Le psoriasis est une inflammation chronique assistée du système immunitaire chez l’homme. Dans les lésions psoriasiques, les modifications microanatomiques vasculaires sont un des principaux signes d’une peau psoriasique. Cette étude visait à créer une peau vascularisée reconstruite, bien caractérisée, et facile d’accès pour l’évaluation des candidats au médicament ainsi que pour l’étude de la biologie de l’inflammation et de l’angiogenèse. Les équivalents de peau psoriasique et saine vascularisée ont été produits à l’aide de la méthode par auto-assemblage, qui a été modifiée par l’ajout de cellules endothéliales dermiques microvasculaires humaines. Les similitudes architecturales et caractéristiques des substituts avec l’échantillon in vivo ont été analysées par coloration au trichrome de Masson. Un épiderme bien développé a été observé sur les substituts de peau saine, étant donné qu’un épiderme hyperprolifératif a été observé sur des substituts de peau psoriasique. La nature psoriasique des substituts a été étudiée à l’aide de niveaux d’expression de cytokératine et de marqueurs de différenciation. Les conditions nécessaires à la vascularisation des substituts ont été optimisées. La formation, la différenciation, l’ampleur et la quantité de structures pseudo-capillaires ont été observées dans le cadre d’études par immunofluorescence in toto (IFIT) en utilisant des marqueurs de cellule endothéliale. Les résultats d’études IFIT indiquent que les réseaux pseudo-capillaires à l’intérieur des substituts de peau psoriasique étaient plus ramifiés, denses, chaotiques et nombreux par rapport aux échantillons de contrôle sains, à cause de l’élément de provocation angiogénique du psoriasis. / Psoriasis is an immune-system-mediated chronic inflammation in mankind. In psoriatic skin lesions, vascular microanotomical modifications are one of the important hallmarks of psoriatic skin. The aim of this study was to develop a wellcharacterized and easily accessible reconstructed vascularized psoriatic skin for the evaluation of drug candidates and studying the biology of inflammation and angiogenesis. The vascularized psoriatic and healthy skin equivalents were produced using the self-assembly method, which was modified by the addition of human microvascular dermal endothelial cells. The architectural and characteristic similarities of substitutes to the in vivo condition was analyzed with Masson’s trichrome staining. A well-developed epidermis was observed in healthy skin substitutes, whereas a hyperproliferative epidermis was observed in psoriatic skin substitutes. The psoriatic nature of substitutes was studied with cytokeratin expression levels and differentiation markers. The required conditions for vascularization of substitutes were optimized. The formation, differentiation, extends and the quantity of capillary-like structures were observed with whole-mount immunofluorescence (wmIF) staining studies using endothelial cell markers The results of wmIF studies showed that the capillary-like networks within psoriatic skin substitutes were more branched, dense, chaotic and numerous compared to healthy controls because of the angiogenic provocation feature of psoriasis.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. 112-131. Publ. aussi en version électronique.

Les cicatrices hypertrophiques sont la résultante de désordres fibrotiques caractérisés par un dépôt excessif de Matrice ExtraCellulaire (MEC) et une persistance anormale des myofibroblastes (cellules différenciées qui participent à la cicatrisation). Elles apparaissent régulièrement suite à un retard dans les délais de cicatrisation comme c'est le cas lors de la guérison des plaies de grandes surfaces caractéristiques des grands brûlés. Afin de comprendre les mécanismes mis en jeux dans cette pathologie notre équipe a utilisé le modèle de peau reconstruite par auto-assemblage avec des cellules épidermiques et dermiques issues de cicatrices hypertrophiques ou de peaux normales. Les études précédentes ont permis de montrer que l'épaisseur des dermes obtenus lors de culture de différents types cellulaires mésenchymateux est augmentée en présence de kératinocytes issus de cicatrices hypertrophiques (KH) par rapport à celle obtenue' lorsque des kératinocytes issus de cicatrices normales (KN) sont utilisés. Elles ont également pu attribuer cette variation d'épaisseur dermique à un effet paracrinien de l'épiderme. Nous avons poursuivi cette étude et identifié une protéine inhibitrice des métalloprotéinases : TIMP-1, sécrétée plus fortement par les KH par rapport aux KN. Cette dernière une fois ajoutée aux milieux de culture d'équivalents de peau reconstruite avec des KN in vitro induit une fibrose comparable a celle obtenue dans les équivalents de peau reconstruite avec des KH. Cette observation apporte une nouvelle donnée dans la connaissance des mécanismes moléculaires et cellulaires conduisant à la cicatrisation hypertrophique.

Dans le cadre de ce projet de maîtrise, le but principal était de poursuivre le développement d'un modèle de peau psoriasique reconstruit par génie tissulaire et de caractériser le rôle de l'innervation sensorielle dans le phénotype psoriasique de ces derniers. Le développement de cet équivalent vise avant tout à mieux comprendre la pathogénèse du psoriasis et potentiellement ouvrir la porte à de nouvelles voies thérapeutiques permettant de contrôler la maladie ou ses symptômes. Avec nos protocoles, nous avons pu démontrer que l'ajout d'innervation à un équivalent de peau reconstruit par génie tissulaire exacerbait le phénotype psoriasique en tout ou en partie. Jusqu'à présent, la caractérisation des cytokines étudiées dans nos protocole nous laisse croire que le facteur de croissance neuronal (NGF) est le principal médiateur de la prolifération kératinocytaire caractérisant les peaux psoriasiques.

Le psoriasis est une maladie inflammatoire de la peau pour laquelle aucun traitement curatif n’a vu le jour jusqu’à présent. L’étiologie étant complexe, la recherche dans ce domaine vise donc une meilleure compréhension de la pathologie. Pour ce faire, il faut mettre sur pied des modèles in vitro représentatifs de la pathologie, ce que nous faisons au LOEX. Ce projet porte sur la caractérisation par profilage génique de notre modèle afin d’en poursuivre l’optimisation éventuelle. Pour ce faire, nous avons produit différents substituts sains, lésionnels et non-lésionnels, puis nous en avons analysé le transcriptome. Dans un second temps, nous avons tenté de mimer la condition inflammatoire via l’addition de cytokines au sein des substituts lésionnels. Ces résultats démontrent d’une part la force du modèle existant, mais d’autre part, que la supplémentation en cytokines a des effets positifs sur le transcriptome, le rendant quasi identique à celui de peaux psoriasiques in vivo. / Psoriasis is a chronic inflammatory skin disease for which no cure has emerged. Research in this area aims to better understanding its complex etiology. Representative models of the pathology are needed and it is part of our expertise to develop psoriatic skin substitutes at LOEX. This project has focused on the characterization of our model by gene profiling in order to pursue its optimization. Different kinds of substitutes were produced and the transcriptome was analyzed. We also attempted to mimic the addition of immune cells via the addition of cytokines during lesional skin reconstruction. Cytokines chosen were identified as playing a key role in psoriasis. These results demonstrated on one hand, the strength of our original model and on the other hand, the positive impact on the transcriptome that cytokines supplementation can produce, making it almost identical to psoriatic skin in vivo.

Une adaptation de la méthode d’auto-assemblage développée au LOEX permet de produire des substituts cutanés bicouches ayant un phénotype psoriasique. Le premier objectif de ce travail était d’évaluer si une conservation par la congélation des substituts cutanés était envisageable afin d’avoir accès à ces derniers en tout temps pour effectuer des analyses physiochimiques sans délais. Les études réalisées sur des substituts sains montrent qu’elle ne l’est pas dans sa méthodologie actuelle puisqu’elle affecte la fonction barrière des substituts. Par ailleurs, en raison du rôle des lipides épidermiques dans la fonction barrière et de leur implication dans le psoriasis, une caractérisation de ces lipides a été effectuée par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats obtenus montrent principalement une diminution de la proportion d’acide linoléique dans les substituts par rapport à la peau normale humaine. Ces résultats sont prometteurs en raison du rôle de cet acide et de ses métabolites dans l’inflammation. / Adaptation of the self-assembly method developed at LOEX allows us to produce bilayered skin substitutes with psoriatic phenotype. The first aim of this study was to evaluate if freezing of the skin substitutes is possible without affecting its integrity, in order to access the skin substitutes in anytime to perform physicochemical analysis without delay. Results, obtained with control skin substitutes produced via the standard described self-assembly method, showed that freezing clearly affected the skin barrier function of the skin substitutes. Moreover, because of their implication in skin barrier and in psoriasis pathology, epidermal skin lipids of control and psoriatic skin substitutes were characterized by gas chromatography. Results showed mainly a significant reduction of the linoleic acid proportion in skin substitutes compared to normal human skin. These results are promising because of the implication of linoleic acid and its metabolites in inflammation.

Le défi actuel des chercheurs est d’élaborer de nouveaux modèles de substituts cutanés plus perfectionnés et d’optimiser leur méthode de production afin d’améliorer leur reproductibilité. Cette étude a évalué l’impact de la congélation des substituts cutanés à -20°C pendant 2 mois via leurs propriétés physico-chimiques et leur fonctionnalité. Les analyses d’ATR-FTIR montrent que la cryopréservation n’affecte pas l’organisation des lipides de la couche cornée tandis que les analyses d’absorption percutanée montrent que la congélation affecte la perméabilité des substituts cutanés. De plus, le modèle de peau a été optimisé par l’incorporation de lymphocytes T permettant ainsi d’étudier le rôle des lymphocytes sur la différenciation cellulaire des kératinocytes et de mieux comprendre le rôle de la fractalkine dans le développement du psoriasis. Ces résultats nous incitent à penser que la fractalkine se démarque des autres cytokines inflammatoires dans le développement du psoriasis et se doit d’être mieux connue. / The current challenge for researchers is to develop new models for more advanced skin substitutes and optimize their production methods to improve reproducibility. This study evaluates the impact of the freezing of skin substitutes at -20°C for 2 months via their physicochemical properties and functionality. The ATR-FTIR analysis show that the cryopreservation did not affect the lipid organization of the stratum corneum while percutaneous absorption analysis show that the freezing of the permeability affects skin substitutes. In addition, the skin model was optimized by incorporating T lymphocytes and to study the role of lymphocytes in cell differentiation of keratinocytes and better understand the role of fractalkine in the development of psoriasis. These results lead us to believe that fractalkine differs from other inflammatory cytokines in the development of psoriasis and should be investigated.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. 85-94. Publié aussi en version électronique.

Le traitement des ulcères cutanés constitue un défi majeur et les options thérapeutiques efficaces demeurent limitées. Le but du présent projet était de concevoir et d’évaluer le potentiel de pansements biologiques fabriqués à partir de cellules souches extraites du tissu adipeux (CSTA) à favoriser la guérison de plaies cutanées. Des pansements faits de CSTA ou de CSTA différenciées en adipocytes ont été mis au point en utilisant la technique d’auto-assemblage développée au LOEX et évalués sur un modèle d’étude in vitro adapté pour l’étude de pansements. L’effet de ces pansements a été évalué en mesurant la progression de la réépithélialisation des plaies in vitro, en caractérisant leur sécrétome et en réalisant des analyses histologiques et immunohistochimiques. Cette recherche suggère que les CSTA différenciées en adipocytes pourraient être utilisées en complément ou alternativement aux fibroblastes dermiques pour la production de recouvrements autologues utiles dans le traitement des plaies cutanées. / Treatment of chronic wounds remains a major challenge in clinic and efficient treatment options are still limited. The goal of this project was to create and evaluate the potential of bioengineered cellular wound dressings made of adipose-derived stem/stromal cells (ASCs) for cutaneous wound healing. Dressings made of ASCs differentiated or not towards the adipogenic lineage were produced using the self-assembly approach and were evaluated using an adapted in vitro wound healing model. The effect of these dressings was assessed by measuring the progression of reepithelialisation on in vitro wounds, by characterizing dressing’s secreted products and by histological and immunohistochemical analyses. This research suggests that ASCs could be used as an alternative or a complement to dermal fibroblasts for the production of autologous dressings useful for healing of chronic wounds.

"Thèse en cotutelle, Université Laval Québec, Canada Philosophiæ doctor (Ph. D.) et Université de Strasbourg Strasbourg, France" / Les réactions immunitaires de la peau sont initiées par les cellules dendritiques cutanées (dendritic cells, DCs). L'effet potentiellement sensibilisateur d'un composé peut être prédit in vitro en utilisant des monocytes humains différenciés en DCs (MonoDCs). Cependant, ces modèles simplistes restent imprécis car l'activation des DCs cutanés par les sensibilisateurs peut être déclenchée ou modulée par des interactions microenvironnementales avec de multiples types de cellules non immunitaires. Notre objectif est de développer une peau immunocompétente qui combinera des MonoDCs avec tous les éléments structurels et fonctionnels de la peau, c'est-à-dire une barrière épidermique posée sur un derme contenant une pseudo-vascularisation et des neurones nociceptifs. Une matrice de collagène a été ensemencée avec des fibroblastes et des cellules endothéliales, puis avec des précurseurs de fibres nerveuses dérivées soit de l'iPSC humaine, soit de la DRG embryonnaire murins. Enfin, nous avons introduit les MonoDC et les kératinocytes. Nous avons observé que les neurones différenciés in situ innervent l'épiderme comme observé habituellement dans la peau humaine normale. De plus, les neurones dérivées d’iPSCs, expriment neuropeptides et canaux calcique spécifiques des fibres nociceptives. Enfin, les Mono-DC intégrés au modèle restent stable pendant toute la durée nécessaire à la formation de l’épiderme et peuvent être stimulé. Le modèle sera utilisé pour prédire le potentiel irritant des composés chimiques et l'impact de l’innervation nociceptive sur l'activation des DCs. / Immune reactions in the skin are initiated by the cutaneous dendritic cells (DCs). The potential sensitizing effect of a compound can be predicted in vitro using human monocytes differentiated into DCs (Mono-DCs). However, these simplistic models remain inaccurate because the activation of cutaneous DCs by sensitizers may be triggered or modulated by microenvironmental interactions with multiple types of nonimmune cells. Our goal is to develop an immunocompetent human tissue-engineered skin that will combine DCs with all structural and functional element of the skin, i.e. an epidermal barrier laid upon a dermis containing a pseudo-vascularization and nociceptive neurons. Collagen matrix was seeded with fibroblasts and endothelial cells, then with precursors of nerve fibers derived from either human iPSC or murine embryonic DRG. Finally, we introduced Mono-DCs and keratinocytes. We observed that in situ differentiated neurons grow axons towards the epidermis as usually observed in normal human skin. What's more, the neurons derive from iPSC, express neuropeptides and calcium channel as normal nociceptive fibers. Moreover, Mono-DCs settled as expected beneath the epidermis and remained sessile to stimulation for several weeks. The model will be used to predict the irritant potential of chemical compounds, and the impact of nerves on DC activation.