Il est présentement difficile de tester les médicaments anti-psoriasiques sur de nombreux échantillons de peaux pathologiques en raison de problèmes éthiques, de disponibilité et de variations interindividuelles. Ainsi, les formulations de médicaments proposées à la population atteinte de psoriasis ne sont pas bien adaptées à leur situation réelle. La pénétration cutanée de drogues est une méthode qui offre un grand potentiel et qui plus est particulièrement attrayante comparativement aux méthodes conventionnelles d'injection ou d'administration orale. Le principal objectif de notre étude est de présenter un nouveau modèle de substituts cutanés pathologiques faits à partir de cellules de patients psoriasiques et selon la méthode d'auto-assemblage, afin de tester la pénétration de différentes molécules et de vérifier si le substitut est similaire au tissu pathologique in vivo. En comparaison à la peau normale humaine et à la peau de souris, une fonction barrière efficiente a été observée pour les substituts de peau faits à partir de cellules de patients sains lorsque les molécules suivantes ont été appliquées: l'acide benzoïque, la caféine et l'hydrocortisone. Il est connu dans la littérature que les peaux de patients psoriasiques sont plus perméables. Cette même caractéristique a été observée pour les substituts cutanés préparés à partir de cellules de patients psoriasiques. Ces tests de pénétration cutanée sont un premier pas vers la validation d'un modèle de substituts cutanés pathologiques, précisément psoriasiques, en vue de pouvoir le considérer en tant qu'outil efficace pour des études dermopharmacologiques d'agents anti-psoriasiques.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / La méthode d'auto-assemblage permet la production de substituts cutanés sans matériel exogène. L'objectif principal de notre travail a été de modifier cette méthode originale afin de produire un nouveau modèle de substituts cutanés pathologiques fabriqués à partir de cellules psoriasiques. Dans un premier temps, des substituts sains ont été cultivés en présence et en absence de sérum de veau foetal dans le but d'optimiser les conditions de culture. Puis, des analyses histologiques, immunohistochimiques, de perméabilité et des propriétés physico-chimiques ont été réalisées. Les résultats obtenus ont permis de conclure que le retrait du sérum à partir de la culture à l'interface air-liquide ne cause aucun problème majeur au niveau de la différenciation épidermique, de la jonction dermo-épidermique, du derme et de la perméabilité des substituts. De plus, des analyses par spectroscopic infrarouge à transformée de Fourier ont permis d'observer que le retrait du sérum améliore même l'organisation lipidique pour trois des cinq populations cellulaires testées. Parallèlement à cette étude, des substituts psoriasiques ont été produits à partir de cellules psoriasiques dans le but de vérifier si ces derniers allaient permettre la conservation de ce phénotype en culture. Des analyses histologiques et immunohistochimiques ont été effectuées et ont permis d'observer que le phénotype psoriasique (hyperprolifération et différenciation anormale des kératinocytes) est en partie conservé dans les substituts pathologiques. De plus, lors d'un traitement à l'acide rétinoïque, ceux-ci réagissent de façon similaire à ce qui est observé dans les peaux psoriasiques in vivo. Finalement, des substituts produits à partir de cellules non lésionnelles ont été reconstruits pour vérifier s'il existait une différence entre les cellules lésionnelles et non lésionnelles d'un même patient. Les résultats ont permis d'observer que les cellules non lésionnelles ne sont pas totalement «normales» et qu'elles conservent en partie les caractéristiques du psoriasis. En conclusion, ce nouveau modèle de substituts cutanés pathologiques pourrait devenir un puissant outil dermopharmaceutique permettant de tester de nouveaux traitements pour vaincre le psoriasis.

Le psoriasis est une maladie cutanée chronique et complexe à médiation immunitaire qui implique un large éventail de cellules épithéliales et immunitaires. Les mécanismes sous-jacents qui régissent les défauts épidermiques et le dysfonctionnement immunologique restent largement incompris. L'IL-17A, une cytokine de grande importance dans la pathogenèse du psoriasis, est en mesure d'activer les kératinocytes, lesquels sécrètent à leur tour diverses cytokines et chimiokines, conduisant à la chronicisation des lésions psoriasiques. Ces dernières années, l'émergence de nouveaux modèles plus sophistiqués a permis l'évolution de nos connaissances sur la pathogénèse du psoriasis. En raison des différences importantes entre l'immunité cutanée de l'humain et de l'animal, de nombreux effets secondaires imprévus et indésirables sont observés en clinique lors du développement de nouvelles thérapies contre le psoriasis. Il y a alors un réel besoin pour le développement de modèles précliniques humains adéquats pour l'étude du psoriasis. Le premier objectif de cette thèse était d'évaluer le profil d'expression génique du modèle de peau psoriasique de l'équipe du Dre Pouliot. De façon intéressante, bien que celui-ci ne soit produit qu'à partir de deux types cellulaires, soit les fibroblastes et les kératinocytes provenant de lésions cutanées de patients atteints de psoriasis, une quantité importante de gènes dont l'expression est dérégulée entre les conditions psoriasiques et leurs contrôles sains a pu être observée. Cependant, en raison de l'absence de la composante immunitaire dans le modèle psoriasique, certains gènes reconnus comme étant dérégulés dans la peau psoriasique native n'ont pas été révélés dans le modèle à l'étude. Le second objectif de cette thèse visait à optimiser le modèle de peau psoriasique enrichi en lymphocytes T. Les résultats issus de cette étude ont montré que le changement des méthodes de culture des lymphocytes T, notamment aux niveaux de leur isolation et activation, permet pour la première fois la production d'IL-17A dans les substituts psoriasiques. Cette étude a permis de présenter un nouveau modèle de peau psoriasique produit à partir de cellules cutanées psoriasiques, enrichi en lymphocytes T et présentant le microenvironnement pro-inflammatoire caractéristique du psoriasis, notamment par la présence d'IL-17A. Finalement, le dernier objectif de cette thèse visait à étudier de façon plus approfondie les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le psoriasis à l'aide de ce modèle optimisé. Cette étude a mis de l'avant la dérégulation du produit du gène PTPRM dans les kératinocytes psoriasiques et sa contribution dans la pathogenèse du psoriasis via l'activation excessive de la signalisation ERK1/2. Globalement, nos travaux soutiennent l'importance des kératinocytes dans le développement des lésions psoriasiques. Les recherches présentées dans cette thèse ont également mené à la proposition d'un modèle sophistiqué de peau psoriasique enrichie en lymphocytes T qui peut s'avérer un outil intéressant pour le développement de nouvelles cibles thérapeutiques, ainsi que pour la médecine personnalisée. / Psoriasis is a chronic and complex immune-mediated skin disease involving a wide range of epithelial and immune cells. The underlying mechanisms governing epidermal defects and immunological dysfunction remain largely misunderstood. IL-17A, a cytokine of great importance in the pathogenesis of psoriasis, can activate keratinocytes, which in turn secrete a variety of cytokines and chemokines, leading to the chronicization of psoriatic lesions. In recent years, the emergence of new and more sophisticated models has allowed the evolution of our knowledge on the pathogenesis of psoriasis. Because of the significant differences between human and animal skin immunity, many unexpected and undesirable side effects are observed in the clinic when developing new psoriasis therapies. There is therefore a real need for the development of adequate preclinical human models for the study of psoriasis. The first objective of this thesis was to evaluate the gene expression profile of Dr. Pouliot's psoriatic skin model. Interestingly, although the model is produced from only two cell types, fibroblasts and keratinocytes derived from skin lesions of psoriasis patients, a significant amount of deregulated gene expression between the psoriatic conditions and their healthy controls has been observed. However, due to the absence of the immune component in the psoriatic model, some genes known to be deregulated in native psoriatic skin were not revealed in this model. The second objective of this thesis was to optimize the T cell-enriched psoriatic skin model. The results of this study showed that the change in T cell culture methods, especially in their isolation and activation, allows for the first time the production of IL-17A in psoriatic substitutes. This study allowed the presentation of a new psoriatic skin model produced from psoriatic skin cells, enriched in T cells, and presenting the pro-inflammatory microenvironment characteristic of psoriasis, notably by the presence of IL-17A. Finally, the last objective of this thesis was to further investigate the cellular and molecular mechanisms involved in psoriasis using this optimized model. This study highlighted the deregulation of the PTPRM gene product in psoriatic keratinocytes and its contribution to the pathogenesis of psoriasis via excessive activation of ERK1/2 signaling. Overall, our work supports the importance of keratinocytes in the development of psoriatic lesions. The work presented in this thesis has also led to the proposal of a sophisticated T cell-enriched psoriatic skin model that may prove to be an interesting tool for the development of new therapeutic targets, as well as for personalized medicine.

Le traitement des maladies de la peau ainsi que des plaies étendues chroniques ou aiguës par thérapie cellulaire sont révolutionnaires. La préservation des cellules souches épithéliales dans les cultures de kératinocytes et lors de la production de substituts cutanés est cruciale au succès clinique de ces traitements. L'objectif général de ce projet de doctorat était d'approfondir les connaissances sur la préservation de ces cellules souches. D'abord, les travaux décrits dans cette thèse ont permis de mieux comprendre quels facteurs contribuent à l'établissement d'une niche et donc à la préservation des cellules souches épithéliales dans des substituts cutanés. Ceci a été accompli par une revue systématique des études cliniques décrivant la greffe de substituts cutanés bilamellaires sur des sujets humains au cours des dernières décennies. J'ai trouvé que, bien que plusieurs combinaisons de conditions de culture et de méthodes de production de substituts cutanés puissent mener à l'établissement d'une niche, deux facteurs semblent avoir plus d'importance. Mes résultats indiquent effectivement que l'utilisation d'une couche nourricière ainsi que de sérum - ou d'un remplacement de sérum, tel que de l'extrait de glande pituitaire bovine - dans le milieu de culture sont associés à une meilleure persistance de greffe à long terme. Par la suite, j'ai démontré que l'utilisation d'une couche nourricière d'origine humaine plutôt que murine permettait de maximiser le potentiel prolifératif et la clonogénicité de kératinocytes primaires humains en culture. Cette divergence pourrait s'expliquer par l'activation des voies signalétiques impliquant Akt, STAT5, p53 et AMPKα1. J'ai aussi investigué l'effet du type d'inducteur d'AMP cyclique sur les cultures de kératinocytes et étudié s'il était dépendant du type de couche nourricière employé. Bien que je n'aie pas détecté d'effet d'interaction entre ces facteurs, mes travaux ont cimenté l'isoprotérénol plutôt que la toxine du choléra comme inducteur d'AMP cyclique de choix pour les applications de recherche fondamentale au LOEX. Mes travaux ont ensuite mené à la mise au point d'un système de culture de kératinocytes et de production de substituts cutanés humains avec un milieu sans sérum. En effet, en l'absence d'un milieu sans sérum commercial capable de préserver efficacement les cellules souches épithéliales en culture, mon équipe et moi avons développé ab initio notre propre milieu de culture que nous avons appelé Surge SFM. Contrairement à la norme, ce milieu a été développé pour être utilisé conjointement à une couche nourricière humaine. J'ai démontré que Surge SFM peut être utilisé pour cultiver des kératinocytes fraîchement isolés ainsi que pour amplifier des kératinocytes ayant préalablement été cryopréservés après avoir été cultivés avec du sérum. De plus, mes résultats suggèrent qu'il y a très peu de différences au niveau transcriptomique entre des kératinocytes cultivés avec Surge SFM et le milieu conventionnel avec sérum. D'ailleurs, selon des analyses in silico, ces quelques différences pourraient s'expliquer par une modulation en amont de l'expression d'EHF, un facteur de transcription régulant plus de 400 gènes impliqués dans la différentiation des kératinocytes humains et la formation de l'épiderme. J'ai ensuite montré que ce milieu permet de préserver les populations de cellules souches épithéliales en culture par des essais de clonogénicité et de cytométrie en flux. Finalement, j'ai démontré que ce nouveau milieu chimiquement défini peut être utilisé pour la production de substituts cutanés par autoassemblage et que ces derniers persistent au moins jusqu'à 6 mois après leur greffe sur des souris athymiques, démontrant encore une fois que les cellules souches épithéliales peuvent être préservées avec ce nouveau milieu. Dans l'ensemble, les travaux de cette thèse ont permis de mieux comprendre les facteurs et les conditions favorables à la préservation des populations de cellules souches épithéliales dans les cultures de kératinocytes primaires humains. Ceci a mené au développement d'un nouveau milieu de culture sans sérum permettant la préservation des cellules souches épithéliales lors de la culture de kératinocytes en monocouche et lors de la production de substituts cutanés bilamellaires, ce qui représente une avancée importante dans le domaine du génie tissulaire cutané.

"Thèse en cotutelle, Université Laval Québec, Canada Philosophiæ doctor (Ph. D.) et Université de Strasbourg Strasbourg, France" / Les réactions immunitaires de la peau sont initiées par les cellules dendritiques cutanées (dendritic cells, DCs). L'effet potentiellement sensibilisateur d'un composé peut être prédit in vitro en utilisant des monocytes humains différenciés en DCs (MonoDCs). Cependant, ces modèles simplistes restent imprécis car l'activation des DCs cutanés par les sensibilisateurs peut être déclenchée ou modulée par des interactions microenvironnementales avec de multiples types de cellules non immunitaires. Notre objectif est de développer une peau immunocompétente qui combinera des MonoDCs avec tous les éléments structurels et fonctionnels de la peau, c'est-à-dire une barrière épidermique posée sur un derme contenant une pseudo-vascularisation et des neurones nociceptifs. Une matrice de collagène a été ensemencée avec des fibroblastes et des cellules endothéliales, puis avec des précurseurs de fibres nerveuses dérivées soit de l'iPSC humaine, soit de la DRG embryonnaire murins. Enfin, nous avons introduit les MonoDC et les kératinocytes. Nous avons observé que les neurones différenciés in situ innervent l'épiderme comme observé habituellement dans la peau humaine normale. De plus, les neurones dérivées d’iPSCs, expriment neuropeptides et canaux calcique spécifiques des fibres nociceptives. Enfin, les Mono-DC intégrés au modèle restent stable pendant toute la durée nécessaire à la formation de l’épiderme et peuvent être stimulé. Le modèle sera utilisé pour prédire le potentiel irritant des composés chimiques et l'impact de l’innervation nociceptive sur l'activation des DCs. / Immune reactions in the skin are initiated by the cutaneous dendritic cells (DCs). The potential sensitizing effect of a compound can be predicted in vitro using human monocytes differentiated into DCs (Mono-DCs). However, these simplistic models remain inaccurate because the activation of cutaneous DCs by sensitizers may be triggered or modulated by microenvironmental interactions with multiple types of nonimmune cells. Our goal is to develop an immunocompetent human tissue-engineered skin that will combine DCs with all structural and functional element of the skin, i.e. an epidermal barrier laid upon a dermis containing a pseudo-vascularization and nociceptive neurons. Collagen matrix was seeded with fibroblasts and endothelial cells, then with precursors of nerve fibers derived from either human iPSC or murine embryonic DRG. Finally, we introduced Mono-DCs and keratinocytes. We observed that in situ differentiated neurons grow axons towards the epidermis as usually observed in normal human skin. What's more, the neurons derive from iPSC, express neuropeptides and calcium channel as normal nociceptive fibers. Moreover, Mono-DCs settled as expected beneath the epidermis and remained sessile to stimulation for several weeks. The model will be used to predict the irritant potential of chemical compounds, and the impact of nerves on DC activation.

Introduction: Le Laboratoire d’Organogenèse Expérimentale (LOEX) utilise une technique de production de substituts cutanés bilamellaires autologues auto-assemblés (SASS) unique. Cette méthode permet la génération d’équivalents cutanés permanents avec une structure et une fonction similaire à la peau normale humaine. Problématique et objectifs: Cette thèse présente d’abord les premiers résultats d’essais cliniques pour le traitement de plaies chroniques complexes traitées avec SASS. Ces résultats démontrent une efficacité et une sécurité d’utilisation de ces SASS. Toutefois, il y a un intérêt de développer une méthode de production plus rapide de ces substituts cutanés afin d’améliorer l’accessibilité clinique et le pronostic des patients grands brûlés, lors de leur utilisation en phase aiguë. En effet, le délai de couverture cutanée définitive essentielle à la thermorégulation et à l’effet de barrière est directement en lien avec les pronostics vital et morbide de cette population. Le délai actuel de 8 semaines pour la production des greffons aurait avantage à être réduit pour améliorer leur utilité quant aux soins des patients. Méthode: Dans un premier temps, le développement et la mise au point d’une méthode de production plus rapide de SASS à partir de matrices dermiques décellularisées (SASS-DM), générant des peaux reconstruites en seulement 4 semaines et demie est présenté. Par la suite, l’équivalence de la méthode de production rapide de ces peaux est d’abord vérifiée in vitro et comparée à la méthode standard quant à ses caractéristiques histologiques, de différenciation cellulaire et la présence d’une membrane basale fonctionnelle. La méthode rapide est finalement comparée in vivo à la méthode standard quant à l’évolution de ces peaux greffées sur les vivants, de façon à compléter le développement préclinique de cette nouvelle méthode innovatrice. Résultats: La méthode rapide de production des peaux bilamellaires autologues auto-assemblées s’est montrée équivalente à la méthode de production standard et ce, autant in vitro qu’in vivo. Conclusion: Ce travail présente d’abord l’utilisation clinique des peaux reconstruites bilamellaires pour le traitement de plaies variqueuses chronique, qui s’avère efficace et sécuritaire. Puis, le développement préclinique d’une méthode plus rapide de production de peaux reconstruites bilamellaires autologues est présenté, permettant de générer des greffons en 4 semaines et demie plutôt que 8 semaines, et ce avec une qualité équivalente à la méthode standard. Cette innovation représente un ajout majeur aux modes de traitement des grands brûlés puisqu’elle a le potentiel de changer la planification chirurgicale et leur pronostic de survie. / Introduction: The Laboratoire d’Organogenèse Expérimentale (LOEX) has developed a unique production technique of self-assembled autologous skin substitute (SASS). This method allows the generation of permanent skin equivalents that display a structure and a function similar to normal human skin. Problematic and objectives: This thesis presents the first results of SASS clinical use in the treatment of chronic complex wounds to demonstrate the clinical efficacy and safety. The need to develop a faster production method in order to improve burn patient prognosis is also outlined. Indeed, the delay before definitive skin coverage to insure proper thermoregulation and protection from the external environment is directly associated to the vital and morbid prognosis of this population of severely traumatised patients. The current eight weeks SASS production delay must be reduced in order to further improve burn patients quality of care and survival. Method: This work describes the development and refinement of a faster production method for SASS using decellularized dermal matrices (SASS-DM) that generated skin substitutes produced in only 4 weeks and a half. These faster produced skin substitutes where compared in vitro to the standard SASS in regard to the histological characteristics, cellular differentiation and the presence of a functional basement membrane. The faster produced SASS-DM were then compared in vivo to standard SASS by following the evolution of grafted mice in order to complete a preclinical trial of this innovative technique. Results: The faster production method for the autologous self-assembled bilayered skin substitutes was shown to be equivalent to the standard production method in vitro and in vivo. Conclusion: This work presents the clinical use of bilayered skin substitutes for the treatment of chronic venous ulcers, which was shown to be efficient as well as safe. Afterwards, the preclinical development of a new faster production method of autologous bilayered self-assembled skin substitutes is presented, allowing the culture of skin grafts in four weeks and a half instead of the previous 8 weeks long protocol, with equivalent quality and characteristics as the standard cultured skins. This innovation represents a major adjunct to severely burned patients treatments and could possibly change their surgical planning and their survival.

Les modèles de peau in vitro en trois dimensions sont des outils pour étudier des processus biologiques ou pathologiques. La majorité des modèles in vitro actuellement disponibles ne comporte pas de système immunitaire et de réseau vasculaire, tous deux présents dans la peau humaine. Nous avons développé un modèle de peau entièrement composé de cellules d'un même donneur (autologue) et contenant des cellules immunitaires et endothéliales. En nous basant sur le modèle d'auto-assemblage du LOEX, nous avons mis en culture durant quatre semaines des fibroblastes dermiques dans un milieu favorisant le dépôt de matrice extracellulaire. La résultante est un feuillet manipulable composé de cellules entourées de matrice. Un isolat dermique préalablement extrait du derme humain est ensemencé sur un premier feuillet de fibroblastes et les kératinocytes sur un second. L'isolat dermique contient l'ensemble des cellules présentes dans le derme du donneur. Les deux feuillets sont ensuite superposés et mis en culture pendant deux semaines à l'interface air-liquide pour stimuler la différenciation de l'épithélium. Une analyse histologique a mis en évidence un épithélium stratifié sur un derme composé de matrice et de cellules. Des immunomarquages ont également montré la présence de cellules immunitaires CD45+ viables et d'un réseau vasculaire CD31+ au niveau du derme. Une plaie a ensuite été créée au centre de ce modèle de peau et une analyse histologique a montré une migration des cellules épidermiques et dermiques dans la plaie. La création de ce modèle permettra d'avoir une meilleure compréhension de l'homéostasie de la peau et du phénomène de cicatrisation cutanée. / In vitro three-dimensional human skin models provide a tool to investigate biological or pathological processes and to test drug effect or toxicity. In vitro models usually lack an immune system and vasculature, both characteristics of the human skin. We developed a skin model composed of cells from the same donor (autologous) and containing immune cells and endothelial cells. Based on the self-assembly method developed at the LOEX, dermal fibroblasts were first cultured during four weeks in a medium stimulating the production of an extracellular matrix. The result of this culture is a fibroblast sheet used for the development of our model. A dermal fraction enzymatically extracted from a human dermis was seeded onto a first sheet while the keratinocytes were seeded on a second one. The dermal fraction contained all the dermal cells from a donor. The two sheets were then superimposed and raised at the air-liquid interface during two weeks to stimulate epidermis differentiation. Histological studies of the 3D skin model highlighted a stratified epidermis on a dermis composed of matrix and cells. Immunofluorescence staining showed viable CD45+ immune cells and a CD31+ capillary network in the dermis. A wound was then produced at the center of the model and histological studies highlighted the migration of the epidermal and dermal cells into the wound. The creation of this first autologous 3D model containing immune cells paves the way to increase knowledge about skin homeostasis and the role of immune cells in the wound healing process.

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Le psoriasis se caractérise par la présence d’infiltrats leucocytaires inflammatoires au niveau du derme et de l’épiderme cutané humain, menant à des désordres cutanés considérables : hyperprolifération des cellules épidermiques basales, différenciation altérée des kératinocytes et sécrétion accrue de médiateurs pro-inflammatoires dans le microenvironnement local. Cette dysfonction immuno-épithéliale menant au développement de lésions blanchâtres, agit tel un cercle vicieux incontrôlable, stimulant réciproquement les kératinocytes et les cellules immunitaires. Dans cette optique, mes travaux de doctorat ont visé à : (1) générer un microenvironnement immunocompétent par l’intégration de cellules T pré-activées dans un modèle de peau saine, non-lésionnelle et lésionnelle, produit selon la méthode d’auto-assemblage afin (2) d’étudier le rôle de cette composante importante sur les caractéristiques-clés associées au psoriasis. De surcroit, nous avions pour autre objectif (3) d’analyser l’impact de macrophages dérivés de monocytes dans un modèle tridimensionnel de peau saine afin (4) de déterminer l’influence de ces cellules sur le remodelage matriciel et la différenciation épidermique à l’état d’équilibre pour, finalement, (5) analyser l’empreinte du microenvironnement sur leur polarisation in vitro. Nos données mettent en lumière le caractère déterminant de la composante immunitaire, lorsqu’associée aux cellules cutanées pathologiques, dans le développement des lésions psoriasiques, puisque la présence de cellules T, dans un modèle de peau saine, n’induit pas l’ensemble des caractéristiques histopathologiques associées à cette dermatose. D’autre part, ces modèles de peau immunocompétente répondent à un traitement de choix pour le psoriasis, le méthotrexate, qui inhibe la prolifération cellulaire et atténue l’inflammation. Ces nouveaux modèles organotypiques serviront d’outils précliniques performants pour le criblage d’actifs visant à traiter certaines pathologies d’origine auto-immune inflammatoire chronique, dans lesquelles le système immunitaire joue un rôle crucial, à l’exemple du psoriasis. Par ailleurs, l’intégration de macrophages dérivés de monocytes dans un modèle de peau normale, affecte l’état de différenciation des kératinocytes épidermiques tout en réduisant l’état inflammatoire basal. Ces macrophages induisent, en outre, un remodelage matriciel tissulaire important modifiant de ce fait le microenvironnement avoisinant. Finalement, ce nouveau modèle tridimensionnel nous a permis, d’une part, de mimer davantage la structure cutanée physiologique et, d’autre part, de mieux comprendre l’influence de ces cellules sur le phénotype cutané à l’état d’équilibre. Bien que d’autres études soient nécessaires avant l’utilisation de ces modèles en phase préclinique, ces travaux constituent une avancée majeure dans le développement de modèles produits par génie tissulaire, plus complexes et plus pertinents d’un point de vue physiologique. / Psoriasis is characterized by the presence of inflammatory leukocyte infiltrates in the human skin dermis and epidermis, leading to important skin disorders: hyperproliferation of basal epidermal cells, altered differentiation of keratinocytes, and increased secretion of proinflammatory mediators in the local microenvironment. This immuno-epithelial dysfunction leading to the development of whitish lesions acts as an uncontrollable vicious circle, stimulating the keratinocytes and the immune cells. With this in mind, my thesis work aimed to: (1) generate an immunocompetent microenvironment by integrating pre-activated T cells into a healthy, non-lesional and lesional skin model, produced using the self-assembly method (2) to study the role of this essential component on key features associated with psoriasis. In addition, our other objective was (3) to analyze the impact of monocyte-derived macrophages in a three-dimensional model of healthy skin (4) to determine the influence of these cells on tissue remodeling and epidermal differentiation at steady state, (5) in order to finally analyze the microenvironment effect on their in vitro polarization. Our data highlight the essential feature of the immune component, when associated with pathological skin cells, in the development of psoriatic lesions, since the presence of T cells, in a healthy skin model, does not induce all of the histopathological key features, associated with the dermatosis. On the other hand, these models of immunocompetent skin respond to a treatment of choice for psoriasis, methotrexate, which inhibits cell proliferation and reduces inflammation. These new organotypic models will serve as powerful preclinical tools for the screening of active agents to treat some chronic inflammatory pathologies of autoimmune origin, in which the immune system plays a crucial role, like psoriasis. Moreover, the integration of monocytederived macrophages into a normal skin model affects the differentiation state of epidermal keratinocytes while reducing the basal inflammatory state. These macrophages induce, in addition, a significant matrix remodeling thereby modifying the surrounding microenvironment. Finally, this new three-dimensional model allowed us, on the one hand, to further mimic the physiological cutaneous structure and, on the other hand, to better understand the influence of these cells on the skin phenotype at steady state. Although further studies are needed prior to the use of these preclinical models, this work represents a major breakthrough in the development of more complex tissue-engineered models that are physiologically relevant.

Les brûlures profondes et étendues sont, de loin, le traumatisme le plus grave auquel un être humain peut faire face. La rapidité de couverture de ces plaies avec des pansements, surtout de nature biologique (p. ex. peau de cadavre), d’abord temporaire, et ensuite impérativement permanente, aura une influence déterminante sur le taux de survie des patients. À date, de nombreuses technologies ont été utilisées telles que les greffes pleines épaisseurs de peau provenant d’un site donneur sain, la culture d’épiderme autologue (CEA) et les substituts synthétiques. Cependant, ces technologies ont pour principale limite, respectivement, leur biodisponibilité, leur manque de propriété mécanique et leur manque d’activité biologique. Ces éléments ont ainsi mené au développement de substituts biologiquement actifs parmi lesquels les plus prometteurs possèderont une base autologue, l’épiderme, reposant sur une matrice, allogénique, xénogénique ou biosynthétique. Toutefois, la majorité de ces substituts ne pourra être utilisée que temporairement à cause de leur potentiel immunogénique résultant de la présence d’antigènes étrangers. Les technologies de production de substituts cutanés peuvent être divisées en deux approches distinctes, soit de type « Top-down », soit de type « Bottom-up ». La technologie la plus courante ainsi que la plus utilisée aujourd’hui est celle de type « Top-down ». Les substituts produits par cette approche se basent sur des matrices artificielles structurées élaborées via deux classes majeures de biomatériaux incluant (1) les biopolymères du sang comme la fibrine, et du tissu mou comme le collagène et la fibronectine ; (2) les polysaccharides, comme l’alginate, le chitosan et les glycosaminoglycanes, incluant le hyaluronan. L’approche de type « Bottom-up », quant à elle, se base sur la capacité des cellules à synthétiser et assembler leur propre matrice extracellulaire. Dans ce domaine, le laboratoire d’organogénèse expérimentale (LOEX) se positionne en tant que pionnier dans une méthode de production de substitut dite « d’auto-assemblage ». Cette méthode repose sur la capacité de l’acide ascorbique à promouvoir l’assemblage matriciel sécrété par les fibroblastes dermiques. Toutefois, les substituts obtenus par cette méthode présenteront (1) un temps de production long, car l’assemblage matriciel représentera à lui seul les 2/3 de la technique d’un total d’environ 8 à 9 semaines, (2) un manque de photoprotection de par l’absence de pigmentation, c’est à-dire sans ajout de cellules pigmentogènes (mélanocytes), et (3) peu ou pas de réseau de fibres élastiques, essentiel aux propriétés mécaniques cutanées. Afin de répondre aux problématiques identifiées, nous avons entrepris de concevoir plus rapidement des substituts cutanés pigmentés, intégrant un réseau de fibres élastiques selon la méthode d’autoassemblage. Pour ce faire, nous avons investigué la possibilité d’utiliser un derme reconstruit par « auto-assemblage » de type allogénique combiné à un épiderme syngénique. Cette modification au protocole qui implique initialement une reconstruction dermique et épidermique autologue à 100 % permettra d’éliminer l’étape de production dermique et ainsi réduire le temps global de production des substituts cutanés bilamellaires. L’esthétisme et la fonctionnalité des substituts ont été évalués par l’ajout de différentes densités de mélanocytes lors de la reconstruction de l’épiderme. Enfin, parallèlement à cette étude, nous avons investigué sur la faible présence du réseau de fibres élastiques dans nos substituts cutanés afin de proposer une technique de production modifiée permettant d’induire l’élastogenèse, le processus de formation de ce réseau. Plus spécifiquement, de l’aldostérone, une hormone minéralocorticoïde, et son inhibiteur compétitif, la spironolactone, ont été ajoutés dans le milieu de culture cellulaire en tout temps lors de la production des substituts cutanés afin de stimuler la voie de l’ « insulin-like growth factor I » (IGF-I) et ainsi l’élastogenèse. En résumé, mon projet de doctorat a permis de mettre en évidence : (1) la survie des fibroblastes allogéniques dermiques pour au moins huit semaines après greffes sur un modèle murin immunocompétent ; (2) qu’un seuil minimal de 200 mélanocytes par mm2 à la reconstruction de l’épiderme avait la capacité d’induire une pigmentation homogène après greffe, ainsi qu’une photoprotection comparable à une densité de 1500 mélanocytes par mm2 ; (3) que l’ajout d’aldostérone et de spironolactone augmente le nombre de fibres élastiques dans nos substituts cutanés et améliore les propriétés mécaniques par la diminution de la rétraction et l’augmentation de l’élasticité. De plus, l’ajout de mélanocytes a aussi permis d’améliorer les propriétés mécaniques des peaux reconstruites par leur effet positif encore mal compris sur l’élastogenèse. / Vast deep burns injuries are, by far, the worst trauma that a human being can experience. The time necessary for the coverage of thermal wounds with bandages, especially of a biological nature (e.g. cadaveric skin), at first temporary, and then permanently, influences the survival rate of patients. Over the years, numerous technologies were used to cover the skin wounds. Among them, we note split- and full-thickness skin grafts from a spared donor site, as well as cultured epithelial autografts (CEAs) and synthetic substitutes. However, these technologies showed some issues as the bioavailability of donor tissue or mechanical properties or biological activities. Indeed, it is the cellular and the extracellular matrix component that have a direct impact on the wound healing and on the longterm graft survival rate. In this way, new biologically active skin substitutes were developed. The most promising reconstructed skins to date are composed of an autologous epidermis associated with an extracellular matrix either allogeneic or xenogeneic or biosynthetic. However, the majority of these substitutes could only be used as temporary because of their immune inflammatory risk resulting from the presence of allogeneic or xenogeneic cells. Tissue-engineered technologies can be split in two approaches, either "Top-Down" or "Bottom-up". The most current as well as the most represented technology today is the "Top-Down" approach. Substitutes produced by this approach are based on structured artificial matrices developed via the major classes of biomaterials including (1) blood’s biopolymers such as fibrin, and components of the soft tissue such as collagen or fibronectin and (2) polysaccharides, as alginates, chitosan and glycosaminoglycan, including the hyaluronan. Alternatively, the "bottom-up" approach is based on the fibroblast’s capacity to synthesize and assemble their own extracellular matrix. In this field, the Laboratory of Organogenesis Experimental (LOEX) is a pioneer in a method of production of skin substitute called the "self-assembly" method. This method is based on the capacity of ascorbic acid to promote the extracellular matrix assembly secreted by fibroblasts. However, the histology and mechanical properties of these tissue-engineered skin substitutes, which are similar to native skin, (1) are quite long to produce, essentially because of the extracellular matrix assembly which takes twothird of the time of the whole production (2) lack of photoprotection, since pigment-producing cells called melanocytes are not added in the standard production and (3) the elastic fiber network, essential to insure their mechanical properties, is rudimentary. To address the identified problems, we designed a faster way to produce pigmented skin substitutes, integrating an elastic fiber network by tissue engineering according to the “self-assembly” method. To do so, we investigated the possibility of using an allogeneic reconstructed dermis associated with a syngeneic epidermis. This new method would allow eliminating two-third of the production time of the dermal part initially requested in the “on demand” production that was initially 100 % autologous. Estheticism and its functionality were evaluated by the addition of various densities of melanocytes during the epidermis reconstruction. Finally, at the same time, we addressed the weak presence of the elastic fiber network in our reconstructed skin. Indeed, we modified our production method to stimulate the elastogenesis process. More specifically, aldosterone, a mineralocorticoid hormone, and its competitive inhibitor, spironolactone, were added in the culture media during the skin substitute production in order to stimulate the insulin-like growth factor I (IGF-I) pathway and so the elastogenesis process. To conclude, my PhD project allowed to highlight: (1) the immunological tolerance of the allogeneic dermis with a long-term survival of their cellular components over the eight-week period, investigated in an immunocompetent murine model ; (2) that a minimal threshold of 200 melanocytes per mm2 in the epidermis reconstruction had the capacity to lead a homogeneous pigmentation after the transplant, as well as a photoprotection comparable to a 1500 melanocytes per mm2 density ; (3) that the addition of aldosterone and spironolactone increased the number of elastic fibers in our skin substitutes and improved the mechanical properties by the decrease of the shrinkage and the increase of the elasticity. Furthermore, the addition of melanocyte also increased the mechanical properties of the skin substitute. This positive impact on elastogenesis by melanocytes is poorly understood.