté l'expression et la production de ses marqueurs spécifiques de maturation (ALP) et de minéralisation (CO). Le chapitre V présente une discussion générale, le sommaire des conclusions et les perspectives de recherche pour le futur. L'implication de ces travaux en génie tissulaire et en santé humaine est également abordée.

Ce travail visait à exploiter le potentiel des protéines de soya afin de concevoir et de développer des biomatériaux sous forme de biofilms aux propriétés physico-chimiques, et surtout biologiques, contrôlées. Pour ce faire, des films à base d'isolats de protéines de soya (IPS) ont été préparés à l'aide de plastifiant, le glycérol, et de différentes concentrations d'agent de réticulation, le formaldéhyde, afin d'obtenir un biomatériau favorable pour la culture de cellules cutanées (fibroblastes et kératinocytes) humaines. La toxicité des films a été testée en évaluant l'adhésion, la croissance, la prolifération et la formation d'une structure cutanée bien organisée. La biocompatibilité et l'immunogénicité des biofilms ont été étudiées grâce aux analyses de cytokines produites par les fibroblastes et les kératinocytes. Les diverses observations microscopiques ont démontré l'innocuité de tous les biofilms vis-à-vis des kératinocytes qui ont adhères. Ces biofilms n'ont aucun effet nocif sur la viabilité cellulaire. Il est intéressant de noter que ces cellules ont une prolifération croissante malgré l'augmentation de la concentration en réticulant. La prolifération des cellules cutanées est, cependant, réduite à fort pourcentage de formaldéhyde. En effet, celles-ci prolifèrent mieux sur les biofilms contenant 0 %, 1 % et 2 % de formaldéhyde comparativement à ceux contenant 3 % d'agent de réticulation. En conclusion, les biofilms à base de protéines de soya offrent un environnement favorable à l'adhésion et la croissance des kératinocytes. Les biofilms ayant le meilleur potentiel sont ceux contenant une concentration de 1 % de formaldéhyde.

Les molécules naturelles de différentes origines et essentiellement celles issues des algues marines conçoivent une panoplie de principes bioactifs naturels à fort potentiel thérapeutique. Actuellement, plusieurs recherches sont consacrées à l’isolement de nouveaux composés bioactifs à partir des ressources marines qui renferment des effets bénéfiques prometteurs pour la santé. Parmi les ressources marines, les composés bioactifs présents dans de nombreuses espèces d’algues ont des propriétés nutritionnelles et pharmaceutiques particulièrement intéressantes. Cette thèse s’intéresse aux effets bénéfiques de l’algue Ulva rigida. Elle concerne plus particulièrement les activités des extraits protéiques de l’algue verte Ulva rigida. En effet, dans la présente étude, nous avons étudié l'effet préventif d'un extrait de protéine (PE) d'Ulva rigida contre les dommages cellulaires induits par les UVB. Nous avons démontré qu'un traitement des astrocytes corticaux avec 50 μg de PE induit un fort effet glioprotecteur et supprime les effets nocifs des rayonnements UVB, augmentant en particulier la viabilité cellulaire. D’autres essais supplémentaires nous ont permis d’affirmer que cet extrait stimule l'activité de la catalase et de la superoxyde dismutase et inhibe la production de marqueurs de stress, tels que le H2O2 ou la peroxydation lipidique. Par ailleurs, la digestion protéolytique ou le traitement thermique de l'extrait d'algue ont inhibé cet effet préventif, plaidant pour le rôle prédominant de la fraction protéique. Par la suite, des études protéomiques ont permis d'identifier plusieurs protéines de l'extrait, parmi lesquelles la calmoduline s'est avérée représenter un contributeur important aux activités de protection observées à la fois sur des cultures d’astrocytes que sur des neurones en grain. / Natural molecules from different origins present a high therapeutic potential. Among them, molecules extracted from marine algae are particularly interesting. Several studies are currently being devoted to the isolation of new bioactive compounds from marine resources that have promising health benefits. Among the marine resources, the bioactive compounds present in many species of algae have particularly interesting nutritional and pharmaceutical properties. This thesis deals with the beneficial effects of the alga Ulva rigida. It relates more particularly to the activities of the protein extract of the green alga Ulva rigida. In this study, we studied the preventive effect of a protein extract (PE) of Ulva rigida against UVB-induced cell damage. We have demonstrated that treatment of cortical astrocytes with 50 μg of PE induces a strong glioprotective effect and suppresses the harmful effects of UVB radiation, in particular increasing cell viability. Other extra tests allowed us to say that this extract stimulates the activity of catalase and superoxide dismutase and inhibits the production of stress markers such as H2O2 or lipid peroxidation. Moreover, the proteolytic digestion or the heat treatment of the algal extract inhibited this preventive effect, arguing for the predominant role of the protein fraction. Subsequently, proteomic studies have identified several proteins in the extract, of which calmodulin has been shown to be an important contributor to the protective activities observed on both astrocyte and neuron cultures.