Le génie tissulaire est une technologie prometteuse pour combler la pénurie de tissus. Cependant, la culture requise avant la greffe peut potentiellement conduire à la transmission d’agents infectieux ainsi qu’à des réactions immunitaires déclenchées par des protéines animales résiduelles. Lors de la reconstruction de tissus par auto-assemblage, l’ajout d’acide ascorbique et de sérum bovin stimule les cellules à sécréter la matrice extracellulaire pour résulter en tissu. En vue d’une utilisation clinique, des produits sans xénogène ont été testés. Le milieu défini LM enrichi de 1% de sérum humain stimule la prolifération cellulaire et ce milieu sans sérum soutient la différenciation adipogénique. Plusieurs analyses ont permis de caractériser les tissus adipeux produits: ils contiennent de petits adipocytes, sont 1,8 fois plus épais et deux fois moins contractiles que ceux produits en milieu standard. Ces résultats indiquent que des tissus conjonctifs et adipeux sécuritaires peuvent être produits pour de futures greffes. / Tissue engineering is a promising technology to address the shortage of tissues. However, culturing cells in vitro prior to transplantation can potentially lead to transmission of infectious agents as well as immune responses triggered by residual animal proteins. During tissue reconstruction by the self-assembly method, ascorbic acid and bovine serum stimulate cells to secrete extracellular matrix resulting in a manipulatable tissue. For clinical purposes, xenogenic-free products were tested. The defined medium (LM) enriched with 1% human serum stimulated cell proliferation and serum-free medium supported the adipogenic differentiation. Several analyses were performed to characterize the reconstructed adipose tissues: they contain small adipocytes, are 1.8 times thicker and half as contractile as those produced in standard medium. These results indicate that improved connective and adipose tissues can be produced for future transplantation.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2022 / La greffe de peau autologue chez les grands brûlés est une technique répandue, mais souvent limitée lorsque le patient présente une petite surface disponible pour le prélèvement des greffons. Les substituts de peaux bilamellaires autoassemblés (PRB) permettent de pallier cette limitation, mais leur production est longue. Le but de cette étude est donc d'optimiser la méthode pour réduire le délai nécessaire avant la première greffe. Pour cela, nous souhaitons développer une technique de décellularisation et d'entreposage de dermes allogéniques produits par autoassemblage. Notre hypothèse est que les PRB produites avec les dermes reconstruits décellularisés (DRD) sont comparables aux PRB préparées avec le protocole du LOEX (Germain et al., 2018) présentement en essai clinique. Nos objectifs sont de trouver les conditions permettant d'éliminer les résidus allogéniques des dermes décellularisés et de les recellulariser de manière à soutenir la différenciation épidermique et la formation de la jonction dermoépidermique. Nous avons déterminé que l'utilisation de deux cycles de choc osmotique avec 0,4 mg/mL de DNAse permet de réduire la quantité résiduelle d'ADN allogénique en dessous de 50ng/mg de tissu sec. L'entreposage d'un mois permet de complémenter cette décellularisation en diminuant la dose de DNAse nécessaire à 0,2mg/mL. En testant différentes populations pour la formation matricielle et densités de fibroblastes pour la recellularisation de DRD, nous avons déterminé que la recellularisation d'une matrice riche en collagène avec une faible densité de fibroblastes (10 000 f/cm$^2$) permet d'obtenir des PRB similaires histologiquement aux PRB standards. Cette recellularisation permet également de regagner les glycosaminoglycanes et l'épaisseur perdues lors de la décellularisation. En conclusion, la méthode de décellularisation utilisée est efficace pour l'atteinte des seuils établis par la littérature et complémentée par l'entreposage des DRD. La recellularisation de ces matrices permet l'obtention de PRB de manière accélérée par rapport à la méthode classique. Le tout est adapté pour une translation clinique. / Autologous skin grafting in burn patients is a widespread technique, but often limited when patients have a small area available for graft harvesting. Self-assembled skin substitutes (SASS) can overcome this limitation, but their production is time consuming. The aim of this study is therefore to optimize the method in order to reduce the time required before the first graft. To this end, we aim to develop a technique for decellularization and storage of allogeneic dermis produced by the self-assembly approach. Our hypothesis is that SASS produced with decellularized reconstructed dermis (DRD) are comparable to autologous SASS prepared with the LOEX protocol(Germain et al., 2018) currently in clinical trial. Our objectives are to find conditions to remove allogeneic residues from decellularized dermis and recellularize it in a way that supports epidermal differentiation and dermal-epidermal junction formation. We determined that the use of two cycles of osmotic shock with 0.4 mg/mL DNAse reduces the residual amount of allogeneic DNA below 50 ng/mg of dry tissue. Storage for one month helps this decellularization by reducing the dose of DNAse required to 0.2 mg/mL. By testing different fibroblast populations and densities for recellularization, we determined that recellularization of a collagen-rich matrix with a low fibroblast density (10 000 f/cm2) yields SASS histologically similar to standard SASS. This recellularization also allows the retrieval of the glycosaminoglycans and thickness lost during decellularization. In conclusion, the decellularization method used is effective in meeting the thresholds established in the literature and is complemented by DRD storage. The recellularization of these matrices allows the obtention of SASS in an accelerated manner compared to the conventional method. This is suitable for clinical translation.

La production de tissus par génie tissulaire est un domaine dont la finalité clinique est en pleine expansion. De nombreux facteurs restent cependant à améliorer afin de permettre leur utilisation extensive. Nos objectifs étaient d’évaluer la capacité d’extraits d’algue et des molécules isolées de sérum à optimiser différentes étapes de la production des tissus par génie tissulaire. Nos hypothèses étaient que l'ajout des extraits d’algue diminue le temps de fabrication des peaux reconstruites en stimulant la production et le dépôt de matrice alors que les protéines isolées du sérum stimulent la production de microparticules (MP) par les cellules du derme, ces MP ayant été démontrées avoir une action sur la croissance des cellules endothéliales et donc sur la vascularisation des greffons. / Skin production by tissue engineering method is a field whose clinical purpose is expanding. However, many factors need to be improved to enable their extensive use. Our objectives were to evaluate the ability of seaweed extracts and serum molecules to optimize different stages of tissue-engineered skin production. Our hypotheses were that adding seaweed extracts reduces the manufacturing time of reconstructed skin by stimulating the production and the deposition of the extracellular matrix while serum- isolated proteins stimulate the production of microparticles (MP) by the dermal cells, the MP stimulating growth of endothelial cells and thus, potentially, vascularization of the grafts.

Titre de l'écran-titre (visionné le 15 mai 2023) / Le microenvironnement tumoral se caractérise notamment par une altération de ses propriétés mécaniques. Cependant, la plupart des modèles actuels sont incapables de recréer fidèlement les propriétés mécaniques d'une tumeur. Les modèles d'ingénierie tissulaire basés sur la méthode d'auto-assemblage ont le potentiel de mieux récapituler l'architecture et la composition du stroma. Ici, nous avons utilisé la méthode d'auto-assemblage basée sur un modèle de tissu de vessie pour créer un environnement semblable à celui d'une tumeur. Le modèle tumoral repose sur la capacité des fibroblastes primaires sains (HFs) induits en fibroblastes associés au cancer (iCAFs) à reconstituer un stroma récapitulant les propriétés d'une tumeur de vessie. Les objectifs de ce projet sont de caractériser le modèle auto-assemblé et définir les composantes permettant de contrôler l'induction des fibroblastes. Nos résultats ont montré que la composition de la matrice extracellulaire (MEC) dérivée des iCAFs est plus rigide, avec un dépôt et un remodelage accru du collagène et de la fibronectine. La technique de microscopie à polarisation quantitative a montré que les cellules urothéliales cultivées sur la MEC composée d'iCAFs étaient plus contractiles et présentaient une translocation nucléaire élevée de YAP. De plus, nos résultats montrent une augmentation de la prolifération des cellules urothéliales présentes sur le stroma des iCAFs ainsi qu'une expression accrue de marqueurs de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) qui corrèlent avec l'augmentation de la rigidité de la MEC des modèles iCAFs. Une caractérisation plus fine de l'activation des fibroblastes montre un changement de morphologie, d'expression de l'α-SMA et de contractilité cellulaire. En somme, les niveaux de rigidité et la structure du stroma obtenus à l'aide de ce modèle de génie tissulaire sont comparables à ce qui est observé dans les cancers de vessie. De plus, l'urothélium présente également des réponses moléculaires attendues dans un environnement tumoral très rigide. Finalement, une meilleure compréhension des phénomènes d'induction des iCAFs permettrait un meilleur contrôle des propriétés biophysiques des modèles tumoraux produits par auto-assemblage. À terme, ce projet ouvre la porte à la production de modèles reproduisant plus fidèlement les propriétés physiques des tumeurs pour étudier les mécanismes de la progression tumorale in vitro. / A tumor microenvironment is characterized by its altered mechanical properties. However, most models remain unable to faithfully recreate the mechanical properties of a tumor. Engineered models based on the self-assembly method have the potential to better recapitulate the stroma architecture and composition. Here, we used the self-assembly method based on a bladder tissue model to engineer a tumor-like environment. The tissue-engineered tumor models were reconstituted from stroma-derived healthy primary fibroblasts (HFs) induced into cancer-associated fibroblast cells (iCAFs). The objectives of this project are to characterize the self-assembled model and to define the components that control fibroblast induction. Our results show that the iCAFs-derived extracellular matrix (ECM) composition was found to be stiffer, with increased ECM deposition and remodeling. The urothelial cells overlaid on the iCAFs-derived ECM were more contractile, as measured by quantitative polarization microscopy, and displayed increased YAP nuclear translocation. We further showed that the proliferation and expression of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) marker were increased in the urothelial cells, which correlate with the increased stiffness of the iCAFs-derived ECM. Further characterization of fibroblast activation shows a change in morphology, in α-SMA expression, and in cell contractility. Together, our results demonstrate that our tissue-engineered tumor model can achieve stiffness levels comparable to that of a bladder tumor. The urothelium also exhibits molecular responses expected in a highly rigid tumor environment. Finally, a better understanding of the induction of iCAFs would improve the control of the biophysical properties of tissue-engineered tumor models. Ultimately, this project could lead to the production of models that more accurately reproduce the physical properties of tumors to study the mechanisms of tumor progression in vitro.

Le traitement conventionnel pour les brûlures sévères est l'autogreffe. Il s'agit toutefois d'une méthode comportant des limites, notamment dans le cas des patients ayant souffert de brûlures profondes sur une grande superficie de leur corps. Pour pallier le manque de sites donneurs, il est possible de faire appel au génie tissulaire afin de produire des peaux reconstruites bilamellaires (PRB) qui peuvent remplacer les autogreffes. Le système de culture présentement utilisé pour la production des PRB utilise une couche nourricière humaine (CNH) lors de la culture des kératinocytes. Les milieux de culture actuellement utilisés pour la culture des cellules destinées à la production des PRB, soit les kératinocytes et les fibroblastes, contiennent du sérum bovin. Dans un but d'offrir des traitements de très haute qualité et le plus sécuritaire possible, il serait avantageux de remplacer ou de cesser l'utilisation de la CNH et du sérum puisque ceux-ci peuvent présenter des risques potentiels de transmission de pathogènes et de réactions immunitaires à cause de leur nature allogénique ou xénogénique. L'objectif de ce projet de maîtrise est donc de développer un système de culture complètement défini, en plus d'être sans éléments allogéniques ni xénogéniques, et qui permettrait la conservation des cellules souches épithéliales et la production de substituts cutanés de qualité. Il a été possible de produire une protéine, soit la protéine Sp1, qui pourra être utilisée comme additif dans le milieu de culture afin d'éventuellement remplacer la CNH lors de la culture des kératinocytes. Par ailleurs, il a été possible, à l'aide d'un milieu sans sérum pour les kératinocytes développé par notre équipe et d'un milieu sans sérum pour les fibroblastes disponible commercialement, de produire des PRB sans sérum. Celles-ci ont été soumises à des analyses *in vitro* et *in vivo* et présentent des résultats prometteurs quant à la conservation des cellules souches épithéliales et à la qualité des PRB produites. / The conventional method to treat severe burn injuries is autografts. However, it is a method with limitations, especially in the case of patients who have suffered deep burns over a large proportion of their body. To overcome the lack of donor sites, it is possible to use tissue engineering to produce tissue-engineered skin substitutes (TES) that can replace autografts. The culture system currently used for the production of TES uses a human feeder layer (HFL) for the culture of keratinocytes. The culture media currently used for the culture of cells intended for the production of TES, namely keratinocytes and fibroblasts, contain bovine serum. In order to offer treatments of a very high quality and as safe as possible, it would be advantageous to replace or discontinue the use of HFL and serum since these can present potential risks of transmission of pathogens and immune reactions because of their allogenic or xenogeneic nature. The objective of this master's project is therefore to develop a completely defined culture system, in addition to being free of allogenic and xenogeneic elements, and which would allow the conservation of epithelial stem cells and the production of skin substitutes of great quality. It was possible to produce a protein, the Sp1 protein, which could be used as an additive in the culture medium in order to eventually replace the HFL during the culture of keratinocytes. Furthermore, it was possible, using a serum-free medium for keratinocytes developed by our team and a serum-free medium for fibroblasts commercially available, to produce serum-free TESs. These have been subjected to *in vitro* and *in vivo* analyzes and show promising results pertaining the preservation of epithelial stem cells and the quality of the TESs produced.

En raison des problèmes inhérents aux biomatériaux et à la transplantation d’organes, tels que la durée de vie, le rejet et la disponibilité, l'ingénierie tissulaire est désormais envisagée à plus long terme comme solution de remplacement des organes défaillants. Cette approche vise à induire et structurer la croissance tissulaire afin d’organiser les cellules en tissus et ces tissus en organes. Pour ce faire, un bioréacteur reproduisant les conditions intracorporelles est indispensable. Au cours de ce projet de maîtrise, un bioréacteur à perfusion spécifique à la régénération des artères a été conçu pour favoriser la croissance de ce tissu et étudier l’effet des diverses contraintes mécaniques (tension axiale, élongation axiale, pression interne, débit, cisaillement) sur ses propriétés mécaniques finales. La conception du bioréacteur a été effectuée suivant une méthodologie rigoureuse comprenant l’identification des besoins, la rédaction du cahier des charges, la modélisation assistée par ordinateur, la réalisation du prototype et la validation. Ce bioréacteur sera par la suite utilisé par le laboratoire pour le développement d’un substitut artériel ayant les propriétés et la structures d’une artère native. / Tissue engineering provides a new approach for overcoming the current problem of organ shortage and biomaterial failure. Three-dimensional tissues, such as arteries, are much more difficult to regenerate than bi-dimensional ones. In this context, a specific bioreactor is required in order to reproduce and maintain the appropriate environment required for 3-D tissue regeneration. During this project, a perfusion bioreactor specific for arterial tissue was designed to stimulate growth and study the effects of mechanical factors such as axial stress, axial strain, internal pressure, flow and shear stress, on final construct properties. The design was realized following a step-by-step methodology: identification of the needs, listing of the specifications, computer assisted modeling and design, and prototype realisation and validation. This bioreactor will be used by the laboratory for the development of an arterial substitute with similar properties and structure of a native artery.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative hétérogène, incurable et sans traitement efficace qui se caractérise principalement par une dégénérescence sélective des neurones moteurs de la moelle épinière et du cerveau. Cette maladie se présente généralement par une faiblesse musculaire progressive, une hypertonie spastique, de la dysphagie, l’apparition de fasciculations, une paralysie presque totale et le décès de 3 à 5 ans après l’apparition des premiers symptômes. La SLA se présente sous deux formes distinctes : la SLA de type familial (SLAF) et la SLA de type sporadique (SLAS). La SLAF est associée à des mutations génétiques précises et est transmise de façon autosomale dominante dans la très grande majorité des cas. Quant à la SLAS, elle se distingue par son côté sporadique, sans cause génétique associée, et représente de 90 à 95 % de tous les cas de SLA. La peau est considérée par certains comme le plus grand organe du corps humain. Elle joue un rôle important dans la thermorégulation ainsi que dans la synthèse de la vitamine D et agit comme barrière naturelle contre l’environnement. Ses couches principales, l’épiderme et le derme, sont principalement et respectivement formées de kératinocytes et de fibroblastes. Le concept du « non-cell autonomous toxicity » stipule qu’une cellule ne présentant pas de mutation associée à une maladie donnée peut présenter un phénotype pathologique. Dans l’étude de la SLA, ce concept s’applique tant aux cellules neuronales qu’aux cellules non neuronales, comme les cellules endothéliales ou les fibroblastes de peau. Hors du système nerveux central, les fibroblastes de peau pourraient représenter une source importante et non invasive d’échantillons biologiques pour l’étude de la SLA. Les exosomes sont des vésicules extracellulaires de 30 à 200 nm de diamètre. Ils sont sécrétés par tous les types cellulaires et représentent un moyen de communication cellulaire important grâce au transport de diverses molécules, dont des protéines et de l’ARN. Ces vésicules représentent une potentielle source de biomarqueur pour l’étude de diverses maladies neurodégénératives, dont la SLA. Dans le cadre du projet de recherche présenté dans cette thèse, les travaux réalisés ont permis de démontrer que l’utilisation de cellules de peau, dont des fibroblastes et des kératinocytes de patients atteints de SLA, permet d’étudier certains aspects de la pathologie de la maladie. En effet, l’utilisation d’un protocole de production de peau reconstruite en laboratoire par génie tissulaire à partir de cellules de patients atteints de SLA a permis de détecter différentes anomalies de la matrice extracellulaire en plus d’une délocalisation de la protéine TDP-43, précédemment détectée uniquement dans le système nerveux central de patients atteints de SLA. Les fibroblastes de peau ont aussi été démontrés comme étant une source d’intérêt pour la découverte de biomarqueurs associés à la maladie. Le sécrétome - le matériel biologique sécrété par une cellule – provenant des fibroblastes peut être purifié à l’aide d’une technique de précipitation protéique qui permet d’obtenir un culot pur, exempt d’impuretés et de sels provenant du milieu de culture. Parmi les éléments identifiés chez les protéines, les exosomes ont été démontrés d’intérêt et importants dans leur culture. En effet, lorsque cultivés en trois dimensions, les exosomes dérivés de fibroblastes de peau 3D contiennent différentes molécules augmentant la prolifération ainsi que la migration cellulaire. De plus, ces vésicules extracellulaires contiennent une grande quantité de protéines de la matrice extracellulaire, démontrant leur importance dans la sécrétion et l’assemblage de celle-ci en culture 3D. Ces exosomes ont de plus la capacité d’améliorer le processus de guérison de plaies dans un modèle de peau reconstruite en laboratoire formé de fibroblastes et de kératinocytes. Finalement, la protéine SOD1, associée au développement de certains types de SLA familiale, a pu être démontrée comme étant un biomarqueur neuropathologique possible de la SLA sporadique. Au même titre que des patients présentant une mutation du gène SOD1, des patients atteints de SLA sporadique présentent certains aspects pathologiques associés à la maladie, dont la présence d’agrégats cytoplasmiques de la protéine mal repliée dans les neurones moteurs du système nerveux central. Globalement, mes travaux démontrent que les cellules de peau représentent un échantillon biologique important dans l’étude de la SLA et qu’elles pourraient constituer un outil novateur dans la découverte de nouveaux biomarqueurs de la maladie. Les exosomes sécrétés par les fibroblastes de peau en culture 3D ont été démontrés comme étant importants dans la prolifération, la migration cellulaire et la sécrétion de protéines de la matrice extracellulaire. Ces vésicules présentent un potentiel énorme dans la découverte de biomarqueurs associés à la maladie. La présence d’agrégats cytoplasmiques de la protéine SOD1 dans les neurones moteurs du système nerveux central de patients atteints de SLA sporadique permet de croire que cette protéine pourrait devenir un biomarqueur important dans le diagnostic de la maladie. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a heterogenous neurodegenerative disease. Presently, it is an incurable disease without any effective treatment and is characterised by selective degeneration of motor neurons in the central nervous system. The symptoms that most patients display include cramps, weakness and muscle atrophy of the hands and feet progressing to the forearms, shoulders and legs, eventually leading to complete paralysis. Nearly 90% of all ALS cases are sporadic, with no known cause. The other 10% of cases represent familial ALS and are associated to ALS-linked genes, such as SOD1, FUS/TLS, TARDBP, and C9ORF72. The skin is considered by some to be the biggest organ of the human body. It plays an important role in thermoregulation as well as vitamin D synthesis. Skin also acts as a natural barrier against environmental threats. It is comprised of the epidermis and the dermis, which are made of keratinocytes and fibroblasts, among other things. The non-cell autonomous toxicity paradigm in ALS has been well established. Outside of the central nervous system, skin fibroblasts could potentially be an important source of biomarkers. The work presented in this thesis demonstrates that skin cells, such as fibroblasts and keratinocytes, derived from ALS patients, allow for the study of different pathological aspects of the disease. The use of a tissue-engineered skin from ALS patients skin cells allows for detection and observation of extracellular matrix structure abnormalities, as well as mislocalization of TDP-43, previously only detected in the motor neurons of patients. Results from experiments associated with this study shed more light on skin fibroblasts, which appear to be a potential source of novel biomarkers. Their secretome can be purified using an optimized protocol leading to pure proteins without salt contamination coming from the cell culture media. As a result, exosomes are of great interest for the discovery of novel biomarkers for the diagnosis of ALS, for following its progression, and for the culture of fibroblast cells. When cultivated in a 3D-fashion, the secreted exosomes contain molecules enhancing cell proliferation and migration, as well as high amounts of extracellular matrix proteins. These extracellular vesicles also help to enhance wound healing in a tissue-engineered model made of skin fibroblasts and keratinocytes. Finally, the SOD1 protein, which is associated with the development of some familial ALS cases, should be considered a potential neuropathological biomarker of sporadic ALS. Cytoplasmic aggregates of the misfolded protein were detected in the motor neurons of sporadic patients, alongside familial ALS patients who were carriers of an SOD1 mutation. Overall, this work shows that skin cells represent an important and minimally invasive biological sample in the study of ALS. These cells are also of interest in the discovery of novel ALS biomarkers. Exosomes secreted by skin fibroblast cells in a 3D culture are important in cell proliferation and migration. They play a crucial role in extracellular matrix protein secretion. The results of this study show that exosomes, proven to be secreted by dermal fibrobasts when cultivated in a 3D fashion, may become as a primary source of biomarkers in ALS. Cytoplasmic aggregates of misfolded SOD1 in motor neurons of sporadic ALS patients could lead to the development of diagnostic tests with SOD1.

Afin de comprendre les mécanismes impliqués dans la réépithélialisation des plaies cutanées, des expériences ont été réalisées chez la souris et à l'aide d'un nouveau modèle tridimensionnel humain issu du génie tissulaire. Bien qu'ayant eu lieu en fonction du temps, les expériences réalisées montrent que les changements, qui se produisent lors de la réépithélialisation, dépendent de la localisation des cellules dans l'épiderme en régénération. L'étude de l'expression des protéines de stress chez la souris révèle que chacune possède son propre patron d'expression au long de l'épiderme en régénération : Hsp60 et Hsp70 semblent associées à la prolifération des kératinocytes; Hsp27 et Hsp90, à leur différenciation. Les observations recueillies avec le modèle in vitro de guérison des plaies suggèrent deux mécanismes complémentaires de réépithélialisation : 1) le déplacement passif des couches superficielles à partir des marges de la plaie; 2) la régénération épidermique au centre des plaies à partir de la prolifération des kératinocytes locaux et leur migration les uns par-dessus les autres afin de faire progresser l'épiderme en régénération.

Les substituts valvulaires disponibles actuellement comportent encore plusieurs lacunes. La disponibilité restreinte des allogreffes, les risques de coagulation associés aux valves mécaniques et la durabilité limitée des bioprothèses en tissu animal sont toutes des problématiques que le génie tissulaire a le potentiel de surmonter. Avec la méthode d'auto-assemblage, le seul support des cellules consiste en leur propre matrice extracellulaire, permettant la fabrication d'un tissu entièrement libre de matériau exogène. Ce projet a été précédé par ceux des doctorantes Catherine Tremblay et Véronique Laterreur, ayant respectivement développé une méthode de fabrication de valves moulées par auto-assemblage et une nouvelle version de bioréacteur. Au cours de cette maîtrise, le nouveau bioréacteur a été adapté à une utilisation stérile avec des tissus vivants et la méthode de fabrication de valves moulées a été modifiée puis éprouvée avec la production de 4 prototypes. Ces derniers n'ont pas permis d'obtenir des performances satisfaisantes en bioréacteur, motivant la conception d'une nouvelle méthode. Plutôt que de tenter de répliquer la forme native des valves cardiaques, des études récentes ont suggéré une géométrie tubulaire. Cela permettrait une fabrication simplifiée, une implantation rapide, et un encombrement minimal en vue d'opérations percutanées. Cette approche minimaliste s'accorde bien avec la méthode d'auto-assemblage, qui a déjà été utilisée pour la production de vaisseaux de petits diamètres. Un total de 11 tubes ont été produits par l'enroulement de feuillets fibroblastiques auto-assemblés, puis ont été transférés sur des mandrins de diamètre inférieur, leur permettant de se contracter librement. La caractérisation de deux tubes contrôles a démontré que cette phase de précontraction était bénéfique pour les propriétés du tissu en plus de prévenir la contraction en bioréacteur. Les prototypes finaux pouvaient supporter un écoulement physiologique pulmonaire. Cette nouvelle méthode montre que le procédé d'auto-assemblage a le potentiel d'être utilisé pour fabriquer des valves cardiaques tubulaires. / High hopes are placed on tissue engineered heart valves to circumvent the restricted availability of allografts, the coagulation risks caused by mechanical valves and the limited durability of pericardial bioprostheses. With the self-assembly method, the only support for the cells is the extracellular matrix they themselves produce, allowing the tissue to be completely free from exogenous materials during its entire fabrication cycle. The project was preceded by those of the doctorate students Catherine Tremblay and Véronique Laterreur, who developed a new method to produce auto-assembled molded valves and a new version of the bioreactor used by our group, respectively. During this master, the new bioreactor has been adapted to a sterile use with living tissues and the molded valves method has been modified and tested with the production of 4 prototypes, which didn't provide satisfying results during their bioreactor trials. A new fabrication method was thus developed. Recently, the tubular shape has been suggested as a simple and effective geometry for tissue engineered heart valves, allowing easy fabrication, fast implantation, and minimal crimped footprint from a transcatheter delivery perspective. This minimalistic design is also well-suited for the self-assembly method, which has already proven its potential for small diameter vascular grafts. A total of 11 tubular constructs were produced by rolling self-assembled human fibroblastic sheets on solid mandrels. After maturation, the tissues were transferred onto smaller diameter mandrels to allow their free contraction. The characterization of two control tubes revealed that while preventing further contraction in the bioreactor, this precontraction phase was also beneficial for the tissue properties. The final prototypes could withstand a physiological pulmonary flow. This new method shows that the self-assembly process could be used to achieve functional tubular heart valves.

Le gène RNF213 a été identifié comme un facteur de risque associé au développement de maladies cérébrovasculaires (MCV) notamment, la maladie de Moyamoya (MMM) et les anévrismes intracrâniens (AIC). Malgré une incompréhension des fonctions biologiques exactes, la ring finger protein 213 (RNF213) serait impliquée dans la régulation de la prolifération cellulaire, de l’angiogenèse et de l’inflammation. Les travaux présentés dans cette thèse se concentrent sur le développement de modèles vasculaires in vitro afin de mieux caractériser le rôle de RNF213 dans MCV. L’hypothèse est que l’invalidation de la protéine RNF213 dans des cellules endothéliales (CE) cerébrales pourrait recréer certains phénotypes associés au développement de la MMM et à la formation d’AIC. Des cellules endothéliales microvasculaires humaines de cerveau (hCMEC/D3) invalide en RNF213 (RNF213-/- ) ont été initialement générées par la méthode Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats et la protéine associée Cas9 (CRISPR-Cas9) double nickase. La première partie des travaux porte sur le rôle que jouerait RNF213 dans l’homéostasie de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et dans les étapes précoces de la pathogenèse associée à la MMM. Plus précisément, la perte des jonctions adhérentes provoquée par l’invalidation de RNF213 dans les hCMEC/D3 a été évaluée in vitro sur plusieurs paramètres, tels que la morphologie endothéliale, l’expression génique des protéines de jonctions, la localisation cellulaire, la perméabilité, l’infiltration immunitaire et le sécrétome des cytokines inflammatoires. Les résultats ont démontré que la déficience en RNF213 provoque une diminution de l’expression de la platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1) qui affecte conséquemment la formation adéquate du complexe jonctionnel. De plus, une diminution de l’expression des gènes de la claudine-5, de la b-caténine et de la plakoglobine a été mesurée. La perte de RNF213 est également accompagnée d’un relargage de plusieurs cytokines proinflammatoires. En deuxième lieu, les travaux de cette thèse ont également démontré que RNF213 joue un rôle prépondérant dans le processus angiogénique des hCMEC/D3. Ceci a été étudié sous plusieurs angles d’approches, tels que la prolifération et la migration cellulaire, la formation de micro-capillaires sur un support Matrigel® et dans un modèle tridimensionnel (3D) reconstruit par génie tissulaire, l’expression génique et le sécrétome angiogénique. Les résultats ont démontré une diminution du taux de division cellulaire et une augmentation de la migration. Les études in vitro ont démontré également, pour la première fois, une augmentation significative de la formation de micro-capillaires et de la sécrétion abondante de facteurs pro-angiogénique, tels que le vascular endothelial growth factor (VEGF). Plus précisément, les hCMEC/D3 déficientes en RNF213 forment un réseau plus vaste, dense et étendu de micro-capillaires sur un support de Matrigel®. iii Lorsqu’ensemencées dans un modèle 3D plus complexe structurellement, les hCMEC/D3 forment un réseau pouvant s’apparenter au réseau de capillaires compensatoire retrouvé chez les patients MMM. Dans l’ensemble, l’invalidation du gène RNF213 dans un modèle in vitro 3D de cellules endothéliales cérébrales permet de reproduire certains phénotypes pathologiques de la MMM et devient donc ainsi le 1er modèle in vitro pour l’étude de cette maladie et des autres maladies associées à RNF213. Finalement, nous avons mis au point un nouveau modèle de vaisseaux sanguins de petit calibre reconstruit par génie tissulaire (TEBV) pour son utilisation dans l’étude in vitro de maladies vasculaires et de MCV complexes. L’ensemencement de fibroblastes ou de cellules musculaires lisses (CML) directement sur un mandrin de polyéthylène téréphtalate glycol (PETG) prétraité aux rayons ultraviolets C (UV-C) a permis de former des feuillets circulaires, manipulables et superposables. Avec cette technique, nous avons généré des TEBV complets avec les trois principales couches, soit l’adventitia, la media et l’intima tunica, qui possèdent des propriétés histologiques et mécaniques similaires aux artères humaines natives. Ce modèle optimisé et uniformisé de TEBV permettra de modéliser des pathologies vasculaires complexes, telles que la MMM et les AIC. En effet, la génération de vaisseaux complets à partir de cellules pathologiques ou de cellules éditées génétiquement pourrait faciliter la caractérisation de la pathogenèse et aider au développement de médicaments. / RNF213 has been associated as a susceptibility gene for the development cerebrovascular diseases (CVDs), in particular, moyamoya disease (MMD) and intracranial aneurysms (ICA). While the exact biological functions of RNF213 remain to be demonstrated, it is known to be involved in the regulation of cell proliferation, angiogenesis and inflammation. The work presented in this thesis focuses on the development of vascular models in vitro to better characterize the role of RNF213 in CVDs. The hypothesis is that the complete invalidation of the RNF213 protein in brain endothelial cells (EC) could recreate evident phenotypes associated with the development of MMD and the formation of ICA. We have initially generated human brain microvascular endothelial cells (hCMEC/D3) deficient in RNF213 (RNF213-/- ) using the robust CRISPR-Cas9 double nickase method. At first, our work described the role that RNF213 would play in the homeostasis of the blood-brain barrier (BBB) maintenance and in the early stages of MMD pathogenesis. More specifically, the loss of adherent junctions caused by the invalidation of RNF213 in hCMEC/D3 was evaluated in vitro on several parameters, such as endothelial morphology, gene expression of junctional proteins, cellular localization, permeability, immune infiltration and the secretome of inflammatory cytokines. Our data demonstrated that RNF213 deficiency provokes a significant decrease in the platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1) expression, which consequently affects the proper formation of the junctional complex. A decrease in the expression of the claudin-5, b-catenin and plakoglobin genes was also measured. In addition, RNF213 loss is accompanied with a release of several pro-inflammatory cytokines. Thereafter, the present work also demonstrated that RNF213 plays a preponderant role in the angiogenic process of hCMEC/D3. Angiogenesis has also been characterized on several aspects, such as proliferation, migration, formation of micro-capillaries on a Matrigel®-based support and in a 3D model reconstructed by tissue engineering, gene expression and secretion of angiogenic factors. Our data demonstrates a decrease in cell division rate and an increase in cell migration. In vitro studies have also shown, for the first time, a significant increase in micro-capillary formation and abundant secretion of pro-angiogenic factors, such as the vascular endothelial growth factor (VEGF). More precisely, the hCMEC/D3 deficient in RNF213 forms a wider, denser and more extensive network of micro-capillaries on a Matrigel®-based support. When seeded in a more structurally complex 3D model, hCMEC/D3 form a network that can resemble to the compensatory capillary network found in MMM patients. Overall, the invalidation of the RNF213 gene in a 3D in vitro model of cerebral endothelial cells makes it possible to reproduce certain pathological phenotypes of MMM and v therefore becomes the 1st in vitro model for the study of this disease and other diseases associated with RNF213. Finally, we developed a new model of small-caliber blood vessels reconstructed by tissue engineering (TEBV) to be used to study vascular diseases and complex CVD in vitro. The direct seeding of fibroblasts or smooth muscle cells (CML) onto a polyethylene terephthalate glycol (PETG) mandrel that was pretreated with ultraviolet C (UV-C) radiation facilitate the formation of circular cell sheets, which could be manipulated and stacked in top of each other. Using this novel technique, we were able to successfully generate complete TEBVs with the three main arterial layers: the adventitia, the media and the intima tunica. Taken together, our TEBV model has histological and mechanical properties similar to native human arteries. Furthermore, this optimized and standardized 3D vascular construct will accelerate the scientific progress to modelized complex vascular pathologies, such as MMD and AIC. Indeed, the generation of complete vessels derived from pathological cells or genetically edited cells could facilitate the characterization of pathogenesis and help in the development of drugs.