Le génie tissulaire est une technologie prometteuse pour combler la pénurie de tissus. Cependant, la culture requise avant la greffe peut potentiellement conduire à la transmission d’agents infectieux ainsi qu’à des réactions immunitaires déclenchées par des protéines animales résiduelles. Lors de la reconstruction de tissus par auto-assemblage, l’ajout d’acide ascorbique et de sérum bovin stimule les cellules à sécréter la matrice extracellulaire pour résulter en tissu. En vue d’une utilisation clinique, des produits sans xénogène ont été testés. Le milieu défini LM enrichi de 1% de sérum humain stimule la prolifération cellulaire et ce milieu sans sérum soutient la différenciation adipogénique. Plusieurs analyses ont permis de caractériser les tissus adipeux produits: ils contiennent de petits adipocytes, sont 1,8 fois plus épais et deux fois moins contractiles que ceux produits en milieu standard. Ces résultats indiquent que des tissus conjonctifs et adipeux sécuritaires peuvent être produits pour de futures greffes. / Tissue engineering is a promising technology to address the shortage of tissues. However, culturing cells in vitro prior to transplantation can potentially lead to transmission of infectious agents as well as immune responses triggered by residual animal proteins. During tissue reconstruction by the self-assembly method, ascorbic acid and bovine serum stimulate cells to secrete extracellular matrix resulting in a manipulatable tissue. For clinical purposes, xenogenic-free products were tested. The defined medium (LM) enriched with 1% human serum stimulated cell proliferation and serum-free medium supported the adipogenic differentiation. Several analyses were performed to characterize the reconstructed adipose tissues: they contain small adipocytes, are 1.8 times thicker and half as contractile as those produced in standard medium. These results indicate that improved connective and adipose tissues can be produced for future transplantation.

La production de tissus par génie tissulaire est un domaine dont la finalité clinique est en pleine expansion. De nombreux facteurs restent cependant à améliorer afin de permettre leur utilisation extensive. Nos objectifs étaient d’évaluer la capacité d’extraits d’algue et des molécules isolées de sérum à optimiser différentes étapes de la production des tissus par génie tissulaire. Nos hypothèses étaient que l'ajout des extraits d’algue diminue le temps de fabrication des peaux reconstruites en stimulant la production et le dépôt de matrice alors que les protéines isolées du sérum stimulent la production de microparticules (MP) par les cellules du derme, ces MP ayant été démontrées avoir une action sur la croissance des cellules endothéliales et donc sur la vascularisation des greffons. / Skin production by tissue engineering method is a field whose clinical purpose is expanding. However, many factors need to be improved to enable their extensive use. Our objectives were to evaluate the ability of seaweed extracts and serum molecules to optimize different stages of tissue-engineered skin production. Our hypotheses were that adding seaweed extracts reduces the manufacturing time of reconstructed skin by stimulating the production and the deposition of the extracellular matrix while serum- isolated proteins stimulate the production of microparticles (MP) by the dermal cells, the MP stimulating growth of endothelial cells and thus, potentially, vascularization of the grafts.

Titre de l'écran-titre (visionné le 15 mai 2023)

En raison des problèmes inhérents aux biomatériaux et à la transplantation d’organes, tels que la durée de vie, le rejet et la disponibilité, l'ingénierie tissulaire est désormais envisagée à plus long terme comme solution de remplacement des organes défaillants. Cette approche vise à induire et structurer la croissance tissulaire afin d’organiser les cellules en tissus et ces tissus en organes. Pour ce faire, un bioréacteur reproduisant les conditions intracorporelles est indispensable. Au cours de ce projet de maîtrise, un bioréacteur à perfusion spécifique à la régénération des artères a été conçu pour favoriser la croissance de ce tissu et étudier l’effet des diverses contraintes mécaniques (tension axiale, élongation axiale, pression interne, débit, cisaillement) sur ses propriétés mécaniques finales. La conception du bioréacteur a été effectuée suivant une méthodologie rigoureuse comprenant l’identification des besoins, la rédaction du cahier des charges, la modélisation assistée par ordinateur, la réalisation du prototype et la validation. Ce bioréacteur sera par la suite utilisé par le laboratoire pour le développement d’un substitut artériel ayant les propriétés et la structures d’une artère native. / Tissue engineering provides a new approach for overcoming the current problem of organ shortage and biomaterial failure. Three-dimensional tissues, such as arteries, are much more difficult to regenerate than bi-dimensional ones. In this context, a specific bioreactor is required in order to reproduce and maintain the appropriate environment required for 3-D tissue regeneration. During this project, a perfusion bioreactor specific for arterial tissue was designed to stimulate growth and study the effects of mechanical factors such as axial stress, axial strain, internal pressure, flow and shear stress, on final construct properties. The design was realized following a step-by-step methodology: identification of the needs, listing of the specifications, computer assisted modeling and design, and prototype realisation and validation. This bioreactor will be used by the laboratory for the development of an arterial substitute with similar properties and structure of a native artery.

Recréer des tissus en laboratoire pour remplacer ou améliorer la fonctionnalité d’un organe défaillant, ou créer un tissu modèle pour tester de nouveaux médicaments comme alternative aux expérimentations animales, n’est plus aujourd’hui du domaine de la science fiction. L’ingénierie tissulaire vasculaire s’appuie sur la capacité des cellules à régénérer un néo-tissu lorsque placées dans des conditions de culture appropriées. Face au manque de vaisseaux sanguins autologues lors de pontages coronariens ou périphériques, elle apporte un nouvel espoir de plus en plus concret quant à la création de substituts en laboratoire pour le remplacement de vaisseaux sanguins de petit diamètre (< 6 mm). L’approche adoptée dans le cadre de cette thèse consiste à utiliser une protéine naturelle, le collagène, comme support de la croissance des cellules vasculaires, acteurs majeurs de la régénération tissulaire. Cependant, en dépit des grandes performances biologiques du collagène (reconstitué en laboratoire), son utilisation est limitée par un manque de propriétés mécaniques. L’objectif de cette thèse est de renforcer les structures de collagène supportant les cellules, afin de pouvoir soumettre ces dernières à des stimulations mécaniques et biochimiques requises pour la maturation du tissu en croissance et appliquées dans un bioréacteur "dynamique". Dans un contexte où aucune norme de caractérisation mécanique des hydrogels n’existe, cette thèse a permis de définir les conditions les plus appropriées pour évaluer les comportement mécanique et viscoélastique des échafaudages de collagène seuls : ils doivent être testés dans un environnement pseudo-physiologique (bain de PBS à 37°C) sans préconditionnement mécanique, et mesurés en relaxation de contrainte, qui permet notamment d’accéder au module élastique, paramètre important lorsqu’un matériau subit des sollicitations mécaniques cycliques. Par la suite, et après avoir montré les effets modérés d’un agent de réticulation physique (exposition aux UVs), le développement d’un bioréacteur dit « statique » a permis de mettre en évidence le fort potentiel des cellules musculaires lisses à renforcer les structures tubulaires de collagène lors d’une période de culture statique. Les résultats des techniques de caractérisation mécanique spécifiquement développées et des techniques d’imagerie microscopique montrent qu’à l’issue de cette culture la réorganisation des cellules ainsi que des fibrilles de collagène s’accompagnent d’un remarquable renforcement mécanique et viscoélastique de la construction artérielle, prête à être placée dans un bioréacteur dynamique. Dans la perspective de la régénération tissulaire, outre l’importance de la relation structure-propriété et des interactions cellulesmatrice extracellulaire, ce projet souligne le rôle primordial de la culture en conditions statiques avant la culture dans un bioréacteur dynamique. / Designing biological tissues in laboratory in order to replace or improve the functionality of a failing organ, or create a tissue which could be a model to test new medicinal formulations as alternative to animal experiments, is no longer a dream and is worth being considered. Tissue engineering is based on the ability of cells to regenerate a neo-tissue when cultured in adequate culture conditions. To address the lack of autologous blood vessels for peripheral or coronary bypass, vascular tissue engineering brings new hopes in creating substitutes in vitro in order to replace small diameter blood vessels (< 6 mm). The scientific approach of this thesis work consists in using a natural protein, collagen, as a scaffold to make the vascular cells proliferate. The main objective of this thesis is to reinforce the collagen structures supporting cells, in order to be able to mechanically and biochemically stimulate them during the maturation of the growing tissue in a "dynamic" bioreactor. It is noteworthy to point out that there is no standard method to mechanically characterize hydrogels. This thesis work managed to define the most adequate conditions to estimate the mechanical and the viscoelastic properties of collagen scaffolds: they must be tested in a pseudo-physiological environment (PBS bath at 37°C) without mechanical preconditioning and measured in stress relaxation, which gives the elastic modulus, an important parameter to consider when a material is subjected to cyclic mechanical stimulation. Then, after having shown relative effects of a physical reticulation agent (UVs exposure), the development of a "static" bioreactor showed the high potential of smooth muscle cells to reinforce the tubular collagen structure during a static culture period. The results of the mechanical characterization techniques specifically developed for this project, and microscopic imaging techniques, show that at the end of this culture period, the reorganization of the cells and of the collagen fibrils leads to a noteworthy mechanical and viscoelastic reinforcement of the vascular construct, mature enough to be put in place in a dynamic bioreactor. In the perspective of tissue regeneration, and considering the importance of the structure-properties relations and cells-extracellular matrix interactions, this thesis project establishes the important role of the static culture period preceding the culture period in the dynamic bioreactor.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative hétérogène, incurable et sans traitement efficace qui se caractérise principalement par une dégénérescence sélective des neurones moteurs de la moelle épinière et du cerveau. Cette maladie se présente généralement par une faiblesse musculaire progressive, une hypertonie spastique, de la dysphagie, l’apparition de fasciculations, une paralysie presque totale et le décès de 3 à 5 ans après l’apparition des premiers symptômes. La SLA se présente sous deux formes distinctes : la SLA de type familial (SLAF) et la SLA de type sporadique (SLAS). La SLAF est associée à des mutations génétiques précises et est transmise de façon autosomale dominante dans la très grande majorité des cas. Quant à la SLAS, elle se distingue par son côté sporadique, sans cause génétique associée, et représente de 90 à 95 % de tous les cas de SLA. La peau est considérée par certains comme le plus grand organe du corps humain. Elle joue un rôle important dans la thermorégulation ainsi que dans la synthèse de la vitamine D et agit comme barrière naturelle contre l’environnement. Ses couches principales, l’épiderme et le derme, sont principalement et respectivement formées de kératinocytes et de fibroblastes. Le concept du « non-cell autonomous toxicity » stipule qu’une cellule ne présentant pas de mutation associée à une maladie donnée peut présenter un phénotype pathologique. Dans l’étude de la SLA, ce concept s’applique tant aux cellules neuronales qu’aux cellules non neuronales, comme les cellules endothéliales ou les fibroblastes de peau. Hors du système nerveux central, les fibroblastes de peau pourraient représenter une source importante et non invasive d’échantillons biologiques pour l’étude de la SLA. Les exosomes sont des vésicules extracellulaires de 30 à 200 nm de diamètre. Ils sont sécrétés par tous les types cellulaires et représentent un moyen de communication cellulaire important grâce au transport de diverses molécules, dont des protéines et de l’ARN. Ces vésicules représentent une potentielle source de biomarqueur pour l’étude de diverses maladies neurodégénératives, dont la SLA. Dans le cadre du projet de recherche présenté dans cette thèse, les travaux réalisés ont permis de démontrer que l’utilisation de cellules de peau, dont des fibroblastes et des kératinocytes de patients atteints de SLA, permet d’étudier certains aspects de la pathologie de la maladie. En effet, l’utilisation d’un protocole de production de peau reconstruite en laboratoire par génie tissulaire à partir de cellules de patients atteints de SLA a permis de détecter différentes anomalies de la matrice extracellulaire en plus d’une délocalisation de la protéine TDP-43, précédemment détectée uniquement dans le système nerveux central de patients atteints de SLA. Les fibroblastes de peau ont aussi été démontrés comme étant une source d’intérêt pour la découverte de biomarqueurs associés à la maladie. Le sécrétome - le matériel biologique sécrété par une cellule – provenant des fibroblastes peut être purifié à l’aide d’une technique de précipitation protéique qui permet d’obtenir un culot pur, exempt d’impuretés et de sels provenant du milieu de culture. Parmi les éléments identifiés chez les protéines, les exosomes ont été démontrés d’intérêt et importants dans leur culture. En effet, lorsque cultivés en trois dimensions, les exosomes dérivés de fibroblastes de peau 3D contiennent différentes molécules augmentant la prolifération ainsi que la migration cellulaire. De plus, ces vésicules extracellulaires contiennent une grande quantité de protéines de la matrice extracellulaire, démontrant leur importance dans la sécrétion et l’assemblage de celle-ci en culture 3D. Ces exosomes ont de plus la capacité d’améliorer le processus de guérison de plaies dans un modèle de peau reconstruite en laboratoire formé de fibroblastes et de kératinocytes. Finalement, la protéine SOD1, associée au développement de certains types de SLA familiale, a pu être démontrée comme étant un biomarqueur neuropathologique possible de la SLA sporadique. Au même titre que des patients présentant une mutation du gène SOD1, des patients atteints de SLA sporadique présentent certains aspects pathologiques associés à la maladie, dont la présence d’agrégats cytoplasmiques de la protéine mal repliée dans les neurones moteurs du système nerveux central. Globalement, mes travaux démontrent que les cellules de peau représentent un échantillon biologique important dans l’étude de la SLA et qu’elles pourraient constituer un outil novateur dans la découverte de nouveaux biomarqueurs de la maladie. Les exosomes sécrétés par les fibroblastes de peau en culture 3D ont été démontrés comme étant importants dans la prolifération, la migration cellulaire et la sécrétion de protéines de la matrice extracellulaire. Ces vésicules présentent un potentiel énorme dans la découverte de biomarqueurs associés à la maladie. La présence d’agrégats cytoplasmiques de la protéine SOD1 dans les neurones moteurs du système nerveux central de patients atteints de SLA sporadique permet de croire que cette protéine pourrait devenir un biomarqueur important dans le diagnostic de la maladie. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a heterogenous neurodegenerative disease. Presently, it is an incurable disease without any effective treatment and is characterised by selective degeneration of motor neurons in the central nervous system. The symptoms that most patients display include cramps, weakness and muscle atrophy of the hands and feet progressing to the forearms, shoulders and legs, eventually leading to complete paralysis. Nearly 90% of all ALS cases are sporadic, with no known cause. The other 10% of cases represent familial ALS and are associated to ALS-linked genes, such as SOD1, FUS/TLS, TARDBP, and C9ORF72. The skin is considered by some to be the biggest organ of the human body. It plays an important role in thermoregulation as well as vitamin D synthesis. Skin also acts as a natural barrier against environmental threats. It is comprised of the epidermis and the dermis, which are made of keratinocytes and fibroblasts, among other things. The non-cell autonomous toxicity paradigm in ALS has been well established. Outside of the central nervous system, skin fibroblasts could potentially be an important source of biomarkers. The work presented in this thesis demonstrates that skin cells, such as fibroblasts and keratinocytes, derived from ALS patients, allow for the study of different pathological aspects of the disease. The use of a tissue-engineered skin from ALS patients skin cells allows for detection and observation of extracellular matrix structure abnormalities, as well as mislocalization of TDP-43, previously only detected in the motor neurons of patients. Results from experiments associated with this study shed more light on skin fibroblasts, which appear to be a potential source of novel biomarkers. Their secretome can be purified using an optimized protocol leading to pure proteins without salt contamination coming from the cell culture media. As a result, exosomes are of great interest for the discovery of novel biomarkers for the diagnosis of ALS, for following its progression, and for the culture of fibroblast cells. When cultivated in a 3D-fashion, the secreted exosomes contain molecules enhancing cell proliferation and migration, as well as high amounts of extracellular matrix proteins. These extracellular vesicles also help to enhance wound healing in a tissue-engineered model made of skin fibroblasts and keratinocytes. Finally, the SOD1 protein, which is associated with the development of some familial ALS cases, should be considered a potential neuropathological biomarker of sporadic ALS. Cytoplasmic aggregates of the misfolded protein were detected in the motor neurons of sporadic patients, alongside familial ALS patients who were carriers of an SOD1 mutation. Overall, this work shows that skin cells represent an important and minimally invasive biological sample in the study of ALS. These cells are also of interest in the discovery of novel ALS biomarkers. Exosomes secreted by skin fibroblast cells in a 3D culture are important in cell proliferation and migration. They play a crucial role in extracellular matrix protein secretion. The results of this study show that exosomes, proven to be secreted by dermal fibrobasts when cultivated in a 3D fashion, may become as a primary source of biomarkers in ALS. Cytoplasmic aggregates of misfolded SOD1 in motor neurons of sporadic ALS patients could lead to the development of diagnostic tests with SOD1.

Afin de comprendre les mécanismes impliqués dans la réépithélialisation des plaies cutanées, des expériences ont été réalisées chez la souris et à l'aide d'un nouveau modèle tridimensionnel humain issu du génie tissulaire. Bien qu'ayant eu lieu en fonction du temps, les expériences réalisées montrent que les changements, qui se produisent lors de la réépithélialisation, dépendent de la localisation des cellules dans l'épiderme en régénération. L'étude de l'expression des protéines de stress chez la souris révèle que chacune possède son propre patron d'expression au long de l'épiderme en régénération : Hsp60 et Hsp70 semblent associées à la prolifération des kératinocytes; Hsp27 et Hsp90, à leur différenciation. Les observations recueillies avec le modèle in vitro de guérison des plaies suggèrent deux mécanismes complémentaires de réépithélialisation : 1) le déplacement passif des couches superficielles à partir des marges de la plaie; 2) la régénération épidermique au centre des plaies à partir de la prolifération des kératinocytes locaux et leur migration les uns par-dessus les autres afin de faire progresser l'épiderme en régénération.

Les substituts valvulaires disponibles actuellement comportent encore plusieurs lacunes. La disponibilité restreinte des allogreffes, les risques de coagulation associés aux valves mécaniques et la durabilité limitée des bioprothèses en tissu animal sont toutes des problématiques que le génie tissulaire a le potentiel de surmonter. Avec la méthode d'auto-assemblage, le seul support des cellules consiste en leur propre matrice extracellulaire, permettant la fabrication d'un tissu entièrement libre de matériau exogène. Ce projet a été précédé par ceux des doctorantes Catherine Tremblay et Véronique Laterreur, ayant respectivement développé une méthode de fabrication de valves moulées par auto-assemblage et une nouvelle version de bioréacteur. Au cours de cette maîtrise, le nouveau bioréacteur a été adapté à une utilisation stérile avec des tissus vivants et la méthode de fabrication de valves moulées a été modifiée puis éprouvée avec la production de 4 prototypes. Ces derniers n'ont pas permis d'obtenir des performances satisfaisantes en bioréacteur, motivant la conception d'une nouvelle méthode. Plutôt que de tenter de répliquer la forme native des valves cardiaques, des études récentes ont suggéré une géométrie tubulaire. Cela permettrait une fabrication simplifiée, une implantation rapide, et un encombrement minimal en vue d'opérations percutanées. Cette approche minimaliste s'accorde bien avec la méthode d'auto-assemblage, qui a déjà été utilisée pour la production de vaisseaux de petits diamètres. Un total de 11 tubes ont été produits par l'enroulement de feuillets fibroblastiques auto-assemblés, puis ont été transférés sur des mandrins de diamètre inférieur, leur permettant de se contracter librement. La caractérisation de deux tubes contrôles a démontré que cette phase de précontraction était bénéfique pour les propriétés du tissu en plus de prévenir la contraction en bioréacteur. Les prototypes finaux pouvaient supporter un écoulement physiologique pulmonaire. Cette nouvelle méthode montre que le procédé d'auto-assemblage a le potentiel d'être utilisé pour fabriquer des valves cardiaques tubulaires. / High hopes are placed on tissue engineered heart valves to circumvent the restricted availability of allografts, the coagulation risks caused by mechanical valves and the limited durability of pericardial bioprostheses. With the self-assembly method, the only support for the cells is the extracellular matrix they themselves produce, allowing the tissue to be completely free from exogenous materials during its entire fabrication cycle. The project was preceded by those of the doctorate students Catherine Tremblay and Véronique Laterreur, who developed a new method to produce auto-assembled molded valves and a new version of the bioreactor used by our group, respectively. During this master, the new bioreactor has been adapted to a sterile use with living tissues and the molded valves method has been modified and tested with the production of 4 prototypes, which didn't provide satisfying results during their bioreactor trials. A new fabrication method was thus developed. Recently, the tubular shape has been suggested as a simple and effective geometry for tissue engineered heart valves, allowing easy fabrication, fast implantation, and minimal crimped footprint from a transcatheter delivery perspective. This minimalistic design is also well-suited for the self-assembly method, which has already proven its potential for small diameter vascular grafts. A total of 11 tubular constructs were produced by rolling self-assembled human fibroblastic sheets on solid mandrels. After maturation, the tissues were transferred onto smaller diameter mandrels to allow their free contraction. The characterization of two control tubes revealed that while preventing further contraction in the bioreactor, this precontraction phase was also beneficial for the tissue properties. The final prototypes could withstand a physiological pulmonary flow. This new method shows that the self-assembly process could be used to achieve functional tubular heart valves.

Le gène RNF213 a été identifié comme un facteur de risque associé au développement de maladies cérébrovasculaires (MCV) notamment, la maladie de Moyamoya (MMM) et les anévrismes intracrâniens (AIC). Malgré une incompréhension des fonctions biologiques exactes, la ring finger protein 213 (RNF213) serait impliquée dans la régulation de la prolifération cellulaire, de l’angiogenèse et de l’inflammation. Les travaux présentés dans cette thèse se concentrent sur le développement de modèles vasculaires in vitro afin de mieux caractériser le rôle de RNF213 dans MCV. L’hypothèse est que l’invalidation de la protéine RNF213 dans des cellules endothéliales (CE) cerébrales pourrait recréer certains phénotypes associés au développement de la MMM et à la formation d’AIC. Des cellules endothéliales microvasculaires humaines de cerveau (hCMEC/D3) invalide en RNF213 (RNF213-/- ) ont été initialement générées par la méthode Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats et la protéine associée Cas9 (CRISPR-Cas9) double nickase. La première partie des travaux porte sur le rôle que jouerait RNF213 dans l’homéostasie de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et dans les étapes précoces de la pathogenèse associée à la MMM. Plus précisément, la perte des jonctions adhérentes provoquée par l’invalidation de RNF213 dans les hCMEC/D3 a été évaluée in vitro sur plusieurs paramètres, tels que la morphologie endothéliale, l’expression génique des protéines de jonctions, la localisation cellulaire, la perméabilité, l’infiltration immunitaire et le sécrétome des cytokines inflammatoires. Les résultats ont démontré que la déficience en RNF213 provoque une diminution de l’expression de la platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1) qui affecte conséquemment la formation adéquate du complexe jonctionnel. De plus, une diminution de l’expression des gènes de la claudine-5, de la b-caténine et de la plakoglobine a été mesurée. La perte de RNF213 est également accompagnée d’un relargage de plusieurs cytokines proinflammatoires. En deuxième lieu, les travaux de cette thèse ont également démontré que RNF213 joue un rôle prépondérant dans le processus angiogénique des hCMEC/D3. Ceci a été étudié sous plusieurs angles d’approches, tels que la prolifération et la migration cellulaire, la formation de micro-capillaires sur un support Matrigel® et dans un modèle tridimensionnel (3D) reconstruit par génie tissulaire, l’expression génique et le sécrétome angiogénique. Les résultats ont démontré une diminution du taux de division cellulaire et une augmentation de la migration. Les études in vitro ont démontré également, pour la première fois, une augmentation significative de la formation de micro-capillaires et de la sécrétion abondante de facteurs pro-angiogénique, tels que le vascular endothelial growth factor (VEGF). Plus précisément, les hCMEC/D3 déficientes en RNF213 forment un réseau plus vaste, dense et étendu de micro-capillaires sur un support de Matrigel®. iii Lorsqu’ensemencées dans un modèle 3D plus complexe structurellement, les hCMEC/D3 forment un réseau pouvant s’apparenter au réseau de capillaires compensatoire retrouvé chez les patients MMM. Dans l’ensemble, l’invalidation du gène RNF213 dans un modèle in vitro 3D de cellules endothéliales cérébrales permet de reproduire certains phénotypes pathologiques de la MMM et devient donc ainsi le 1er modèle in vitro pour l’étude de cette maladie et des autres maladies associées à RNF213. Finalement, nous avons mis au point un nouveau modèle de vaisseaux sanguins de petit calibre reconstruit par génie tissulaire (TEBV) pour son utilisation dans l’étude in vitro de maladies vasculaires et de MCV complexes. L’ensemencement de fibroblastes ou de cellules musculaires lisses (CML) directement sur un mandrin de polyéthylène téréphtalate glycol (PETG) prétraité aux rayons ultraviolets C (UV-C) a permis de former des feuillets circulaires, manipulables et superposables. Avec cette technique, nous avons généré des TEBV complets avec les trois principales couches, soit l’adventitia, la media et l’intima tunica, qui possèdent des propriétés histologiques et mécaniques similaires aux artères humaines natives. Ce modèle optimisé et uniformisé de TEBV permettra de modéliser des pathologies vasculaires complexes, telles que la MMM et les AIC. En effet, la génération de vaisseaux complets à partir de cellules pathologiques ou de cellules éditées génétiquement pourrait faciliter la caractérisation de la pathogenèse et aider au développement de médicaments. / RNF213 has been associated as a susceptibility gene for the development cerebrovascular diseases (CVDs), in particular, moyamoya disease (MMD) and intracranial aneurysms (ICA). While the exact biological functions of RNF213 remain to be demonstrated, it is known to be involved in the regulation of cell proliferation, angiogenesis and inflammation. The work presented in this thesis focuses on the development of vascular models in vitro to better characterize the role of RNF213 in CVDs. The hypothesis is that the complete invalidation of the RNF213 protein in brain endothelial cells (EC) could recreate evident phenotypes associated with the development of MMD and the formation of ICA. We have initially generated human brain microvascular endothelial cells (hCMEC/D3) deficient in RNF213 (RNF213-/- ) using the robust CRISPR-Cas9 double nickase method. At first, our work described the role that RNF213 would play in the homeostasis of the blood-brain barrier (BBB) maintenance and in the early stages of MMD pathogenesis. More specifically, the loss of adherent junctions caused by the invalidation of RNF213 in hCMEC/D3 was evaluated in vitro on several parameters, such as endothelial morphology, gene expression of junctional proteins, cellular localization, permeability, immune infiltration and the secretome of inflammatory cytokines. Our data demonstrated that RNF213 deficiency provokes a significant decrease in the platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1) expression, which consequently affects the proper formation of the junctional complex. A decrease in the expression of the claudin-5, b-catenin and plakoglobin genes was also measured. In addition, RNF213 loss is accompanied with a release of several pro-inflammatory cytokines. Thereafter, the present work also demonstrated that RNF213 plays a preponderant role in the angiogenic process of hCMEC/D3. Angiogenesis has also been characterized on several aspects, such as proliferation, migration, formation of micro-capillaries on a Matrigel®-based support and in a 3D model reconstructed by tissue engineering, gene expression and secretion of angiogenic factors. Our data demonstrates a decrease in cell division rate and an increase in cell migration. In vitro studies have also shown, for the first time, a significant increase in micro-capillary formation and abundant secretion of pro-angiogenic factors, such as the vascular endothelial growth factor (VEGF). More precisely, the hCMEC/D3 deficient in RNF213 forms a wider, denser and more extensive network of micro-capillaries on a Matrigel®-based support. When seeded in a more structurally complex 3D model, hCMEC/D3 form a network that can resemble to the compensatory capillary network found in MMM patients. Overall, the invalidation of the RNF213 gene in a 3D in vitro model of cerebral endothelial cells makes it possible to reproduce certain pathological phenotypes of MMM and v therefore becomes the 1st in vitro model for the study of this disease and other diseases associated with RNF213. Finally, we developed a new model of small-caliber blood vessels reconstructed by tissue engineering (TEBV) to be used to study vascular diseases and complex CVD in vitro. The direct seeding of fibroblasts or smooth muscle cells (CML) onto a polyethylene terephthalate glycol (PETG) mandrel that was pretreated with ultraviolet C (UV-C) radiation facilitate the formation of circular cell sheets, which could be manipulated and stacked in top of each other. Using this novel technique, we were able to successfully generate complete TEBVs with the three main arterial layers: the adventitia, the media and the intima tunica. Taken together, our TEBV model has histological and mechanical properties similar to native human arteries. Furthermore, this optimized and standardized 3D vascular construct will accelerate the scientific progress to modelized complex vascular pathologies, such as MMD and AIC. Indeed, the generation of complete vessels derived from pathological cells or genetically edited cells could facilitate the characterization of pathogenesis and help in the development of drugs.