La myélofibrose (MF) est la plus agressive des néoplasies myéloprolifératives (NMP). Elle porte à elle seule le plus mauvais pronostic pour les patients puisqu’elle s’accompagne d’une fibrose de la moelle osseuse évoluant vers une insuffisance médullaire. Les inhibiteurs de la kinase JAK2 ont apporté de nouveaux espoirs pour le traitement des NPM mais leurs effets ont été essentiellement bénéfiques sur les symptômes et non sur la fibrose elle-même ni sur le cours de la maladie. Plus récemment, la protéine de choc thermique 90 (HSP90) - connue pour stabiliser JAK2 - est apparue comme une cible thérapeutique prometteuse pour les NMP. Cependant, les inhibiteurs de la HSP90 ont montré une toxicité importante accompagnée d’une expression compensatoire des HSPs inductibles (i.e HSP70, HSP27), connues pour favoriser l’émergence de phénomène de résistance. Par ailleurs, des études ont montré que HSP27 était fortement exprimée chez les patients présentant une fibrose pulmonaire idiopathique ou rénale montrant l’importance de HSP27 dans les processus fibrotiques. Sur la base de l’ensemble de ces données, nous avons évalué d’une part l'efficacité chez l’animal d'un oligonucléotide inhibiteur spécifique de HSP27 appelé OGX-427 (en essai clinique dans plusieurs cancers). D’autre part, nous avons déterminé le niveau d’expression intra- et extracellulaire de HSP27 chez des patients atteints de MF. L'effet de l'OGX-427 a été évalué dans deux modèles murins de myélofibrose, laquelle est induite soit par la sécrétion excessive de thrombopoïétine (TPOhigh) soit par la mutation JAKV617F. Nous avons mis en évidence dans les souris traitées par l’OGX-427, une réduction de la taille de la rate, de la prolifération mégacaryocytaire et de l’hématopoïèse extramédullaire par rapport aux souris contrôles, révélant ainsi un effet bénéfique de l’inhibition de HSP27 sur la progression de la maladie. De toutes récentes observations complémentaires à ce travail ont également montré une diminution de la fibrose réticulinique dans la moelle osseuse de souris JAKV617F. Au niveau moléculaire, nous démontrons que l'effet prolifératif induit par la voie de signalisation exacerbée - JAK2/STAT5 - est régulé par HSP27 via des interactions directes. Pour finir, nous avons détecté une augmentation de l'expression de HSP27 aussi bien dans les progéniteurs circulants CD34+ que dans le sérum des patients atteints de NMP avec MF. Ce travail révèle pour la première fois le rôle intra et extracellulaire de HSP27 dans la physiopathologie de la MF et le bénéfice thérapeutique potentiel de l’utilisation des inhibiteurs de HSP27 dans cette maladie. / Myelofibrosis (MF) is the most aggressive myeloproliferative neoplasms (MPN) with the highest degree of morbidity and mortality, including progressive bone marrow fibrosis resulting into bone marrow failure. JAK2 kinase inhibitors have been successfully used for a few years in MPN and more particularly for MF treatment. Nevertheless, their beneficial effects are mainly restricted on symptoms and not on the course of the disease. Recently, heat shock protein 90 (HSP90) - known to stabilize JAK2 - has been reported as a promising therapeutic target in MPN. However HSP90 inhibitors show toxicity and induce the expression of stress-inducible proteins such as HSP70 and, most likely HSP27 as previously shown in other cancers. In addition, we and others have shown that HSP27, was strongly expressed in patients with idiopathic pulmonary or kidney tubulointerstitial fibrosis, underlying a relevant role of HSP27 in fibrotic processes. Taking into account both the beneficial effects of HSP inhibitors in leukemia and in MPN, and the possible implication of HSP27 in fibrosis, we have evaluated here the status of HSP27 in MF patient’s samples and assess the effectiveness of an HSP27 oligonucleotide inhibitor called OGX-427 in murine models. We report here the effect of OGX-427 in two murine models of thrombopoietin- and JAKV617F-induced myelofibrosis. OGX-427 limited the progression of the disease associated with a reduction of spleen weight and of megakaryocytic expansion. And more recently, our additional results show a decrease of reticulin fibrosis in JAK2V617F’s bone marrow. We show that HSP27 regulates JAK2/STAT5 proliferative effect through direct interactions, and we report an increase expression of HSP27 both in CD34+ circulating progenitors and in the serum of patients with NMP with fibrosis. Taking altogether, this work supports that extra and intracellular HSP27 plays a key role of in the pathophysiology in MF and highlight the potential therapeutic benefit of HSP27 inhibitors in this disorder.

Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La différenciation épidermique est un processus complexe qui requiert une régulation fine, chronologique et précise. La régulation de ce processus de différenciation dépend d'un grand nombre de voies de signalisation et d'activateurs qui doivent intervenir à des moments précis. Les différents processus et acteurs moléculaires qui sont impliqués dans la différenciation des kératinocytes sont encore mal connus. Étant donné la complexité de ce programme de différenciation, la mise en lumière de ces processus moléculaires revêt un grand défi. La DLK est un élément régulateur potentiel du processus de cornification des kératinocytes puisqu'elle n'est exprimée que dans les cellules les plus différenciées de l'épiderme. L'expression de DLK dans des kératinocytes humains normaux peu différenciés à l'aide d'un système adénoviral de transfert de gènes a révélé un rôle clé de DLK dans la différenciation épidermique. Cette expression de DLK engendre en effet divers processus primordiaux à la phase tardive de la différenciation des kératinocytes comme l'expression de la filaggrine, l'activation de la transglutaminase, l'accumulation de la protéine p21 cipl/WAFl et la dégradation de l'ADN. La différenciation épidermique s'accompagne également de l'expression de protéines de la famille des Hsp, entre autres la Hsp 27. L'expression de DLK dans des kératinocytes normaux humains entraîne la colocalisation de Hsp 27 avec l'enveloppe cornée ainsi que son insolubilisation, un phénomène observé dans la phase tardive de la différenciation épidermique. Finalement, le calcium est un important régulateur de la différenciation des kératinocytes. L'augmentation du niveau de calcium intracellulaire engendre une augmentation de l'activité de DLK et une re-localisation aux membranes tel qu'observé dans la couche granuleuse de l'épiderme. La localisation membranaire de DLK est aussi un reflet de son rôle important dans la cornification des kératinocytes. Ces travaux montrent donc le rôle important de DLK dans la différenciation épidermique. Ainsi, ils ont permis d'identifier un nouveau régulateur de ce programme de différenciation terminale.

Afin de comprendre les mécanismes impliqués dans la réépithélialisation des plaies cutanées, des expériences ont été réalisées chez la souris et à l'aide d'un nouveau modèle tridimensionnel humain issu du génie tissulaire. Bien qu'ayant eu lieu en fonction du temps, les expériences réalisées montrent que les changements, qui se produisent lors de la réépithélialisation, dépendent de la localisation des cellules dans l'épiderme en régénération. L'étude de l'expression des protéines de stress chez la souris révèle que chacune possède son propre patron d'expression au long de l'épiderme en régénération : Hsp60 et Hsp70 semblent associées à la prolifération des kératinocytes; Hsp27 et Hsp90, à leur différenciation. Les observations recueillies avec le modèle in vitro de guérison des plaies suggèrent deux mécanismes complémentaires de réépithélialisation : 1) le déplacement passif des couches superficielles à partir des marges de la plaie; 2) la régénération épidermique au centre des plaies à partir de la prolifération des kératinocytes locaux et leur migration les uns par-dessus les autres afin de faire progresser l'épiderme en régénération.

Par le processus d'érythropoïèse, notre organisme génère à tout instant de nouveaux globules rouges à partir de cellules souches hématopoïétiques. Dans le cadre d'études in vitro réalisées par notre équipe, nous avons démontré que l'hyperthermie légère augmente le taux d'expansion de ces cellules, en plus d'accélérer leur différenciation et leur maturation. Le but de mes travaux était de déterminer si la surexpression des protéines HSP27 et HSP70 qui accompagne l'hyperthermie légère était responsable en partie des effets observés sur la prolifération et la différenciation. Ces travaux démontrent que la surexpression de ces protéines, par l'emploi de lentivirus, serait partiellement responsable en début de culture d'une prolifération accélérée. De plus, leur surexpression serait impliquée dans l'augmentation de la maturation des cellules, favorisant l'expression de marqueurs spécifiques aux cellules érythroïdes matures, tels que la glycophorine A.

L'asthme est un trait complexe dont le phénotype est régulé par l'interaction de nombreux gènes et de l'environnement. Étant donné sa variabilité phénotypique, plusieurs individus asthmatiques ne répondent pas à la médication disponible. La recherche de nouvelles voies biologiques impliquées dans l'asthme est donc nécessaire. Les études d'expression génomique et les études d'association génomique (GWAS) permettent d'avoir une vue d'ensemble sur les gènes impliqués dans le développement d'un phénotype sans être biaisé par les connaissances actuelles et pourraient permettre la découverte de ces nouvelles voies. Ainsi, dans la première partie de cette thèse, une étude d'expression génomique a été utilisée pour caractériser les macrophages alvéolaires des individus asthmatiques en comparaison aux individus témoins. Cette étude a permis de cibler la famille des heat shock proteins (HSP), et plus particulièrement le gène HSPD1. De plus, la comparaison des données obtenues d'une étude d'expression génomique antérieure avec celles d'une étude récente a permis de démontrer que les études d'expression génomique sont un outil de sélection pertinent pour cibler de nouveaux gènes d'intérêt. La deuxième partie de cette thèse fait suite à la première GWAS effectuée dans l'asthme. Deux études présentées dans cette thèse ont permis de valider l'association des variants de la région 17q21 avec l'asthme dans un échantillon indépendant. Elles ont également permis d'initier la compréhension du mécanisme d'action par lequel ces variants régulent l'expression de certains gènes de cette région. Des études pour définir l'implication de HSPD1 dans les fonctions du macrophage alvéolaire ainsi que pour valider l'implication des gènes GSDMB, ORMDL3 et ZPBP2 dans l'asthme sont nécessaires afin de valider leur intérêt dans la recherche sur cette pathologie. Finalement, les différents éléments présentés dans cette thèse démontrent l'intérêt des techniques génomiques pour cibler de nouvelles voies biologiques liées au développement d'un phénotype en particulier.

Le cancer est une maladie évolutive qui se développe par l'intermédiaire de l'acquisition progressive par une même cellule d'un ensemble de mutations qui dissocient les liens moléculaires qui relient normalement la prolifération cellulaire aux mécanismes suppresseurs de tumeur, comme la differentiation, la sénescence et l'apoptose. De fait, l'émergence de la plupart des cancers humains résulte de la coopération entre des mutations qui élèvent ou dérégulent l'expression de l'oncoprotéine c-Myc et d'autres qui inactivent l'apoptose. Parallèlement, il a été proposé que le maintien du phénotype tumoral dépende du développement de mutations secondaires qui pallient les déséquilibres cellulaires associés au processus de transformation néoplasique. À cet effet, la surexpression constitutive du chaperon moléculaire Hsp90 représente l'une des mutations adaptatives les plus communément rencontrées dans le cancer. La fonction de Hsp90 semble collaborer à la transformation néoplasique en permettant la maturation d'un ensemble restreint de protéines à l'origine du développement des traits phénotypiques propres à la cellule tumorale, en prévenant la formation d'agrégats protéiques toxiques et en facilitant le transport intracellulaire et la sécrétion des protéines. Par conséquent, la réponse cellulaire au stress médiée par Hsp90 apparaît entraver directement le programme d'apoptose enclenché par une expression dérégulée de c-Myc. Toutefois, au moment de débuter mes études doctorales, aucun lien moléculaire entre ces deux mécanismes aux fonctions opposées n'avait encore été déterminé. Les résultats présentés dans cette thèse démontrent que le programme d'apoptose mis en place par une expression dérégulée de c-Myc requiert l'inactivation de Hsp90. La surexpression de c-Myc inhibe la fonction de Hsp90 par l'intermédiaire de l'induction du clivage du cofacteur p23 par les caspases. L'inactivation de Hsp90 accélère et accroît sélectivement l'apoptose des cellules transformées en provoquant la dégradation de multiples oncoprotéines tributaires de la fonction de Hsp90. À l'inverse, une inhibition du clivage de p23 contrecarre l'apoptose et contribue à la transformation des cellules qui surexpriment c-Myc en I facilitant la maturation et l'activation des substrats de Hsp90. Nous en concluons que le clivage de p23 lors de l'apoptose constitue un mécanisme inhibiteur de la transformation néoplasique déterminant puisqu'il fait obstacle à la réponse cellulaire au stress médiée par Hsp90. Nos observations mettent en évidence le rôle central de Hsp90 dans l'initiation tumorale et suggèrent que l'inhibition de p23 puisse représenter une approche viable dans le traitement des cancers caractérisés par une expression élevée ou dérégulée de c-Myc. En outre, nous démontrons qu'une expression dérégulée de c-Myc stabilise la sous-unité inductible a du facteur de transcription HIF-1 à la suite du retrait des facteurs trophiques en inactivant les enzymes prolyl-4-hydroxylase 2. L'activité transcriptionnelle du facteur de transcription HIF-1 facilite l'adaptation des cellules tumorales à leur milieu par la mise en place de mécanismes comme la glycolyse, l'érythropoïèse et l'angiogenèse. Ainsi, nous avons observé que l'accumulation de HIF-1 a corrèle avec une substitution de l'isoforme COX4-1 pour l'isoforme COX4-2 de l'enzyme mitochondriale cytochrome-oxydase, une adaptation qui accroît la synthèse d'ATP par la chaîne respiratoire. De plus, nous avons remarqué la conversion concomitante de la protéine LC3-I en son dérivé clivé LC3-II, suggérant que HIF-1α contribue à induire l'autophagie. Dans l'ensemble, nos résultats indiquent que la stabilisation de HIF-1α en réponse à une expression dérégulée de c-Myc promeut la survie des cellules transformées à la suite du retrait des facteurs trophiques.

Objectif: L'application d'un stress supraphysiologique (préconditionnement) induit une résistance cellulaire et tissulaire augmentée face à une agression secondaire. Des protéines appelées protéines de choc thermique (HSPs) sont exprimées physiologiquement suite à un stress qu'il soit de nature mécanique, chimique ou physique. Cette réponse, validée sur différents tissus mous, est évaluée ici en site osseux. Ce mécanisme de préconditionnement représente une nouvelle approche dans l'amélioration de la cicatrisation osseuse mettant en avant l'utilisation des capacités d'auto protection du tissu osseux. L'hypothèse de ce travail est qu'un stress thermique peut préserver le tissu osseux soumis secondairement à une irradiation aux rayons X. Pour valider cette hypothèse, cette étude nécessite:<br>- Le paramétrage du traitement laser requis en tant que moyen de chauffage pour induire le préconditionnement du tissu osseux.<br>- La détermination d'un protocole d'irradiation aux rayons X utilisé comme méthode quantifiable et reproductible de lésion secondaire<br>- Le développement d'un modèle d'étude de la vascularisation osseuse superficielle, indicateur de la réponse osseuse in vivo sur le long terme.<br>- La mise au point d'une technique d'immunohistochimie afin de caractériser les résultats obtenus lors de l'étude in vivo et de mettre en évidence la présence de HSP70 (forme inductible de HSP produite suite à un stress).<br><br>Matériels et Méthodes: Lors d'une étude préliminaire, le système laser est choisi et paramétré pour induire une augmentation contrôlée de la température osseuse.<br>Le protocole d'irradiation aux rayons X est défini pour créer une lésion osseuse localisée et pour limiter les effets secondaires au niveau des structures sous jacentes. Un modèle de chambre optique implantée sur le crâne de lapins est développé pour assurer le suivi longitudinal d'un même site osseux chez le même animal. Le réseau vasculaire superficiel est observé hebdomadairement pendant 12 semaines par la prise de photographies numériques. Un traitement informatique standardisé des images évalue la densité vasculaire, et différents critères morphologiques : longueur totale du réseau vasculaire, nombre de noeuds, et nombre de vaisseaux en fonction de leur diamètre. L'expérimentation in vivo est conduite sur 20 lapins divisés quatre groupes : groupe #1 : groupe contrôle (n=5); groupe #2: traitement laser (n=5); groupe #3 : irradiation par rayons X (n=5) ; groupe #4 : préconditionnement laser avant irradiation par rayons X (n=5).<br>L'analyse histologique et le marquage de HSP70 sont effectués sur des prélèvements osseux après la mise en place d'un protocole de fixation, décalcification et traitement immunohistochimique rigoureux.<br><br>Résultats: Un système diode-laser (815nm, 36J/cm² : un tir de 1.5W pendant 3 sec) est retenu pour le préconditionnement. L'irradiation aux rayons X consiste en dose unique de 18.75 Gy appliquée avec faisceau à rayons X de basse énergie.<br>Le réseau vasculaire est stable pour le groupe #1 et pour le groupe #2. Pour chaque critère observé, l'étude in vivo montre une chute significative pour les groupes #3 et #4 caractéristique de l'effet antiangiogénique des rayons X. Cependant, cette diminution vasculaire est limitée pour le groupe #4 vs. le groupe #3 et ceci en particulier pour les larges vaisseaux. L'analyse en histologie standard confirme ces résultats. Parallèlement, l'analyse immunohistochimique montre un marquage positif de HSP70 au niveau du réseau vasculaire osseux 18h après une irradiation laser.<br><br>Discussion: Le préconditionnement laser préserve la vascularisation osseuse superficielle des dommages induits par l'irradiation aux rayons X. Pour la première fois, cet effet cytoprotecteur est décrit en site osseux. Ainsi, notre étude montre que l'application laser utilisé comme méthode de chauffage localisée et reproductible, favorise la résistance aux effets antiangiogéniques des rayons X. Cet effet protecteur est observé in vivo au niveau vasculaire en particulier pour les vaisseaux les plus larges. Le marquage immunohistochimique confirme que le préconditionnement laser induit au niveau du réseau vasculaire osseux la production de HSP70, molécule chaperone décrite pour son action protectrice. Ce travail innovant offre la perspective d'accélérer et de favoriser la cicatrisation osseuse après une chirurgie programmée grâce à une mise en condition tissulaire.

La température est le paramètre abiotique qui influence de façon majoritaire les traits d’histoire de vie des espèces ectothermes. Pour appréhender les relations entre physiologie, environnement et histoire évolutive et leur influence respective sur la délimitation des aires de distribution des espèces, ce travail exploite les caractéristiques thermiques du milieu souterrain. Les résultats réfutent l’hypothèse de sténothermie des deux organismes hypogés étudiés Niphargus rhenorhodanensis et Proasellus valdensis et prouvent que l’histoire évolutive, la dispersion ou la compétition sont des paramètres importants dans l’établissement des aires de distribution des espèces souterraines. En outre, ce travail caractérise pour la première fois chez des organismes souterrains, un gène codant pour des protéines de choc thermique et montre l’importante sensibilité cellulaire de N. rhenorhodanensis face à une augmentation de température / Temperature is the abiotic factor that most influences the life-history traits of ectothermic organisms. In order to study the relationships between physiology, environment and evolutionary history and their respective role in the determination of species distribution areas, this work takes advantage of the thermal caracteristics of subterranean aquatic biotopes. Our results refuted stenothermy in both studied hypogean organisms Niphargus rhenorhodanensis and Proasellus valdensis and they showed that evolutionary history, dispersal and competition are important factors that determine the distribution of subterranean species. Moreover, this work characterized for the first time in subterranean organisms a gene encoding heat shock proteins and demonstrated the high cellular sensitivity of N. rhenorhodanensis to increased water temperature

L’objectif de ce travail de thèse a été d’analyser les stratégies de réduction de la fatigue musculaire en course de trail et potentiellement d’identifier certains paramètres d’influence de cette fatigue. La course de trail est un nouveau sport en essor qui induit une combinaison spécifique de fatigue et dommages musculaires des principaux muscles locomoteurs. Afin de pouvoir conduire des études interventionnelles, une étude descriptive préliminaire a été conduite pour caractériser la fatigue spécifique et les dommages musculaires induits par ce type d’épreuve de trail. Ensuite, la reproductibilité du trail comme modèle de fatigue a été vérifiée afin de pouvoir l’utiliser dans un contexte d’intervention. Enfin, deux études visant à réduire la fatigue induite par le trail ont été conduites. D’une part l’utilisation des vêtements de compression - très à la mode en trail a été analysée comme stratégie d’optimisation de la performance. D’autre part, a aussi été étudié l’effet d’un réchauffement préalable du muscle sur les dommages musculaires : Dans cette optique, une étude contrôlée en laboratoire a été menée, examinant les effets d’un réchauffement passif sur les conséquences fonctionnelles de course en descente chez une population non-entraînée. En résumé, les travaux conduits au sein de cette thèse fournissent une description de la fatigue en trail, et valident l’utilisation du trail comme modèle reproductible de terrain pour investiguer les stratégies de réduction de la fatigue. De plus, ils relativisent l’effet positif des vêtements de compression sur la performance et montrent le lien fonctionnel entre le réchauffement musculaire et la réduction des dommages musculaires induits par un travail excentrique. / The aim of this thesis was to analyse strategies to reduce muscular fatigue in trail running and potentially draw conclusions on the underlying mechanisms. Trail running is a new and upcoming sport that induces a combination of fatigue and muscle damage in the main locomotor muscles. To obtain conclusive evidence on the effect of intervention studies a preliminary descriptive study was undertaken to characterise typical fatigue and damage. Subsequently a model was developed and validated that would allow the investigation of interventions in an applied field setting. A popular current strategy in trail running is the use of compression garments; therefore the effect of these on performance was studied as an intervention. Furthermore, prior heating is anecdotally considered beneficial and recent research has suggested a potential mechanism to link this with reduced muscle damage. Therefore a controlled laboratory study was conducted, examining the effects of passive heating on functional consequences of downhill running in an untrained population. In synopsis, the research conducted for this thesis provides descriptive evidence and a validated terrain model to further investigate fatigue reduction strategies in trail running. Additionally it adds to the current literature in disproving a positive effect of compression garments on performance and demonstrating the functional link between heating and eccentric-induced muscle damage reduction.