Les petites protéines de choc thermique (sHsps : small heat shock proteins) sont présentes en nombre variable dans tous les organismes. Le génome de Drosophila melanogaster encode 12 sHsps, avec une expression au cours de développement, une localisation intracellulaire et une spécificité de substrats différents. DmHsp27 est l’une des rares sHsps à avoir une localisation nucléaire avant et après un choc thermique. Cette localisation nucléaire est inhabituelle, d’autant plus qu’aucune fonction spécifique de cette protéine n’a encore été identifiée. Les mécanismes responsables de la localisation nucléaire de DmHsp27 ainsi que sa probable fonction dans le noyau restent peu connus. L’étude des orthologues de DmHsp27 chez les insectes a permis de déterminer que la localisation nucléaire n’est pas spécifique à DmHsp27 et d’autres sHsps chez les insectes présentent le même signal de localisation nucléaire que DmHsp27. Le réseau d’interaction de DmHsp27 nous laisse croire que cette protéine ne joue pas seulement le rôle de chaperon moléculaire, mais qu’elle est probablement impliquée dans différents processus nucléaires. Au niveau structurel, contrairement aux sHsps chez les métazoaires, DmHsp27 forme deux populations d'oligomères non en équilibre. Des mutations indépendantes de trois arginines hautement conservées au niveau du domaine alpha-cristallin (R122, R131 et R135) à la glycine affectent l’oligomérisation par formation d’une seule population de grand poids moléculaire. In vitro, l'activité de chaperon de DmHsp27WT est comparable à celle de ses deux populations isolées et à celle des mutants R122G, R131G et R135G utilisant la luciférase comme substrat. Cependant, dans un essai de protection contre l’aggrégation de l’insuline, l'activité de chaperon de DmHsp27 est inférieure à celle des mutants R122G et R131G. Une stratégie de délétion et mutation a été utilsée pour étudier le rôle de la région N-terminale sur l’oligomérisation et la fonction chaperon de DmHsp27. Tel que déterminé par chromatographie d'exclusion et gel natif, des mutations au niveau de F29, G30 et G32 présentent des structures oligomériques différentes de celle du type sauvage. Aucun de ces mutants sauf l'élimination complète de la région N-terminale n’a montré une perte d'activité chaperon, suggérant un rôle important dans la reconnaissance et liaison de substrat. Étonnamment, les deux glycines (G30 et G32) conservées chez les orthologues de DmHsp27 agissent comme régulateurs négatifs de l'activité chaperon; leurs mutations améliorent grandement la prévention d’agrégation d’insuline. La différence du rendement de la protéine sauvage et des mutants G30R et G32R à prévenir l’agrégation de l’insuline à 20 °C et à 42 °C a permis d’établir un lien entre la structure et la fonction chaperon de DmHsp27 et de définir le mode d’action de DmHsp27 suite au stress thermique. En résumé, cette étude a permis de caractériser DmHsp27 et ses mutants au niveau du domaine alpha cristallin et de la région N-terminale et a donné un aperçu d’un nouveau mécanisme de protection contre l’agrégation des sHsps. Le rôle de chaperon moléculaire joué par DmHsp27 et son induction durant le développement embryonnaire laisse cependant présumer que cette protéine remplit d’autres fonctions cellulaires importantes. / Small heat shock proteins are present in varying numbers in all organisms. In Drosophila melanogaster there are 12 sHsps, which have distinctive developmental expression patterns, intracellular localizations and substrate specificities. DmHsp27 is one of the very few sHsps that have a nuclear localization before and after heat shock. This nuclear localization is unusual, especially since no specific function has yet been identified. The mechanisms responsible for the nuclear localization of DmHsp27 and its function in the nucleus remain poorly understood. First, the study of DmHsp27 orthologs helped to determine that nuclear localization is not specific to DmHsp27 and other sHsps in insects have the same nuclear localization signal as DmHsp27. The DmHsp27 interaction network leads to believe that this protein does not only play the role of chaperone, but it is also involved in various nuclear processes. Second, unlike metazoan sHsps, DmHsp27 forms two populations of oligomers not in equilibrium. Mutations of highly conserved arginine residues in the ACD domain in mammalian sHsps has been reported to be associated with protein conformational defects and intracellular aggregation. Independent mutation of three highly conserved arginines (R122, R131 and R135) to glycine in DmHsp27 results in only one population of higher molecular weight form. In vitro, the chaperone-like activity of wild type DmHsp27 was comparable with that of its two isolated populations and to the single population of the R122G, R131G and R135G using luciferase as substrate. However, using insulin, the chaperone-like activity of wild type DmHsp27 was lower than that of R122G and R131G mutants. Finaly, we established the importance of the N-terminal region for oligomerization and we investigated the heat activation under in vitro experimental conditions using size exclusion chromatography and gradient native gels electrophoresis. By deletion strategy, we have examined the role of the N-terminal region and delineated a motif (FGFG) important for the oligomeric structure and chaperone-like activity of this sHsp. Deletion of the full N-terminal domain, resulted in total loss of chaperon-like activity; intriguingly deletion of the (FGFG) at position 29 to 32 or single mutation of G30R and G32R enhanced oligomerization and chaperoning capacity under non heat shock conditions using the insulin assay suggesting the importance of this site for chaperone activity. Unlike mammalian sHsps heat activation of DmHsp27 leads to enhanced dissociation/association of oligomers to form large structures about 1000 kDa. We suggest a new mechanism of heat activation for DmHsp27. In summary, this study characterized DmHsp27 and mutant in the alpha crystallin domain and the N-terminal region and provided an overview of a new protection mechanism. The role played by DmHsp27 as molecular chaperone and its induction during embryonic development, suggest that this protein may perform other important cellular functions

Les petites protéines de stress/Small heat shock proteins (sHsps) sont des chaperons moléculaires ATP-indépendants ubiquitaires retrouvées chez les procaryotes et eucaryotes. Elles sont dynamiques structurellement et la majorité d’entre elles possèdent la capacité de former de gros complexes oligomériques. Également, elles protègent les cellules du stress protéotoxique causé par divers facteurs de stress abiotiques en prévenant l’agrégation des protéines dénaturées et en promouvant leur repliement par les chaperons moléculaires ATP dépendants tels que Hsp70/DnaK. Récemment, la présence de gènes de sHsp (HspSP-ShM2) chez des virus marins et plus précisément chez des cyanophages infectant le genre Synechococcus sp. et Prochlorococcus sp ont été caractérisés in silico. Au niveau de sa séquence, la sHsp de 18 kDa de Synechococcus sp. montre un domaine alpha crystallin de 92 acides aminés hautement conservé au sein des sHsps, une région C-terminale contenant le motif CAM canonique de type (L-X-I/L/V) et une région N-terminale relativement courte. Nous avons établi grâce à la chromatographie par exclusion stérique (SEC) et le système de Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) sa capacité à former des complexes oligomériques de haut poids moléculaires (600 kDa et 200kDa). De plus, nous avons démontré qu’elle prévient l’agrégation de la citrate synthase, la malate dehydrogenase et la luciférase en condition de stress thermique suggérant qu’elle possède une faible spécificité et un large spectre de protéines clientes/substrats. La prévention complète de l’agrégation a été obtenue à différents ratios (sHsp:substrat) selon le substrat, ce qui indique qu’il y aurait possiblement des interactions différentes et uniques avec chacun d’eux. Nous avons ensuite mis en évidence la formation d’hétéro-oligomères stables et solubles entre HspSP-ShM2 et son substrat dans les mêmes conditions, ce qui est en accord avec les caractéristiques des sHsps en général. Quant à elle, la sHsp de la cyanobactérie Synechococcus WH7803 (HspS-WH7803) possède un poids moléculaire de 15 kDa et montre une capacité à former des tétramères (60 kDa) sur essai de SEC par FPLC en présence de Triton™X-100 pour le maintien de sa solubilité. Contrairement à HspS-ShM2, HspS-WH7803 ne démontre aucune activité protectrice sur l’agrégation des substrats mentionnés précédement à différents ratios molaires. Finalement, des analyses par SEC/FPLC suggèrent la formation de complexes hétéro-oligomériques entre HspSP-ShM2 et celle de son hôte, HspS-WH7803 de Synechococcus WH7803. Cette interaction entre les sHsps pourrait soit optimiser ou inhiber l’activité de chaperon moléculaire et la réponse au stress de son hôte dans le but de favoriser le cycle viral. / Small heat shock proteins (sHsps) are ubiquitous ATP-independent molecular chaperones found in prokaryotes and eukaryotes. They are structurally dynamic and most of them have the ability to form large oligomeric complexes and to protect cells from proteotoxic stresses by preventing aggregation of non-native proteins and promoting their refolding via ATP-dependent chaperones such as Hsp70/DnaK. Recently, the presence of a sHsp gene (HspSP-ShM2) in marine viruses has been reported using bioinformatics tools. More precisely, the gene has been found in cyanophages infecting cyanobacteria of the genre Synechococcus sp. and Prochlorococcus sp. The Synechococcus phage sHSP has a MW of 18 kDa and shows the highly conserved core alpha crystalline domain of 92 amino acids and relatively short N- and C-terminal arms, the later containing the classical CAM domain (L-X-I/L/V). We established its oligomeric profile using a size exclusion chromatography (SEC) and Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system and demonstrated its ability to form large oligomeric complexes in native conditions (600 kDa and 200kDa). Furthermore, we report its capacity to prevent the aggregation of citrate synthase, malate dehydrogenase and luciferase suggesting that it has a weak specificity and wide range of protein substrates. The complete prevention of aggregation was achieved at different ratios (sHsp:substrate) depending on the substrate indicating that the sHSP may have different and unique interactions with each of its clients. We also showed the formation of a stable and soluble hetero-oligomeric complex of the phage sHSP and its substrates under heat stress, which is in accordance with the characteristics of sHSP in general. The cyanobacteria Synechococcus WH7803 15 kDa sHSP (HspS-WH7803) shows the ability to form tetramers in the presence of Triton™X-100 for the maintenance of its solubility using the SEC/FPLC method. For its capability to prevent the aggregation of different substrates, HspS-WH7803 demonstrates no chaperon like activity in all the assays and molar ratios used. Finally, SEC/FPLC results indicate the possible formation of a hetero-oligomeric complex between the sHSP of the phage and the one from its host Synechococcus WH7803 (HspS-WH7803). This interaction could either optimize the chaperone activity and the stress response of its host or inhibit the host sHSP to facilitate the viral life cycle.

La petite protéine de choc thermique Hsp27 chez Drosophila melanogaster est localisée au noyau. Dans le but d'identifier la séquence peptidique responsable de cette localisation, la mutagenèse dirigée d'un signal potentiel de localisation nucléaire bipartite situé entre les acides aminés 42 et 59 a été effectuée, et les vecteurs obtenus ont été transfectés dans des cellules de mammifères HeLa. Il s'est avéré que la mutation des arginines 54, 55 et 56 de la protéine occasionne une diminution importante de la localisation nucléaire, bien qu'on observe toujours des résidus nucléaires localisés au niveau de structures granulaires. La localisation au niveau de structures granulaires est également observée avec la protéine sauvage. Des analyses avec des marqueurs de corps nucléaires ont donc été effectuées afin de déterminer si ces granules contenant Hsp27 correspondaient à des corps nucléaires connus. Il a été observé que la protéine colocalise avec le facteur d'épissage SC35 au niveau des "speckles" nucléaires. Ces observations s'avéreront utiles dans l'identification de fonctions pour la protéine Hsp27.

Les protéines de choc thermique (HSP) jouent un rôle crucial dans le maintien de l’intégrité du protéome et le contrôle de qualité des protéines. BCL-2-associated athanogene 3 (BAG3) est un co-chaperon moléculaire particulier qui peut s’associer avec différents systèmes d’HSPs : les chaperons HSPA (HSC/HSP70) et HSPB, en particulier HSPB8. Bien que l’implication des HSPA dans les fonctions de BAG3 associées au contrôle de qualité soit caractérisée, le rôle d’HSPB8 demeure incompris. Ainsi l’objectif de cette thèse est de préciser l’implication d’HSPB8 dans le contexte du stress protéotoxique engendré par l’inhibition du protéasome qui conduit à la séquestration des protéines polyubiquitinées à l’agrésome et à leur dégradation par autophagie. Nous avons mis en évidence un rôle précoce d’HSPB8 dans la séquestration des protéines ubiquitinées, qui ne semble pas requérir sa liaison à BAG3 mais qui potentialiserait la formation de l’agrésome. Nos résultats suggèrent qu’HSPB8 favorise des modifications post-traductionnelles sur p62/SQSTM1, dont la phosphorylation sur la sérine 349, et son couplage au co-chaperon BAG3. Cela faciliterait la formation de micro-agrégats cytoplasmiques et de l’agrésome ainsi que l’activation de la voie de signalisation protectrice Nrf2 suite à la séquestration de la protéine adaptatrice Keap1. De plus, nous avons mis en évidence une déstabilisation des interactions entre BAG3, HSPB8 et p62/SQSTM1 avec le mutant BAG3 (P209L) dont la mutation est localisée sur un des motifs de liaison à HSPB8. L’expression de ce mutant s’accompagne d’une diminution de l’activation de la voie Nrf2 en réponse au stress qui pourrait contribuer au mécanisme pathologique dans les myopathies associées à cette mutation. Enfin, une analyse dynamique de la disparition de l’agrésome suggère que son élimination requiert une étape de désagrégation qui serait suivie par sa dégradation par voie autophagique. Nous avons montré un rôle de BAG3 dans la disparition de cette structure suggérant que le co-chaperon agit via sa fonction dans l’autophagie. En revanche, HSPB8 ne semble pas participer pas à cette activité de dégradation de l’agrésome, et pourrait au contraire l’inhiber. Ainsi, cette étude met en évidence un nouveau rôle d’HSPB8 dans la séquestration précoce de protéines dénaturées, grâce à laquelle HSPB8 pourrait participer à la formation d’une plateforme facilitant la signalisation aux voies de stress. HSPB8 coopère avec BAG3 au ciblage des protéines dénaturées à l’agrésome, en vue de leur dégradation par autophagie, en favorisant notamment le couplage de BAG3 à un de ses partenaires clé, l’adaptateur autophagique p62/SQSTM1. De plus, le complexe HSPB8-BAG3 prend part à l’activation de voies de signalisation protectrice en réponse au stress ce qui pourrait avoir des implications dans les maladies musculaires associées aux mutations de BAG3 ainsi que dans le contexte du cancer. / Heat shock protein (HSP) play crucial role in the maintenance of the proteome integrity and in protein quality control. BCL-2-associated athanogene 3 (BAG3) is a unique co-chaperone that interacts with different systems of chaperones, including the HSPA (HSC/HSP70) and HSPB families, in particular HSPB8. While the role of HSPA chaperones in BAG3-related functions in protein quality control has been well characterized, the exact contribution of HSPB8 remains incompletely understood. The objective of this thesis is to characterize HSPB8 function in BAG3-related activities in the context of cellular stress in response to proteasome inhibition, which lead to the sequestration of polyubiquitinated protein in a quality control deposit through the aggresome-autophagy pathway and in which BAG3 has previously been involved. Here we have discovered an early function of HSPB8 in response to stress that contributes to the controlled aggregation of polyubiquitinated proteins in a BAG3-independent manner, but that would facilitate efficient targeting of polyubiquitinated protein aggregates to the aggresome, which is BAG3-dependent. Our results suggest that HSPB8 functions in part, by modulating p62/SQSTM1 molecular assemblies and facilitating their coupling to BAG3. This, in turn, would promote microaggregate and aggresome formation and signaling to an important arm of the oxidative defense regulated by Nrf2. Besides, a BAG3 (P209L) mutant, located within an HSPB8-binding motif, appears to disturb the association between BAG3 and p62/SQSTM1, leading to down-modulation of stress-induced Nrf2 activation, a process that could contribute to the development of severe myofibrillar myopathies. Moreover, analyses of the dynamic of aggresome clearance during the recovery period suggest that it involves a first step of disaggregation followed by its catabolic degradation. We found that while BAG3 would contribute to aggresome clearance by a mechanism involving its autophagic function, HSPB8 appeared not to be involved and could rather slow down the process. In conclusion, this thesis highlight a novel role for HSPB8 in the spatial sequestration of harmful proteins, which could provide a platform to cross talk with stress signaling pathways. HSPB8 would uniquely cooperate with BAG3 in the targeting of microaggregates to the aggresome-autophagy pathway, in part, by favoring the coupling of BAG3 to the stress sensor p62/SQSTM1. Furthermore, this work has uncovered a novel role for the HSPB8-BAG3 chaperone complex in mounting of an efficient stress response, which may have implications in BAG3-related diseases, including myofibrillar myopathy and cancer.

Les petites protéines de choc thermique (sHsps) ont été découvertes initialement chez Drosophila. Les membres de cette famille sont des chaperons moléculaires sont présentsdans la plupart des organismes eucaryotes et procaryotes et certains virus. En plus d’être induites en réponse à la plupart des stresseurs dont un choc thermique, elles sont également exprimés en absence de stress. Les sHsps forment des structures dynamiques s'assemblant en oligomères et elles sont essentielles durant les conditions de stress en empêchant l'agrégation des protéines dénaturées et en favorisant leur repliement par des chaperons moléculaires dépendants de l'ATP. Le génome de Drosophila melanogastercode pour 12 sHsp, qui ont des profils d'expression développementaux, des localisations intracellulaires diverses et des spécificités de substrats distincts. DmHsp22 est jusqu'à présent la seule sHsp localisée dans les mitochondries avant et après un choc thermique. Elle est préférentiellement régulée lors du vieillissement et en réponse à la chaleur et aux stress oxydants. La surexpression de DmHsp22 augmente la durée de vie et la résistance au stress et sa régulation négative est préjudiciable. C'est un chaperon efficace, qui pourrait être impliqué dans la réponse mitochondriale au dépliement protéique (UPRMT). Cependant, le mécanisme exact de son action est mal compris. Structurellement, DmHsp22 forme une population d'oligomères semblable aux nombreux sHsps de métazoaires et différente deDmHsp27. L'alignement des séquences de la région ACDde DmHsp22 avec des sHsp de drosophile et d'autres organismes a démontré la présence de trois résidus d'arginine hautement conservés dans ce domaine. Une forte conservationde ces résidus suggère leur implication possible dans la structure et la fonction de DmHsp22. La substitution des résidus d'arginine hautement conservés dans les sHsps de mammifères est associée à certaines pathogenèses et déclenche des changements de conformation des protéines ainsi que l'agrégation des protéines intracellulaires. La mutation de l'arginine en glycine au niveau de trois résidus hautement conservés d'ACD dans DmHsp22 (R105, R109, R110) résulte en une population oligomérique qui, dans le cas de R110G, perturbe la structure et provoque la formation de petits oligomères. Bien que DmHsp22 ainsi que les mutants aient été caractérisés comme des chaperons efficaces in vitro, les mécanismes d'action exacts dans les mitochondries et l'information sur le comportement protecteur nécessitent la détermination du réseau d’interaction in vivo. Nous avons utilisé la technique capture d’immunoaffinité (CIA) pour récupérer 60 protéines qui interagissent spécifiquement avec DmHsp22 in vivo pendant le traitement normal et thermique, dans le surnageant des cellules de mammifères exprimant la DmHsp22. L’CIA effectuée sur la fraction mitochondriale a permis d’identifies 39 protéines qui interagissent spécifiquement avec DmHsp22. La combinaison de l’IAC avec l'analyse par spectroscopie de masse de mitochondries de cellules HeLa transfectées avec DmHsp22 a conduit à l'identification de partenaires de liaison à DmHsp22 dans des conditions de normales et de choc thermique. L'interaction entre DmHsp22 et deux autres chaperons mitochondriaux a été validée par immunobuvardage. Notre approche a montré que les cellules HeLa exprimant DmHsp22 augmentent la consommation d'oxygène mitochondrial et les teneurs en ATP, ce qui confère un nouveau rôle à DmHsp22 dans les mitochondries. En outre, l'activité d’une luciférase exogène a légèrement augmenté dans les cellules HeLa exprimant DmHsp22 après que l'activité enzymatique ait été réduite à la suite de l'exposition à la chaleur. En résumé, ce projet a permis de caractériser la structure oligomérique de DmHsp22 et un certain nombre de mutants dans le domaine alpha cristallin tout en fournissant un rôle potentiel mécanistique dans l’homéostase mitochondriale. La détermination du réseau mitochondrial de DmHsp22 suggère son importance dans cette organelle non seulement en tant que chaperon moléculaire, mais aussi en tant que protéine impliquée dans plusieurs fonctions cellulaires significatives. / The small heat shock proteins (sHsps) were first discovered in Drosophila. Members of this family are molecular chaperones and are present in most eukaryotic and prokaryotic. Although, they are induced in response to most of the stressors including heat shock, they are also expressed in absence of stress. SHsps for mdynamic structures that assemble into oligomers which are essential during stress conditions by preventing aggregation of denatured proteins and promoting their folding by ATP dependent molecular chaperones. Drosophila melanogaster genome encodes 12 sHsps, that have developmental expression patterns, diverse intracellular localizations and distinct substrate specificities. DmHsp22 is up to now the only sHsp localized in mitochondria before and after heat shock. It is preferentially regulated during ageing and in response to heat and oxidative stresses. Over-expression of DmHsp22 increases lifespan and resistance to stress and its down-regulation is detrimental. It is an efficient chaperone and could be involved in the mitochondrial unfolding protein response (UPRMT). However, the exact mechanism of its action is poorly understood. Structurally, DmHsp22 forms one population of oligomers similar to the many metazoan sHsps but DmHsp27. Sequence alignment of DmHsp22 with sHsps in Drosophilaand other organisms at the alpha crystalline domain (ACD) region demonstrated the presence of three highly conserved arginine residues in this domain. Strong conservation of these residues suggest their possible involvement in structure and function of DmHsp22. Substitution of highly conserved arginine residues in mammalian sHsps is associated with some pathogenesis and triggers protein conformational changes as well as intracellular protein aggregation. Mutation of arginine to glycine at three highly conserved residues of ACD in DmHsp22 (R105, R109, R110) results in one oligomeric population as well which in the case of R110G disrupts the structure and causes formation of smaller oligomers. Although DmHsp22 as well as mutants have been characterized as effective in vitro chaperones, the exact mechanism(s) of action in mitochondria and information about protective behavior requires defining of in vivoprotein interacting network. We have used immunoaffinity conjugation (IAC) technique to recover 60 proteins that specifically interact with DmHsp22 in vivo during normal and heat treatment using cell extract of mammalian cells expressing DmHsp22. The IAC performed on mitochondrial fraction identified 39 proteins that specifically interact with DmHsp22. Combination of IAC with mass spectroscopy analysis of mitochondria of HeLa cells transfected with DmHsp22 resulted in identification of DmHsp22-binding partners under normal andunder heat shock conditions. Interaction between DmHsp22 and two other mitochondrial chaperones was validated by immunoblotting. Our approach showed that HeLa cells expressing DmHsp22 increase maximal mitochondrial oxygen consumption and ATP contents which provides a new mechanistic role for DmHsp22 in mitochondria. Further more, exogenous luciferase activity slightly increased in HeLa cells expressing DmHsp22 after the enzyme activity reduced as a result of exposure to heat. In summary, this project has characterized the oligomeric structure of DmHsp22 and a number of mutants inthe alpha crystalline domain while providing a potential mechanistic role in mitochondrial homeostasis. Determining mitochondrial network of DmHsp22 suggest its importance in this organelle not only as a molecular chaperone but also as a protein involved in several significant cellular functions.

"Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l'Université Laval comme exigence partielle du programme de maîtrise en Médecine Expérimentale offert à l'Université du Québec à Chicoutimi en vertu d'un protocole d'entente avec l'Université Laval pour l'obtention du grade de Maître ès sciences (M.Sc.)" / Huntingtin interacting protein-1 (HIP1) et Huntingtin interacting protein-1-related (HIP1R) ont été identifiées comme des protéines intervenant dans l’endocytose médiée par les vésicules de clathrine par leurs interactions avec d ’autres protéines endocytaires. Pour mieux comprendre les rôles attribués à HIP1/R dans cette machinerie, nous avons procédé à l’identification de nouveaux partenaires d ’interaction. Au cours de notre étude, nous avons identifié HSC70 (Heat-shock Cognate Protein70) comme un nouveau partenaire pour les domaines TALIN des deux protéines par des essais de pull-down et analyse par spectrométrie de masse. Au cours de cette étude nous avons identifié également que l’association d ’HSC70 avec le domaine TALIN d ’HIPIR, compromet sa sédimentation avec les filaments d ’actine. HIP1R est une composante du manteau de clathrine, son interaction avec HSC70 l’a impliquée dans le démantèlement des vésicules. Dans cette étude, nous avons vérifié l’intervention d ’HIPIR dans le démantèlement de la clathrine suite à son interaction avec HSC70 et la relation de ce mécanisme avec la perte d ’interaction avec l’actine.

HSPB8 appartient à la famille des petites protéines de choc thermique (sHSP ou HSPB) qui contient 10 membres HSPB 1-10. In vitro, HspB8 favorise la dégradation de l'Huntingtine mutée (Htt43Q), une protéine encline à agréger. HspB8 est un chaperon moléculaire capable de reconnaître des substrats protéiques mal repliés pour permettre leur repliement ou leur dégradation. HspB8 forme un complexe stable et stoechiométrique avec Bag3 (2 : 1), un cochaperon de Hsp70. Surexprimées, Bag3 et/ou HspB8 induisent la conversion de LC3-I en LC3-II indiquant que la macroautophagie est stimulée et bloquent l'agrégation de Htt43Q. Nous avons cherché dans cette étude, à déterminer si la formation du complexe HspB8-Bag3 est essentielle dans l'accomplissement de ce phénomène. Bag3 possède un domaine WW peu caractérisé, un domaine riche en proline capable d'interagir avec PLCy l , et un domaine BAG interagissant avec Hsp70 et Bcl-2. Le co-chaperon Bag3 étant modulaire, nous avons recherché quels domaines d'interaction fonctionnels lui sont essentiels. Afin de localiser le site de liaison à HspB8, nous avons réalisé des délétions systématiques des différentes régions de Bag3. L'interaction des différents délétants de 6His-Bag3 avec HspB8 a été analysée par co-puri fi cation au Nickel. Leur capacité à bloquer l'accumulation de Htt43Q dans les fractions solubles et insolubles au SDS et à augmenter le ratio LC3-II/I, marqueur de l'autophagie, a été évaluée. Nous avons déterminé que le site de liaison à HspB8 était constitué de deux motifs répétés de 14 acides aminés très conservés (B8bdl et B8bd2) depuis le poisson jusqu'à l'Homme. Dans les HEK-293T, en l'absence d'interaction avec HspB8, Bag3 est toujours capable de stimuler la macroautophagie et la dégradation de Htt43Q, bien qu'aucune activité de chaperon moléculaire ne lui soit associée in vitro. L'analyse des autres délétants suggère que l'extrémité N-terminale ainsi que la région riche en proline seraient essentielles pour l'activité de Bag3 envers Htt43Q, bien qu'elles ne le seraient pas pour stimuler la macroautophagie. Le domaine C-terminal de Bag3 serait responsable de la stimulation de la macroautophagie et sa délétion bloquerait aussi la dégradation de Htt43Q. La protéine Bag3, en permettant la dégradation des protéines mal conformées (comme Htt43Q) par macroautophagie, jouerait un rôle prépondérant dans le contrôle de la qualité des protéines.

L'une des premières réponses observées lorsque des cellules sont soumises à un stress est la diminution de la traduction suite à la destruction des polyribosomes. Les ARNm, qui auparavant étaient traduits, ne sont pas détruits durant ce processus. Il est donc possible d'observer l'accumulation d'une réserve d'ARNm et de mRNP réprimées sous forme de granules de stress intimement liées à la matrice cellulaire résiduelle. La présence de plusieurs protéines impliquées dans la stabilisation et la destruction des ARNm et des protéines soulève l'hypothèse que ces granules de stress servent aussi de site de triage afin de ne conserver que les RNP résistantes au stress. Ces granules cytoplasmiques étant peu connus, nous avons cherché à mieux connaître les RNP impliquées dans ce phénomène. Nos tentatives d'isoler les granules de stress n'ayant pas réussi, vu leur forte association avec la matrice cellulaire résiduelle, nous avons concentré nos efforts sur la comparaison des profils protéiques de la matrice cellulaire résiduelle avant et après un choc thermique. Cette approche nous a permis d'observer une augmentation de la concentration de plusieurs protéines de la matrice cellulaire, protéines qui pourraient être identifiées dans le futur.

La division cellulaire constitue le principe fondamental de la vie et repose sur des changements architecturaux cellulaires spectaculaires. Plusieurs de ces changements sont dirigés par le remodelage précis de structures mécano-sensibles à base d'actine. De plus en plus d'évidences suggèrent une relation étroite entre le contrôle de qualité des protéines et la régulation spatiotemporelle de la dynamique des structures d'actine entre autres, par l'intermédiaire de mécanismes de séquestration ou de dégradation des protéines. Les petites protéines de choc thermique (HSPB) sont des chaperons moléculaires qui font partie intégrante du réseau de contrôle de qualité des protéines, lesquelles contribuent à l'homéostasie du protéome. Ces chaperons émergent comme des modulateurs des structures à base d'actine en conditions physiologiques et comme des protecteurs de l'intégrité de ces structures en conditions de stress. Selon le modèle prévalent, l'assemblage des HSPB en structures oligomériques dynamiques leur confère leur fonction dans la séquestration de composantes cellulaires pour prévenir une agrégation protéique non-spécifique. Néanmoins, leur mode d'action demeure encore élusif : le fait que certaines HSPB ne formeraient pas d'oligomères suggère un autre mécanisme d'action pour ces HSPB. C'est le cas de HSPB8, qui forme un complexe avec le co-chaperon moléculaire BAG3. Les prémices des travaux de cette thèse ont été la découverte d'un nouveau rôle pour ce complexe au cours de la mitose : BAG3, d'une manière dépendante de son association avec HSPB8, facilite le remodelage drastique du cytosquelette d'actine requis pour le positionnement du fuseau mitotique et la ségrégation adéquate des chromosomes. L'objectif de cette thèse était d'identifier le mode de régulation de la fonction mitotique de BAG3-HSPB8 et de disséquer les mécanismes moléculaires impliqués qui facilitent le remodelage du cytosquelette d'actine mitotique. Les travaux de cette thèse apportent des évidences que la modulation des fonctions mitotiques de BAG3 est dépendante de sa phosphorylation par la kinase mitotique CDK1 sur des résidus spécifiques ; Thr285 et Ser386. Ces phosphorylations lui confèrent une activité différentielle sur l'arrondissement cellulaire versus le positionnement du fuseau mitotique. De plus, BAG3 serait phosphorylée dès la phase G2/M sur le résidu Ser195, ce qui modulerait son enrichissement en périphérie du noyau à la transition G2/M. Nos résultats suggèrent que ces phosphorylations seraient impliquées dans la modulation d'associations protéiques différentielles, selon les phases du cycle cellulaire. En outre, l'entrée des cellules en mitose est marquée par l'association de BAG3 avec des protéines du cytosquelette d'actine, telle que cortactine, ainsi qu'avec des acteurs du contrôle de qualité des protéines, notamment le récepteur autophagique p62/SQSTM1 et la déacétylase HDAC6. De manière cruciale, la phosphorylation et les associations protéiques mitotiques de BAG3 sont dépendantes de sa liaison à HSPB8. Nos résultats suggèrent un model selon lequel le complexe BAG3-HSPB8 régule l'assemblage de p62/SQSTM1 en corps supramoléculaires qui pourraient offrir une plateforme pour isoler et réguler l'assemblage de complexes protéiques impliqués dans le remodelage des structures d'actine mitotiques. Via ce mécanisme d'action, BAG3-HSPB8 limiterait la polymérisation de l'actine branchée dépendante d'Arp2/3, en modulant négativement l'activité déacétylase de HDAC6 sur son substrat cortactine, un processus qui faciliterait l'arrondissement mitotique. Ainsi, nos résultats mettent en avant un rôle central pour la phosphorylation de BAG3 dans la modulation de son action mitotique, en étroite collaboration avec ses partenaires HSPB8 et p62/SQSTM1. L'ensemble de nos données contribue ainsi à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels le complexe chaperon BAG3-HSPB8 orchestre le remodelage dynamique des structures cellulaires mitotiques à base d'actine et facilite les changements de forme des cellules requis pour la progression mitotique. Ces travaux ont également permis l'identification de nouvelles cibles moléculaires du complexe chaperon, entre autres impliquées dans la dynamique du cytosquelette d'actine. Ces travaux offrent de nouvelles pistes d'investigations intéressantes concernant le développement de pathologies associées à une dérégulation du complexe BAG3-HSPB8, notamment dans la progression tumorale. / Cell division is the fundamental principle of life and is based on spectacular cellular architectural changes. Many of them are driven by the accurate remodeling of mechanosensitive actin-based structures. Growing evidence suggests a close relationship between protein quality control and the spatiotemporal regulation of actin remodeling, through mechanisms that would promote protein sequestration and/or degradation. Small heat shock proteins (HSPBs) are molecular chaperones that are an integral part of the protein quality control network, which contribute to maintain proteome homeostasis. They emerge as modulators of actin-based structures under physiological conditions and as guardians of the integrity of cytoskeletal structures under stress conditions. According to the prevailing model, the assembly of HSPBs into large oligomers confers them with the ability to sequester cellular components and prevent unspecific aggregation of damaged proteins. Nevertheless, their mode of action remains elusive: the observation that some HSPBs do not form oligomers suggests another mechanism of action for these HSPBs. This is the case for HSPB8, which forms a complex with the molecular co-chaperone BAG3. The working model of this thesis is based on the initial discovery in our laboratory of a new role for this complex during cell division: BAG3 facilitates the drastic remodeling of the actin cytoskeleton required for spindle positioning and proper segregation of chromosomes, in a manner that requires HSPB8. The aim of this thesis was to identify the mechanisms whereby such a function of the BAG3-HSPB8 chaperone complex is regulated, and to investigate how the complex can facilitate mitotic actin cytoskeleton remodeling. The work presented here provides evidence that the modulation of BAG3 mitotic functions depends on its phosphorylation by the mitotic kinase CDK1 at specific residues, Thr285 and Ser386, which confers differential activity on cell rounding versus mitotic spindle positioning. Evidence also suggests that BAG3 would be phosphorylated earlier in the G2/M phase, at Ser195, which would modulate its perinuclear enrichment. Our results suggest that these phosphorylations could be involved in defining specific protein associations, in a cell-cycle dependent manner. In addition, we found that mitotic entry is marked by the stimulation of BAG3'sassociation with proteins that organize the actin cytoskeleton, such as cortactin, as well as with protein quality control actors, notable, the autophagic receptor p62/SQSTM1 and the deacetylase HDAC6. Critically, BAG3 phosphorylation and its associations with mitotic protein partners rely on its binding to HSPB8. The results suggests a model whereby the BAG3-HSPB8 complex would regulate the molecular assembly of p62/SQSTM1 into mitotic bodies that could provide a platform to sequester and facilitate protein complex assembly implicated in mitotic actin cytoskeleton remodeling. Via this mechanism, BAG3-HSPB8 could limit branched actin polymerization that depends on Arp2/3 activity, by down-modulating HDAC6 deacetylase activity towards its substrate cortactin, a process that would facilitate mitotic cell rounding. Thus, our results highlight a central role of BAG3 phosphorylation in the modulation of its mitotic action, in close relationship with its partners HSPB8 and p62. Altogether, our data contribute to a better understanding of the molecular mechanisms by which the BAG3-HSPB8 chaperone complex orchestrates the dynamic remodeling of mitotic cell structures and thereby, facilitates the cell shape changes required for mitotic progression. This study has also identified new molecular targets of the chaperone complex there are, among others, involved in the dynamics of the actin cytoskeleton. Thus, this work offers new avenues of investigation regarding the development of pathologies associated with a deregulation of the BAG3-HSPB8 complex, particularly in tumor progression.

Le vieillissement est un processus complexe accompagné par une capacité diminuée des cellules à tolérer et répondre aux formes différentes de stress causant des dommages comme l'agrégation de protéine dans les différentes composantes de la cellule. Les chaperons sont des joueurs probablement importants dans le processus de vieillissement en prévenant la dénaturation et l'agrégation des protéines. Chez Drosophila melanogaster, une petite protéine de choc thermique, Hsp22, localisée dans la matrice mitochondriale montre une expression elevée pendant le vieillissement. Sa surexpression chez la mouche augmente la durée moyenne de vie ainsi que la résistance au stress. Bien que Hsp22 montre une activité de chaperon dans des essais in vitro, les mécanismes par lesquels Hsp22 permet d’accroitre la durée de vie in vivo sont toujours inconnus. Une analyse transcriptionelle de tout le génome par microarrays et une analyse comparative du protéome mitochondrial par MALDI-TOF a été entreprise pour dévoiler les différences d’expression entre les mouches surexprimant Hsp22 et les contrôles appropriés. La surexpression générale de Hsp22 en utilisant le système GAL4/UAS dans Drosophila résulte en une augmentation de ~ 30% dans la durée de vie moyenne. L'analyse du transcriptome suggère que Hsp22 joue un rôle dans la détermination de durée de vie en changeant le processus général de vieillissement normal. Effectivement, les mouches surexprimant Hsp22 affichent une surexpression de gènes dont l’expression baisse normalement durant le vieillissement. Les gènes sont impliqués dans la production d'énergie, la biosynthèse des protéines, le taux de renouvellement des protéines et le métabolisme lipidique. L'analyse du protéome mitochondrial soutient aussi un rôle de Hsp22 sur la détermination de la durée de vie en maintenant la fonction mitochondriale et en favorisant la protéolyse. Les présentes données suggèrent l'importance de la maintenance de l’homéostasie protéique durant le vieillissement et discutent des mécanismes potentiels d’extension de la longévitié chez les mouches surexprimant Hsp22. / Aging is a complex process accompanied by a decreased capacity of cells to tolerate and respond to various forms of stresses leading to damages such as protein aggregation in various components of the cell. Chaperones are thus likely important players in the aging process by preventing protein denaturation and aggregation. In Drosophila melanogaster, a small heat shock protein Hsp22 localized in the mitochondrial matrix is preferentially up-regulated during aging. Its over-expression results in an extension of lifespan and an increased resistance to stress. Although Hsp22 has been shown to have a chaperone-like activity in vitro, the mechanisms by which it extends lifespan in vivo are still unknown. Genome-wide transcriptional analysis by microarray and comparative mitochondrial proteomic analysis by MALDI-TOF mass analysis have been performed to unveil differences in long-lived Hsp22 over-expressing flies and normal-lived control flies. Ubiquitous over-expression of Hsp22 using the GAL4/UAS system in Drosophila resulted in a ~ 30% increase in mean lifespan. The genomic analysis suggests that Hsp22 plays a role in lifespan determination by altering the regulation of the overall process of normal aging. Indeed, flies over-expressing Hsp22 display an up-regulation of genes normally down-regulated with age and involved in energy production, protein biosynthesis, protein turnover, and lipid metabolism. Mitochondrial proteomic analysis also supports a putative role of Hsp22 on lifespan determination by maintaining mitochondrial function and favoring proteolysis. The present data suggest the importance of the maintenance of protein homeostasis in aging and potential mechanisms of longevity in the Hsp22 over-expressing flies.