Le psoriasis est une inflammation chronique assistée du système immunitaire chez l’homme. Dans les lésions psoriasiques, les modifications microanatomiques vasculaires sont un des principaux signes d’une peau psoriasique. Cette étude visait à créer une peau vascularisée reconstruite, bien caractérisée, et facile d’accès pour l’évaluation des candidats au médicament ainsi que pour l’étude de la biologie de l’inflammation et de l’angiogenèse. Les équivalents de peau psoriasique et saine vascularisée ont été produits à l’aide de la méthode par auto-assemblage, qui a été modifiée par l’ajout de cellules endothéliales dermiques microvasculaires humaines. Les similitudes architecturales et caractéristiques des substituts avec l’échantillon in vivo ont été analysées par coloration au trichrome de Masson. Un épiderme bien développé a été observé sur les substituts de peau saine, étant donné qu’un épiderme hyperprolifératif a été observé sur des substituts de peau psoriasique. La nature psoriasique des substituts a été étudiée à l’aide de niveaux d’expression de cytokératine et de marqueurs de différenciation. Les conditions nécessaires à la vascularisation des substituts ont été optimisées. La formation, la différenciation, l’ampleur et la quantité de structures pseudo-capillaires ont été observées dans le cadre d’études par immunofluorescence in toto (IFIT) en utilisant des marqueurs de cellule endothéliale. Les résultats d’études IFIT indiquent que les réseaux pseudo-capillaires à l’intérieur des substituts de peau psoriasique étaient plus ramifiés, denses, chaotiques et nombreux par rapport aux échantillons de contrôle sains, à cause de l’élément de provocation angiogénique du psoriasis. / Psoriasis is an immune-system-mediated chronic inflammation in mankind. In psoriatic skin lesions, vascular microanotomical modifications are one of the important hallmarks of psoriatic skin. The aim of this study was to develop a wellcharacterized and easily accessible reconstructed vascularized psoriatic skin for the evaluation of drug candidates and studying the biology of inflammation and angiogenesis. The vascularized psoriatic and healthy skin equivalents were produced using the self-assembly method, which was modified by the addition of human microvascular dermal endothelial cells. The architectural and characteristic similarities of substitutes to the in vivo condition was analyzed with Masson’s trichrome staining. A well-developed epidermis was observed in healthy skin substitutes, whereas a hyperproliferative epidermis was observed in psoriatic skin substitutes. The psoriatic nature of substitutes was studied with cytokeratin expression levels and differentiation markers. The required conditions for vascularization of substitutes were optimized. The formation, differentiation, extends and the quantity of capillary-like structures were observed with whole-mount immunofluorescence (wmIF) staining studies using endothelial cell markers The results of wmIF studies showed that the capillary-like networks within psoriatic skin substitutes were more branched, dense, chaotic and numerous compared to healthy controls because of the angiogenic provocation feature of psoriasis.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2022 / La greffe de peau autologue chez les grands brûlés est une technique répandue, mais souvent limitée lorsque le patient présente une petite surface disponible pour le prélèvement des greffons. Les substituts de peaux bilamellaires autoassemblés (PRB) permettent de pallier cette limitation, mais leur production est longue. Le but de cette étude est donc d'optimiser la méthode pour réduire le délai nécessaire avant la première greffe. Pour cela, nous souhaitons développer une technique de décellularisation et d'entreposage de dermes allogéniques produits par autoassemblage. Notre hypothèse est que les PRB produites avec les dermes reconstruits décellularisés (DRD) sont comparables aux PRB préparées avec le protocole du LOEX (Germain et al., 2018) présentement en essai clinique. Nos objectifs sont de trouver les conditions permettant d'éliminer les résidus allogéniques des dermes décellularisés et de les recellulariser de manière à soutenir la différenciation épidermique et la formation de la jonction dermoépidermique. Nous avons déterminé que l'utilisation de deux cycles de choc osmotique avec 0,4 mg/mL de DNAse permet de réduire la quantité résiduelle d'ADN allogénique en dessous de 50ng/mg de tissu sec. L'entreposage d'un mois permet de complémenter cette décellularisation en diminuant la dose de DNAse nécessaire à 0,2mg/mL. En testant différentes populations pour la formation matricielle et densités de fibroblastes pour la recellularisation de DRD, nous avons déterminé que la recellularisation d'une matrice riche en collagène avec une faible densité de fibroblastes (10 000 f/cm$^2$) permet d'obtenir des PRB similaires histologiquement aux PRB standards. Cette recellularisation permet également de regagner les glycosaminoglycanes et l'épaisseur perdues lors de la décellularisation. En conclusion, la méthode de décellularisation utilisée est efficace pour l'atteinte des seuils établis par la littérature et complémentée par l'entreposage des DRD. La recellularisation de ces matrices permet l'obtention de PRB de manière accélérée par rapport à la méthode classique. Le tout est adapté pour une translation clinique. / Autologous skin grafting in burn patients is a widespread technique, but often limited when patients have a small area available for graft harvesting. Self-assembled skin substitutes (SASS) can overcome this limitation, but their production is time consuming. The aim of this study is therefore to optimize the method in order to reduce the time required before the first graft. To this end, we aim to develop a technique for decellularization and storage of allogeneic dermis produced by the self-assembly approach. Our hypothesis is that SASS produced with decellularized reconstructed dermis (DRD) are comparable to autologous SASS prepared with the LOEX protocol(Germain et al., 2018) currently in clinical trial. Our objectives are to find conditions to remove allogeneic residues from decellularized dermis and recellularize it in a way that supports epidermal differentiation and dermal-epidermal junction formation. We determined that the use of two cycles of osmotic shock with 0.4 mg/mL DNAse reduces the residual amount of allogeneic DNA below 50 ng/mg of dry tissue. Storage for one month helps this decellularization by reducing the dose of DNAse required to 0.2 mg/mL. By testing different fibroblast populations and densities for recellularization, we determined that recellularization of a collagen-rich matrix with a low fibroblast density (10 000 f/cm2) yields SASS histologically similar to standard SASS. This recellularization also allows the retrieval of the glycosaminoglycans and thickness lost during decellularization. In conclusion, the decellularization method used is effective in meeting the thresholds established in the literature and is complemented by DRD storage. The recellularization of these matrices allows the obtention of SASS in an accelerated manner compared to the conventional method. This is suitable for clinical translation.

Le psoriasis est une maladie inflammatoire chronique de la peau impliquant l'apparition de lésions persistantes plus ou moins étendues sur le corps du malade qui affecte 2-3% de la population mondiale. Il est suggéré que la prolifération épidermique pathologique psoriasique est due à l'inflammation dans les lésions. Or, il a été montré que l'élimination des terminaisons nerveuses dans les lésions psoriasiques entraîne une disparition des lésions psoriasiques chez les patients par un mécanisme inconnu. Nous avons par conséquent posé l'hypothèse que les nerfs sensitifs ont la capacité d'induire le phénotype psoriasique par la sécrétion de neuropeptides suite à un stress. Pour répondre à cette hypothèse, nous avons développé, par génie tissulaire, un modèle de peau psoriasique issue de cellules cutanées de participants atteints de psoriasiques ou issue de participants sains auquel fut ajouté des neurones sensitifs murins. Nous avons observé que, de base, le modèle de peau psoriasique présente une prolifération et une épaisseur épidermique accrues par rapport au modèle de peau saine. De plus, lorsque traité avec du CGRP, un neuropeptide libéré par les neurones sensoriels, la prolifération des kératinocytes est accrue dans le modèle de peau psoriasique, mais pas dans le modèle de peau de saine. De surcroît, lorsque les réseaux nerveux sensoriels des modèles de peaux sont traités avec de la capsaïcine pour induire la libération de neuropeptides, une augmentation de la prolifération des kératinocytes dans le modèle de peau psoriasique est observée, mais pas dans le modèle de peau saine. L'implication du CGRP dans la prolifération des kératinocytes a été confirmée par l'ajout d'un antagoniste du CGRP qui a bloqué l'augmentation de la prolifération des kératinocytes dans le modèle de peau psoriasique suite à la stimulation nerveuse. Dans le but de caractériser la représentativité du modèle, nous avons analysé par immunofluorescence les peaux natives lésionnelles psoriasiques comparativement à leur contrepartie non-lésionnelle psoriasique ou des peaux natives saines. Nous avons observé que, selon les biomarqueurs étudiés, - soit filaggrine, loricrine, psoriasine, défensine humaine β-2, kératine 10, élafine, transglutaminase-1, desmogléine-1, kératine-16, CD3 et CD31 - les peaux non-lésionnelles et lésionnelles psoriasiques natives présentent des différences visuelles frappantes comparativement aux peaux saines natives. Cependant, notre modèle de peau psoriasique présente un profil de biomarqueurs unique et nous n'avons observé aucune modulation des biomarqueurs suite à un traitement au CGRP ou suite à la stimulation des réseaux nerveux sensoriels. Ainsi, nous avons montré que les neurones sensoriels peuvent participer directement à l'hyperprolifération des kératinocytes dans la formation de lésions psoriasiques via la libération de CGRP, indépendamment du système immunitaire. Notre modèle unique de peau psoriasique innervée, produit par génie tissulaire, pourrait être un outil novateur pour mieux comprendre le mécanisme par lequel les nerfs peuvent moduler la formation de lésions psoriasiques chez l'humain.

Le psoriasis est une maladie cutanée chronique à médiation immunitaire qui affecte environ 2 à 3 % de la population mondiale. Cette pathologie est le résultat d'une réponse immunitaire inappropriée, où l'environnement, les cellules de la peau et les cellules immunitaires interagissent de manière complexe. Parmi ces cellules immunitaires, les lymphocytes T auxiliaires de profil Th17 jouent un rôle central en produisant des niveaux élevés d'IL-17A en présence d'IL-23. Des traitements ciblant l'IL-23 ont démontré une grande efficacité, mettant en évidence son importance dans la pathogenèse du psoriasis. De plus, des études récentes ont mis en lumière le rôle crucial des cellules myéloïdes et de leurs cytokines, telles que le TNFα et l'IL -23, dans la persistance et la gravité de cette maladie. Cependant, malgré les avancées dans la compréhension de la maladie, il n'existe toujours aucun traitement curatif pour le psoriasis. Une des principales raisons de cette lacune réside dans la difficulté de reproduire fidèlement l'environnement inflammatoire présent dans les lésions cutanées psoriasiques. Les modèles *in vivo* et *in vitro* actuels présentent des limites, notamment des différences entre la peau humaine et animale, ainsi que l'utilisation de cellules cutanées saines qui ne reproduisent pas entièrement les caractéristiques du psoriasis. Ces limitations entravent le développement de nouveaux traitements efficaces pour cette maladie. Pour relever ce défi, l'objectif de ce projet de recherche était de développer un modèle de peau psoriasique 3D intégrant à la fois des lymphocytes T et des macrophages. L'objectif était de mieux représenter le contexte pathologique de la peau psoriasique afin de comprendre plus précisément les interactions complexes entre les lymphocytes T et les macrophages dans le contexte du psoriasis. Les résultats de cette étude sont prometteurs, montrant que ce nouveau modèle immunocompétent, faisant le lien entre l'immunité innée et adaptative, reproduit fidèlement les caractéristiques majeures de la peau psoriasique sans nécessiter l'ajout exogène de médiateurs pro-inflammatoires. Les résultats de ce projet ouvrent également de nouvelles perspectives pour une meilleure compréhension du rôle crucial des macrophages dans cette maladie complexe et montrent l'intérêt de cette nouvelle plateforme pour le développement de nouveaux traitements. / Psoriasis is a chronic immune-mediated skin disease that affects approximately 2 to 3% of the global population. This condition is the result of an inappropriate immune response in which the environment, skin cells, and immune cells interact in a complex manner. Among these immune cells, Th17 profile helper T lymphocytes play a central role by producing high levels of IL-17A in the presence of IL-23. Treatments targeting IL-23 have demonstrated great efficacy, highlighting its importance in the pathogenesis of psoriasis. Furthermore, recent studies have shed light on the crucial role of myeloid cells and their cytokines, such as TNFα and IL-23, in the persistence and severity of this disease. However, despite advances in understanding the disease, there is still no cure for psoriasis. One of the main reasons for this gap lies in the difficulty of faithfully reproducing the inflammatory environment present in psoriatic skin lesions. Current in vivo and in vitro models have limitations, including differences between human and animal skin, as well as the use of healthy skin cells that do not fully replicate the characteristics of psoriasis. These limitations hinder the development of new effective treatments for this disease. To address this challenge, the aim of this research project was to develop a 3D psoriatic skin model that incorporates both T lymphocytes and macrophages. The goal was to better represent the pathological context of psoriatic skin in order to understand more precisely the complex interactions between T lymphocytes and macrophages in the context of psoriasis. The results of this study are promising, showing that this new immunocompetent model, bridging the gap between innate and adaptive immunity, faithfully reproduces the major characteristics of psoriatic skin without the exogenous addition of pro-inflammatory mediators. The findings of this project also open new perspectives for a better understanding of the crucial role of macrophages in this complex disease and demonstrate the potential of this new platform for the development of new treatments.

Les cicatrices hypertrophiques sont la résultante de désordres fibrotiques caractérisés par un dépôt excessif de Matrice ExtraCellulaire (MEC) et une persistance anormale des myofibroblastes (cellules différenciées qui participent à la cicatrisation). Elles apparaissent régulièrement suite à un retard dans les délais de cicatrisation comme c'est le cas lors de la guérison des plaies de grandes surfaces caractéristiques des grands brûlés. Afin de comprendre les mécanismes mis en jeux dans cette pathologie notre équipe a utilisé le modèle de peau reconstruite par auto-assemblage avec des cellules épidermiques et dermiques issues de cicatrices hypertrophiques ou de peaux normales. Les études précédentes ont permis de montrer que l'épaisseur des dermes obtenus lors de culture de différents types cellulaires mésenchymateux est augmentée en présence de kératinocytes issus de cicatrices hypertrophiques (KH) par rapport à celle obtenue' lorsque des kératinocytes issus de cicatrices normales (KN) sont utilisés. Elles ont également pu attribuer cette variation d'épaisseur dermique à un effet paracrinien de l'épiderme. Nous avons poursuivi cette étude et identifié une protéine inhibitrice des métalloprotéinases : TIMP-1, sécrétée plus fortement par les KH par rapport aux KN. Cette dernière une fois ajoutée aux milieux de culture d'équivalents de peau reconstruite avec des KN in vitro induit une fibrose comparable a celle obtenue dans les équivalents de peau reconstruite avec des KH. Cette observation apporte une nouvelle donnée dans la connaissance des mécanismes moléculaires et cellulaires conduisant à la cicatrisation hypertrophique.

Le psoriasis est une maladie inflammatoire de la peau pour laquelle aucun traitement curatif n’a vu le jour jusqu’à présent. L’étiologie étant complexe, la recherche dans ce domaine vise donc une meilleure compréhension de la pathologie. Pour ce faire, il faut mettre sur pied des modèles in vitro représentatifs de la pathologie, ce que nous faisons au LOEX. Ce projet porte sur la caractérisation par profilage génique de notre modèle afin d’en poursuivre l’optimisation éventuelle. Pour ce faire, nous avons produit différents substituts sains, lésionnels et non-lésionnels, puis nous en avons analysé le transcriptome. Dans un second temps, nous avons tenté de mimer la condition inflammatoire via l’addition de cytokines au sein des substituts lésionnels. Ces résultats démontrent d’une part la force du modèle existant, mais d’autre part, que la supplémentation en cytokines a des effets positifs sur le transcriptome, le rendant quasi identique à celui de peaux psoriasiques in vivo. / Psoriasis is a chronic inflammatory skin disease for which no cure has emerged. Research in this area aims to better understanding its complex etiology. Representative models of the pathology are needed and it is part of our expertise to develop psoriatic skin substitutes at LOEX. This project has focused on the characterization of our model by gene profiling in order to pursue its optimization. Different kinds of substitutes were produced and the transcriptome was analyzed. We also attempted to mimic the addition of immune cells via the addition of cytokines during lesional skin reconstruction. Cytokines chosen were identified as playing a key role in psoriasis. These results demonstrated on one hand, the strength of our original model and on the other hand, the positive impact on the transcriptome that cytokines supplementation can produce, making it almost identical to psoriatic skin in vivo.

Une adaptation de la méthode d’auto-assemblage développée au LOEX permet de produire des substituts cutanés bicouches ayant un phénotype psoriasique. Le premier objectif de ce travail était d’évaluer si une conservation par la congélation des substituts cutanés était envisageable afin d’avoir accès à ces derniers en tout temps pour effectuer des analyses physiochimiques sans délais. Les études réalisées sur des substituts sains montrent qu’elle ne l’est pas dans sa méthodologie actuelle puisqu’elle affecte la fonction barrière des substituts. Par ailleurs, en raison du rôle des lipides épidermiques dans la fonction barrière et de leur implication dans le psoriasis, une caractérisation de ces lipides a été effectuée par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats obtenus montrent principalement une diminution de la proportion d’acide linoléique dans les substituts par rapport à la peau normale humaine. Ces résultats sont prometteurs en raison du rôle de cet acide et de ses métabolites dans l’inflammation. / Adaptation of the self-assembly method developed at LOEX allows us to produce bilayered skin substitutes with psoriatic phenotype. The first aim of this study was to evaluate if freezing of the skin substitutes is possible without affecting its integrity, in order to access the skin substitutes in anytime to perform physicochemical analysis without delay. Results, obtained with control skin substitutes produced via the standard described self-assembly method, showed that freezing clearly affected the skin barrier function of the skin substitutes. Moreover, because of their implication in skin barrier and in psoriasis pathology, epidermal skin lipids of control and psoriatic skin substitutes were characterized by gas chromatography. Results showed mainly a significant reduction of the linoleic acid proportion in skin substitutes compared to normal human skin. These results are promising because of the implication of linoleic acid and its metabolites in inflammation.

Le défi actuel des chercheurs est d’élaborer de nouveaux modèles de substituts cutanés plus perfectionnés et d’optimiser leur méthode de production afin d’améliorer leur reproductibilité. Cette étude a évalué l’impact de la congélation des substituts cutanés à -20°C pendant 2 mois via leurs propriétés physico-chimiques et leur fonctionnalité. Les analyses d’ATR-FTIR montrent que la cryopréservation n’affecte pas l’organisation des lipides de la couche cornée tandis que les analyses d’absorption percutanée montrent que la congélation affecte la perméabilité des substituts cutanés. De plus, le modèle de peau a été optimisé par l’incorporation de lymphocytes T permettant ainsi d’étudier le rôle des lymphocytes sur la différenciation cellulaire des kératinocytes et de mieux comprendre le rôle de la fractalkine dans le développement du psoriasis. Ces résultats nous incitent à penser que la fractalkine se démarque des autres cytokines inflammatoires dans le développement du psoriasis et se doit d’être mieux connue. / The current challenge for researchers is to develop new models for more advanced skin substitutes and optimize their production methods to improve reproducibility. This study evaluates the impact of the freezing of skin substitutes at -20°C for 2 months via their physicochemical properties and functionality. The ATR-FTIR analysis show that the cryopreservation did not affect the lipid organization of the stratum corneum while percutaneous absorption analysis show that the freezing of the permeability affects skin substitutes. In addition, the skin model was optimized by incorporating T lymphocytes and to study the role of lymphocytes in cell differentiation of keratinocytes and better understand the role of fractalkine in the development of psoriasis. These results lead us to believe that fractalkine differs from other inflammatory cytokines in the development of psoriasis and should be investigated.