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Reconstruction d'une cornée humaine par la méthode d'autoassemblage à partir des trois types de cellulesUwamaliya, Jeanne d'Arc 16 April 2018 (has links)
La reconstruction de la cornée in vitro fait l'objet de plusieurs études depuis quelques années. Cependant, la majorité des travaux utilisent des biomatériaux et des cellules animales ou humaines immortalisées. De plus, plusieurs des cornées ne sont que partiellement reconstruites, c'est-à-dire quelles ne possèdent qu'une ou deux des trois populations de cellules qui composent normalement une cornée. Un modèle de cornée reconstruite ressemblant davantage à une cornée native pourrait être très utile pour des études in vitro comme des tests pharmacologiques et toxicologiques. De plus, ces cornées reconstruites pourraient être utilisées comme tissu de remplacement in vivo. Pour ces raisons, une cornée complète, reconstruite par la méthode d'autoassemblage, a été produite en utilisant des cellules humaines non transformées et ce, sans ajout de matériel exogène. Les cornées reconstruites par cette méthode ont une structure histologique similaire à celle d'une cornée humaine native. L'épithélium pluristratifié et bien différencié possède des cellules basales et suprabasales clairement définies. Les kératines épithéliales sont correctement exprimées. L'endothélium, disposé en monocouche, exprime la protéine de transport Na+/K+-ATPase. Les composants des membranes basilaires ont également été identifiés à la jonction entre l'épithélium et le stroma des cornées reconstruites en laboratoire.
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Étude de la guérison des plaies cornéennes in vitro et in vivoCouture, Camille 01 October 2021 (has links)
La cornée est un tissu unique en raison de sa transparence, ce qui permet à la lumière pénétrant la cornée d'être transmise efficacement jusqu'à la rétine. De par sa localisation à la surface antérieure du globe oculaire, la cornée est en contact direct avec l'environnement extérieur. Par conséquent, cette disposition la prédispose à plusieurs blessures, traumatismes et stress pouvant affecter la qualité de la vision. Lorsque la capacité des cellules souches à maintenir la transparence cornéenne est affectée par la blessure, cela peut conduire à des troubles visuels importants, voire même à la cécité. La guérison des blessures cornéennes est un mécanisme complexe faisant intervenir plusieurs processus cellulaires dont la migration, la prolifération, la différenciation et la communication cellule-cellule. L'objectif de mon projet de doctorat consistait à étudier les processus cellulaires et moléculaires ayant lieu lors de la guérison des plaies cornéennes. Pour se faire, la cornée humaine reconstruite par auto-assemblage ainsi que les cellules cornéennes primaires cultivées en monocouches ont été utilisées comme modèles d'étude de la guérison des plaies cornéennes in vitro. Les résultats obtenus grâce à ces modèles ont permis de mettre en lumière plusieurs éléments originaux, dont la possibilité d'accélérer la guérison des plaies cornéenne grâce à l'inhibition de CREB combinée à l'activation d'AKT. L'expérience menée in vivo chez le lapin a permis de définir la méthode la plus appropriée afin de créer un déficit épithélial chez l'animal ainsi que les concentrations optimales des deux agents pharmacologiques, soit le C646 et le SC79. De plus, la culture des trois types de cellules cornéennes de manière séparée a permis de caractériser les différents exosomes sécrétés par ce tissu et de vérifier leur impact sur la guérison des plaies cornéennes, ce qui n'avait jamais été réalisé jusqu'à présent. Enfin, l'ensemble des résultats présentés dans cette thèse conduit à une meilleure compréhension des processus cellulaires et moléculaires liés à guérison des plaies cornéennes. Les résultats prometteurs que j'ai obtenus au cours de mon doctorat ont permis d'entreprendre le développement d'un traitement permettant de réduire significativement le temps de guérison des blessures cornéennes, et donc le risque de développer des complications. Ce nouveau traitement constitue une avenue encourageante pour améliorer les soins qui sont présentement offerts aux patients souffrant de lésions cornéennes. / The cornea is a unique tissue due to its transparency, a crucial feature allowing proper light transmission to the retina. However, because of its position at the outer surface of the eye, the cornea is subjected to traumas that may alter vision quality. Such traumas may affect the capacity of corneal stem cells to regenerate the tissue. In that case, visual acuity is greatly reduced or even abolished. Corneal wound healing is a complex process that involves extracellular matrix remodeling as well as many cellular processes such as migration, proliferation, differentiation and cell-cell communication. The goal of this thesis was to study the molecular and cellular processes that occur during corneal wound healing. To do so, human tissue-engineered corneas as well as primary corneal cells cultivated as monolayers were used to study corneal wound healing. Using these in vitro models, we established that corneal wound healing processes could be significantly accelerated by inhibiting the protein CREB while activating the protein AKT. The pharmacological agents used were C646, a CREB inhibitor, and SC79, an AKT agonist. These pharmacological agents were also used in vivo in a rabbit wound model. After establishing the best method for creating reproducible corneal wounds, we showed that the lowest concentrations of C464 and SC79 tend to accelerate the healing. As exosomes are well known to participate in cell-cell communication during wound healing, we isolated these small extracellular vesicles secreted by either corneal epithelial cells, corneal fibroblasts and corneal endothelial cells. Their impact on the corneal wound healing process was therefore investigated. Taken together, the results presented in this thesis lead to a better understanding of the molecular and cellular processes that take place during corneal wound healing. Based on these novel and promising results, we worked on the development of an innovative treatment that may significantly reduce the wound healing time and therefore the risk of complications. This new therapeutic approach is an encouraging opportunity to improve the treatment currently offered to patients suffering from corneal wounds.
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Étude de la guérison des plaies cornéennes in vitro et in vivoCouture, Camille 02 February 2024 (has links)
La cornée est un tissu unique en raison de sa transparence, ce qui permet à la lumière pénétrant la cornée d'être transmise efficacement jusqu'à la rétine. De par sa localisation à la surface antérieure du globe oculaire, la cornée est en contact direct avec l'environnement extérieur. Par conséquent, cette disposition la prédispose à plusieurs blessures, traumatismes et stress pouvant affecter la qualité de la vision. Lorsque la capacité des cellules souches à maintenir la transparence cornéenne est affectée par la blessure, cela peut conduire à des troubles visuels importants, voire même à la cécité. La guérison des blessures cornéennes est un mécanisme complexe faisant intervenir plusieurs processus cellulaires dont la migration, la prolifération, la différenciation et la communication cellule-cellule. L'objectif de mon projet de doctorat consistait à étudier les processus cellulaires et moléculaires ayant lieu lors de la guérison des plaies cornéennes. Pour se faire, la cornée humaine reconstruite par auto-assemblage ainsi que les cellules cornéennes primaires cultivées en monocouches ont été utilisées comme modèles d'étude de la guérison des plaies cornéennes in vitro. Les résultats obtenus grâce à ces modèles ont permis de mettre en lumière plusieurs éléments originaux, dont la possibilité d'accélérer la guérison des plaies cornéenne grâce à l'inhibition de CREB combinée à l'activation d'AKT. L'expérience menée in vivo chez le lapin a permis de définir la méthode la plus appropriée afin de créer un déficit épithélial chez l'animal ainsi que les concentrations optimales des deux agents pharmacologiques, soit le C646 et le SC79. De plus, la culture des trois types de cellules cornéennes de manière séparée a permis de caractériser les différents exosomes sécrétés par ce tissu et de vérifier leur impact sur la guérison des plaies cornéennes, ce qui n'avait jamais été réalisé jusqu'à présent. Enfin, l'ensemble des résultats présentés dans cette thèse conduit à une meilleure compréhension des processus cellulaires et moléculaires liés à guérison des plaies cornéennes. Les résultats prometteurs que j'ai obtenus au cours de mon doctorat ont permis d'entreprendre le développement d'un traitement permettant de réduire significativement le temps de guérison des blessures cornéennes, et donc le risque de développer des complications. Ce nouveau traitement constitue une avenue encourageante pour améliorer les soins qui sont présentement offerts aux patients souffrant de lésions cornéennes. / The cornea is a unique tissue due to its transparency, a crucial feature allowing proper light transmission to the retina. However, because of its position at the outer surface of the eye, the cornea is subjected to traumas that may alter vision quality. Such traumas may affect the capacity of corneal stem cells to regenerate the tissue. In that case, visual acuity is greatly reduced or even abolished. Corneal wound healing is a complex process that involves extracellular matrix remodeling as well as many cellular processes such as migration, proliferation, differentiation and cell-cell communication. The goal of this thesis was to study the molecular and cellular processes that occur during corneal wound healing. To do so, human tissue-engineered corneas as well as primary corneal cells cultivated as monolayers were used to study corneal wound healing. Using these in vitro models, we established that corneal wound healing processes could be significantly accelerated by inhibiting the protein CREB while activating the protein AKT. The pharmacological agents used were C646, a CREB inhibitor, and SC79, an AKT agonist. These pharmacological agents were also used in vivo in a rabbit wound model. After establishing the best method for creating reproducible corneal wounds, we showed that the lowest concentrations of C464 and SC79 tend to accelerate the healing. As exosomes are well known to participate in cell-cell communication during wound healing, we isolated these small extracellular vesicles secreted by either corneal epithelial cells, corneal fibroblasts and corneal endothelial cells. Their impact on the corneal wound healing process was therefore investigated. Taken together, the results presented in this thesis lead to a better understanding of the molecular and cellular processes that take place during corneal wound healing. Based on these novel and promising results, we worked on the development of an innovative treatment that may significantly reduce the wound healing time and therefore the risk of complications. This new therapeutic approach is an encouraging opportunity to improve the treatment currently offered to patients suffering from corneal wounds.
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Impact d'une couche nourricière humaine et du temps post-mortem sur la culture de cellules cornéennes humainesLe Bel, Gaëtan 02 February 2024 (has links)
En raison de la pénurie mondiale de cornées de donneurs utilisées pour traiter les pathologies cornéennes, des alternatives visant à restaurer les déficiences visuelles, comme la production de tissus cornéens humains par génie tissulaire, sont envisagées. Pour traiter les dommages affectant plus précisément l'épithélium cornéen, comme la déficience en cellules souches limbiques (DCSL), l'équivalent cornéen doit avoir un épithélium capable d'auto-renouvellement permettant la bonne cicatrisation de la cornée après la greffe. Pour cultiver des cellules épithéliales de cornées humaines (CECH) in vitro, l'utilisation d'une couche nourricière est nécessaire afin de maintenir la sous-population de cellules souches cornéennes essentielle à la bonne prolifération de ces cellules. Les conditions de culture doivent donc permettre le maintien du phénotype souche de ces cellules, tout en favorisant leur prolifération et en évitant leur différenciation terminale. Cependant, d'autres paramètres comme l'intervalle post-mortem du tissu cornéen à partir duquel sont extraites les CECH cultivées, peuvent influencer la réussite de la culture. La caractérisation des cultures de CECH est importante afin d'optimiser la réussite de la greffe. Les travaux présentés dans cette thèse ont permis de démontrer que la co-culture de CECH avec une couche nourricière murine a entraîné une augmentation significative de l'expression et de la liaison à l'ADN de NFI. Cela est causé par une forte expression de l'isoformes NFI-B présentant une stabilité accrue engendrée par une hyper-glycosylation. Le maintien de l'isoforme NFI-B au cours des passages a été corrélé avec une entrée en différenciation plus rapide des CECH en culture. Ces travaux ont également montré que l'effet de cette couche nourricière murine sur les niveaux d'expression et la capacité de liaison à l'ADN des facteurs de transcription Sp1 et NFI a pu être confirmé dans un autre type cellulaire. En effet, la co-culture de cellules endothéliales cornéennes humaines avec la couche nourricière murine a également causé une augmentation significative de l'expression et de la liaison à l'ADN de NFI. Dans cette étude, cela était associé à une amélioration de la morphologie des cellules endothéliales cornéennes humaines. Ces travaux ont aussi montré que l'intervalle post-mortem influençait de manière négative la prolifération des CECH et le maintien des cellules souches lors des cultures en monocouche. De même, lorsque les mêmes populations cellulaires ont été utilisées pour reconstruire une cornée humaine par génie tissulaire, la capacité de cicatrisation des épithéliums cornéens reconstruits a diminué avec l'augmentation de l'intervalle post mortem. L'étude du transcriptome de ces populations cellulaires par biopuce à ADN, a également révélé que l'intervalle post-mortem avait un impact sur le profil transcriptomique pour les cellules cultivées en monocouche. Il a aussi été montré qu'un greffon reconstruit à partir des CECH co-cultivées avec une couche nourricière humaine a permis de cicatriser la surface cornéenne d'un œil atteint de DCSL. Ces différents résultats mettent en lumière que l'utilisation d'une couche nourricière humaine pour la culture des CECH, associée à un intervalle post-mortem court des tissus dont elles sont issues, est à privilégier pour favoriser une bonne prolifération in vitro des CECH cultivées en monocouche. / Because of the worldwide shortage of graftable corneas used to treat corneal pathlogies, alternatives to restore visual impairments, such as the production of a human cornea tissues by tissue engineering, have been considered. To treat injuries affecting the corneal epithelium, such as limbal stem cell deficiency (LSCD), the corneal equivalent must have an epithelium able to self-renewal allowing healing of the patient's corneal epithelium after the transplantation. To culture human corneal epithelial cells (HCECs) in vitro, the use of a feeder layer is necessary so as to maintain the subpopulation of corneal stem cells, which is essential for the proper proliferation of these cells. Therefore, the culture conditions must allow the maintenance of the stem phenotype of these cells, while promoting their proliferation and delaying their terminal differentiation. Other parameters, such as the post-mortem interval of the corneal tissue from which the cultured HCECs are derived, can influence the success of the culture. It is therefore important to characterize the cultures of HCECs in order to optimize the success of a transplant, namely, when these cells are transplanted in order to regenerate the injured corneal epithelium of a patient. The work presented in this thesis demonstrates that the co-culture of HCECs with a murine feeder layer resulted in a significant increase in the expression and the binding to DNA of NFI. This was shown to be caused by strong expression of the NFI-B isoform with increased stability due to hyper-glycosylation. The preservation of the NFI-B isoform with cellular passages was correlated with a faster differentiation of the HCECs in culture. This work also shows that the effect of this murine feeder layer on the expression levels and the DNA binding capacity of the transcription factors Sp1 and NFI was confirmed in another cell type. Indeed, the co-culture of human corneal endothelial cells with the murine feeder layer also caused a significant increase in the expression and binding to DNA of NFI. In this study, this was associated with an improvement in the morphology of human corneal endothelial cells. This work also showed that post-mortem interval could have a negative influence on the proliferation of HCECs and on the maintenance of stem cells during monolayer cultures. When the same cell populations were used to reconstruct a human cornea with tissue engineering, the healing capacity of the reconstructed corneal epithelia was decreased by the increase in post-mortem interval. This was notably validated by a study of the transcriptome of these cell populations by DNA microarray. It has also been shown that a graft reconstructed with HCECs co-cultivated with human feeder layer has enabled to heal the corneal surface an eye with LSCD. These different results highlight that the use of a human feeder layer for culture, associated with a short post-mortem interval of the donor tissues, is to be favoured in order to promote a good in vitro proliferation of HCECs cultivated in monolayer.
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La cornée humaine, un modèle évitant la transformation tumorale induite par les rayons ultraviolets : étude comparant la fréquence d’induction de dommages à l’ADN, leur l'efficacité de réparation ainsi que la sensibilité à la mort cellulaire induite par les rayons ultraviolets entre la cornée et l'épidermeMallet, Justin 24 April 2018 (has links)
Bien qu’ils soient exposés tous deux aux rayons ultraviolets (UVR) solaires, cette exposition génotoxique n’entraîne pas les mêmes conséquences dans l’oeil et la peau. Le rôle des rayons UV dans l’induction et la progression des cancers cutanés est bien démontré. Ces rayons génotoxiques sont absorbés par l’ADN. Ils y induisent ainsi des changements conformationnels pouvant mener à la formation de différents dommages. On retrouve de façon prédominante la liaison de pyrimidines adjacentes en dimères cyclobutyliques de pyrimidines (CPD). Ceux-ci causent les mutations signatures responsables des cancers de la peau induits par les UVR. Cependant, aucune évidence ne démontre l’existence de cancer induit par les UVR dans la cornée. Nous avons donc tenté de découvrir les mécanismes permettant à la cornée d’éviter la transformation tumorale induite par les UVR. L’irradiation d’yeux de lapins aux rayons UVB a permis de prouver la capacité de ces rayons à induire la formation de CPD, et ce, de la cornée jusqu’au cristallin. Par la suite, l’irradiation d’yeux humains aux trois types de rayons UV (UVA, B et C) a permis d’y établir leur patron d’induction de CPD. Nous avons ainsi démontré que l’épithélium cornéen est particulièrement sensible à l’induction de CPD, tous types de rayons UV confondus. Enfin, la comparaison de la quantité de dommages présents dans des échantillons de peaux et de cornées irradiées à la même dose d’UVB a permis de démontrer que l’épithélium cornéen est 3.4 fois plus sensible à l’induction de CPD que l’épiderme. Nous avons par la suite étudié les mécanismes de réponse à ce stress. L’analyse de la viabilité cellulaire à la suite d’irradiations à différentes doses d’UVB a révélé que les cellules de la cornée et de la peau ont la même sensibilité à la mort cellulaire induite par les UVR. Nous avons alors analysé la vitesse de réparation des dommages induits par les UVR. Nos résultats démontrent que les CPD sont réparés 4 fois plus rapidement dans les cellules de la cornée que de la peau. L’analyse des protéines de reconnaissance des dommages a révélé que les cellules de la cornée possèdent plus de protéines DDB2 que les cellules de la peau, et ce, surtout liées à la chromatine. Nous avons alors tenté d’identifier la cause de cette accumulation. Nos analyses révèlent que la cornée possède une moins grande quantité d’ARNm DDB2, mais que la demi-vie de la protéine y est plus longue. Enfin, nos résultats suggèrent que l’accumulation de DDB2 dans les cellules de la cornée est entre autres due à une demi-vie plus longue de la protéine. Cette forte présence de DDB2 dans les cellules de la cornée permettrait un meilleur balayage de l’ADN, faciliterait de ce fait la détection de CPD ainsi que leur réparation et contribuerait donc à la capacité de la cornée à éviter la transformation tumorale induite par les UVR. / Even though they are both exposed to ultraviolet (UV) light, eye and skin do not share the same consequences following this genotoxic exposure. The role of UV rays in the induction and progression of skin cancer is well documented. These genotoxic wavelengths are absorbed by DNA, inducing conformational changes and thus leading to the formation of different forms of damage. The preeminent UV-induced DNA damage is formed by the covalent bond of adjacent pyrimidines to form cyclobutane pyrimidine dimers (CPD), which are responsible for the signature UV mutations found in UV-induced skin cancer. However, no evidence has shown the existence of UV-induced cancer in the cornea. We have thus undertaken to study the UV stress response mechanisms to understand how the cornea avoid UV-induced transformation. Irradiation of rabbit eyes with UVB wavelengths allowed us to prove the capacity of UV light to induce CPD formation, even more so, CPD were found from the cornea up to the lens. Thereafter, irradiation of human eyes with the three UV types (UVA, B and C) allowed us to establish their CPD induction pattern. We thus confirmed the fact that the corneal epithelium is particularly sensitive to the induction of CPD from all UV types. The analysis of DNA damage in samples of skin and cornea irradiated to the same UVB dose showed that corneal epithelium is 3.4 times more sensitive to CPD induction than epidermis. We then investigated the stress response mechanisms. The analysis of cellular viability following irradiation of cells to different UVB doses, revealed cells from the corneal epithelium and the epidermis were equally sensitive to UV-induced cell death. We then analysed the efficiency of UV-induced DNA damage repair. Our results show that CPD repair is 4 times more efficient in corneal cells than in skin cells. Analysis of recognition proteins revealed a strong presence of DDB2 in corneal cells and more particularly bound to their chromatin. We thus attempted to understand the reason of this accumulation. Our results reveal a lesser quantity of DDB2 mRNA in corneal cells, but a longer half-life of the DDB2 protein. Taken together, our results suggest the accumulation of DDB2 in corneal cells is due to a longer half-life of the protein, which compensates for a lesser mRNA quantity. This strong presence of DDB2 would allow a better scavenging of DNA in corneal cells and thus facilitate damage detection, enhance CPD repair and contribute to capacity of the cornea to avoid tumour transformation.
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Contribution de la kinase WNK1 à la guérison des plaies cornéennesDesjardins, Pascale 22 December 2018 (has links)
La cornée, en raison de sa localisation anatomique superficielle, est particulièrement vulnérable à divers traumatismes, lesquels peuvent mener à des déficiences visuelles importantes. Les changements dans la matrice extracellulaire (MEC) qui accompagnent les lésions de l'épithélium cornéen sont perçus par les intégrines qui, en retour, activent différentes voies signalétiques intracellulaires, menant ultimement à la réparation de l'épithélium lésé. L’objectif de cette étude consistait, d’une part, à identifier les médiateurs signalétiques dont l’expression et/ou l’activité était modifiée durant la guérison des plaies cornéennes, et, d’autre part, à analyser l’impact de l’inhibition d’un de ces médiateurs signalétiques, la kinase WNK1, sur la guérison des plaies cornéennes. L’analyse des données obtenues en profilage génique et profilage de kinases a permis d’identifier d’importantes altérations dans l’expression et l’activité de plusieurs médiateurs, dont la kinase WNK1, en réponse aux changements dans la MEC qui ont lieu durant la guérison des plaies cornéennes. En utilisant la culture de cellules épithéliales cornéennes humaines (hCECs) en monocouche et la cornée humaine reconstruite par génie tissulaire (hTEC) comme modèles, il a été possible de démontrer que l’inhibition pharmacologique de WNK1 par le WNK463 ralentit la fermeture des plaies cornéennes. De plus, des analyses de buvardage Western et des mesures de taux de croissance ont permis de démontrer que l’inhibition de WNK1 empêche l’activation de ses protéines cibles en aval SPAK et OSR1 et altère les propriétés prolifératives des hCECs. Enfin, ces résultats ont permis d’identifier WNK1 comme un joueur important dans la guérison des plaies cornéennes, attribuant ainsi une toute nouvelle fonction à cette kinase. De plus, ces résultats contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la cicatrisation de la cornée et pourraient mener à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement des lésions cornéennes. / The cornea, because of its superficial anatomical location, is continually subjected to abrasive forces and various traumas, which can lead to significant visual impairments. Damages to the corneal epithelium trigger important changes in the composition of the extracellular matrix (ECM) to which the basal human corneal epithelial cells (hCECs) attach. These changes are perceived by integrins that activate different intracellular signalling pathways, ultimately leading to reepithelialization of the injured epithelium. The aims of this study was, first, to identify the signalling mediators whose expression and/or activation was altered during the healing process of the cornea, and second, to analyze the impact of the inhibition of one of these signalling mediators, the WNK1 kinase, on the corneal wound healing. Analysis of the gene profiling data and kinase arrays revealed important alterations in the expression and activity of several mediators, including the WNK1 kinase, in response to the ECM changes that occur during corneal wound healing. Using both monolayers of hCECs and tissue-engineered human corneas (hTECs) as in vitro models, we demonstrated that pharmacological inhibition of WNK1 by WNK463 significantly reduced the rate of corneal wound closure. In addition, Western blot analyzes and growth rate measurements have shown that inhibition of WNK1 prevents the activation of its downstream target proteins SPAK and OSR1, and alters the proliferative properties of hCECs, respectively. Finally, these results allowed the identification of WNK1 as an important player in the wound healing of the cornea, thus assigning a new function to this kinase. These results will therefore contribute to a better understanding of the cellular and molecular mechanisms involved in corneal wound healing and could lead to the identification of new therapeutic targets in the treatment of corneal wounds.
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Étude de la guérison des plaies cornéennes grâce à la cornée reconstruite par génie tissulaireCouture, Camille 24 April 2018 (has links)
Tableau d'honneur de la FÉSP, 2016 / La cornée est la couche la plus antérieure de l'oeil et sa transparence permet de laisser passer les ondes lumineuses vers la rétine. Cependant, la localisation de la cornée la prédispose à des blessures chimiques et mécaniques. La guérison des blessures cornéennes est un mécanisme complexe faisant intervenir la mort cellulaire, la migration, la prolifération, la différenciation et le remodelage de la matrice extracellulaire (MEC). Dans cette étude, nous avons utilisé la cornée humaine reconstruite par génie tissulaire composée d’un épithélium et d’un stroma afin d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la guérison des plaies, en particulier le remodelage de la MEC exercé par les métalloprotéinases matricielles (MMPs). Les analyses en profilage génique sur biopuces à ADN nous ont permis de démontrer que l’expression de plusieurs gènes était dérégulée lors de la guérison des plaies dans notre modèle. L’expression des gènes codant pour les MMPs, tel que confirmée en qPCR, est augmentée dans l’épithélium migrant afin de recouvrir la plaie. Les analyses en zymographie sur gel ont démontré que les MMPs étaient converties en leur forme enzymatiquement active au fur et à mesure que la lésion se referme. Par ailleurs, nous avons démontré que l’expression des MMPs par les cellules épithéliales est influencée par la présence des fibroblastes dans le stroma ainsi que par leur sécrétion d’une MEC enrichie en collagènes. De plus, les analyses en spectrométrie de masse ont confirmé que la présence d’un épithélium stratifié est requise pour la synthèse et l’organisation adéquate de la MEC. Enfin, les résultats de ces travaux améliorent nos connaissances des mécanismes cellulaires et moléculaires qui modulent la guérison des plaies cornéennes et pourront certainement mener à des progrès en clinique, notamment au niveau du développement de thérapies visant à traiter les troubles de la cornée. / The cornea is located at the outer surface of the eye and its transparency is required to allow light transmission to the retina. However, because of its location, the cornea is subjected to chemical and mechanical injuries. Corneal wound healing is a complex mechanism involving many processes such as cell death, migration, proliferation, differentiation and extracellular matrix (ECM) remodeling. In the present study, we used a tissue-engineered, two-layers (epithelium and stroma) human cornea as a biomaterial to study both the cellular and molecular mechanisms of wound healing, more specifically the ECM remodeling exerted by matrix metalloproteinases (MMPs). Gene profiling on microarrays revealed important alterations in the pattern of genes expressed by tissue-engineered corneas in response to wound healing. Expression of many MMPs-encoding genes was shown by microarray and qPCR analyses to increase in the migrating epithelium of wounded corneas. Many of these enzymes were converted into their enzymatically active form as wound closure proceeded. In addition, expression of MMPs by human corneal epithelial cells was affected both by the stromal fibroblasts and the collagen-enriched ECM they produce. Most of all, results from mass spectrometry analyses provided evidence that a fully stratified epithelium is required for proper synthesis and organization of the ECM on which the epithelial cells adhere. This study will improve our understanding of the cellular and molecular mechanisms that modulate human corneal wound healing by exploiting a new, innovative 3D reconstructed tissue much closer to the native cornea. It is likely that our study will lead to the development of novel therapies for the treatment of many corneal disorders.
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Le rôle de la compatibilité tissulaire et sérique dans le rejet de la greffe cornéenneDes Marchais, Béatrice 21 November 2018 (has links)
Bien que la greffe de cornée est le type de transplantation connaissant le plus haut taux de succès, le rejet est la principale cause d'échec de greffe, surtout chez les cornée vascularisées. Comme l'aspect immunologique est primordial pour les greffes d'autres organes, nous analysons le volet sérologique, avec l'effet du crossmatch, et le volet tissulaire, avec l'effet des antigènes ABO, Lewis, HLA -A, -B et DR, chez une population de patients greffés au CHUL entre 1982 et 1995. Le suivi minimal est de 12 mois. Le crossmatch positif chez des patients présensibilisés par une greffe antérieure ou un rejet antérieur augmente le risque de rejet endothelial. Encore une fois, nous démontrons que ABO n'influence pas la survie de la greffe. Une incompatibilité Lewis ou HLA -A ou -B augmente le rejet chez les patients non-vascularisés.L'effet d'un mismatch HLA-DR n'a pas été démontré. / Québec Université Laval, Bibliothèque 2018
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Optimisation des méthodes d'isolement et de culture des cellules endothéliales cornéennes humainesSanterre, Kim 02 February 2024 (has links)
L'endothélium cornéen joue un rôle important dans le maintien de la transparence cornéenne, notamment en assurant le rôle de barrière entre la chambre antérieure et la cornée, et en créant des gradients ioniques nécessaires à la déturgescence stromale. Dans le cas de dysfonctions de l'endothélium, une perte progressive de la vision est engendrée. Parmi les causes de dysfonctions, la dystrophie endothéliale cornéenne de Fuchs (DECF) est la plus importante. Présentement, le seul traitement disponible pour les endothéliopathies cornéennes est la greffe de cornée. Comme la demande en tissus oculaires est grandissante, des alternatives incluant l'expansion in vitro des cellules endothéliales cornéennes (CECs) ont été proposées, soit l'endothélium reconstruit et l'injection de CECs intracamérale. L'enjeu principal lors de la culture des CECs est la transition endothélio-mésenchymateuse (TEM), phénomène où les CECs perdent leur phénotype fonctionnel pour acquérir un phénotype fibroblastique non fonctionnel. Plusieurs étapes de la culture des CECs, comme l'isolement ou le milieu utilisé, peuvent être optimisées afin de conserver la fonctionnalité des CECs. Dans cet ordre d'idée, notre laboratoire a récemment démontré que l'ajout de TGF-β1 permettait de maintenir le phénotype fonctionnel lorsqu'il était ajouté à des CECs confluentes. L'objectif général du projet est d'optimiser les paramètres d'isolement et de culture afin de générer des CECs fonctionnelles pouvant être utilisées en alternative à la greffe de cornées cadavériques. Plus spécifiquement, les objectifs de cette thèse sont 1) d'identifier les paramètres d'isolement permettant de générer des CECs de haute densité et de phénotype endothélial, 2) de comparer l'efficacité des trois isoformes du TGF-β sur le maintien du phénotype endothélial en phase de maturation, de déterminer quels sont les mécanismes impliqués dans la maturation en présence de TGF-β ainsi que de confirmer la fonctionnalité tissulaire dans un modèle de chambres antérieures artificielles et 3) d'étudier l'effet du TGF-β2 sur les CECs provenant de spécimens pathologiques (DECF), notamment l'effet sur la mort cellulaire, sur l'expression des récepteurs du TGF-β et sur la TEM. Afin de répondre à l'objectif 1, deux méthodes d'isolement des CECs ont été comparées (EDTA et collagénase). Les résultats ont montré qu'une plus grande quantité de CECs viables étaient extraites des spécimens post-mortem avec la collagénase et que ces CECs avaient une morphologie plus circulaire. En ce qui a trait à l'objectif 2, les trois isoformes du TGF-β ont été ajoutées aux CECs en phase de maturation et ont permis de générer des cultures de CECs ayant un phénotype fonctionnel in vitro. Le transcriptôme et les voies de signalisation activées par le TGF-β ont été étudiés par la suite. Les résultats de profilage génique ont révélé une augmentation de l'expression de gènes liés à l'adhésion matricielle. Le profilage des voies de signalisation a, pour sa part, permis d'identifier 8 kinases significativement plus actives, dont la kinase AKT. Pour le dernier volet de cet objectif, la fonctionnalité tissulaire a été évaluée en utilisant un modèle d'injection de CECs sur cornées dévitalisées contenues dans des bioréacteurs. Une meilleure adhésion des CECs ayant préalablement été exposées au TGF-β2 ainsi qu'un rétablissement plus rapide des jonctions a été observé dès 2 jours de culture dynamique. Pour répondre à l'objectif 3, des CECs provenant de spécimens DECF ont été exposées au TGF-β2 avant que la mort cellulaire, l'expression des récepteurs du TGF-β et l'expression des jonctions intercellulaires soient mesurées. Aucune différence quant à la mort cellulaire n'a été observée. Seul le récepteur I du TGF-β est augmenté suite à l'exposition au TGF-β2. Les CECs pathologiques exprimaient plus fortement les protéines reliées aux jonctions intercellulaires et localisées à la membrane. Les travaux présentés dans cette thèse proposent une méthode de culture qui génère des CECs fonctionnelles. Ils démontrent également que le TGF-β2 aurait un rôle protecteur sur l'intégrité de la barrière endothéliale lorsque les CECs sont confluentes.
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Modulation de l'expression du gène encodant la sous-unité d'intégrine α6 durant la cicatrisation cornéenneGaudreault, Manon. 12 April 2018 (has links)
Cette thèse de doctorat porte sur l'étude des notions fondamentales de la vision, plus particulièrement de la compréhension de l'homéostasie et de la cicatrisation de la cornée. En fait, l'attention de ces travaux est accordée à la modulation de l'expression d'un récepteur important dans l'adhésion de l'épithélium cornéen : la sous-unité d'intégrine a6. Les intégrines sont des protéines transmembranaires, des composantes essentielles de l'adhésion entre cellules et la matrice extracellulaire. D'ailleurs, les intégrines sont impliquées dans la plupart des processus cellulaires et sont un élément clef de tout tissu, incluant le tissu oculaire. Les intégrines a6(31 et a6|34 sont toutes deux exprimées au niveau de l'épithélium cornéen, deux intégrines ayant comme ligand la laminine. Lors de la cicatrisation cornéenne, l'expression de la laminine ainsi que celle de la sous-unité a6 est favorisée. Cependant, le rôle des intégrines a6(31 et a6(34 ainsi que la modulation de l'expression du gène de la sous-unité a6 au niveau de l'épithélium cornéen demeuraient des éléments obscurs avant le début de ces travaux. L'objectif principal des travaux était donc d'identifier les facteurs importants dans la modulation du promoteur du gène de la sous-unité d'intégrine a6 dans la réponse des cellules épithéliales de l'épithélium cornéen lors de la cicatrisation cornéenne. Ces travaux ont permis de démontrer l'importance des facteurs Spl, Sp3 et NFI dans la régulation de la transcription du gène a6 dans l'homéostasie, ainsi qu'à des étapes précises du processus de la cicatrisation cornéenne. De plus, l'effet global de la laminine dans la réponse des cellules épithéliales de la cornée suite à l'activation des intégrines a6(31 et a6(34 est mieux défini. / This doctoral thesis is a study based on the fundamental notions of vision, more particularly the comprehension of corneal homeostasis and wound healing. It pays a particular attention to the modulation of expression of a gene that encodes a membrane-bound receptor subunit, the a6 subunit from the a6|31 and a6(34 integrins, important for adhesion of the corneal epithelium to the basement membrane. These integrins constitute essential components of cell-to-cell and cell-extracellular matrix adhesions. These trans-membrane receptors are involved in most cellular processes and represent key elements in ail tissues, including ocular tissues. Expression of both the a6|31 and a6(34 integrins, whose respective ligand is laminin, has been reported in the corneal epithelium. Recently, expression of the a6 subunit has been shown to be coordinated with the massive secretion of laminin that occurs 24 hours following damage to the corneal epithelium. However, the precise function played by laminin on the modulation of expression of the a6 subunit gene had never been explored before the present study. The a6 gene promoter is deprived of a TATA binding cassette. On the other hand, it possesses a high content in guanine and cytosine residue (GC-rich promoter), a condition required in order to ensure proper regulation of a6 gene transcription. This study demonstrates the importance of the transcription factors Spl, Sp3 and NFI in the transcription regulation of the a6 gene during corneal wound healing. In addition, the global influence of laminin in the response of the corneal epithelial cells following activation of the a6|31 and a6(34 integrins is further explored. In conclusion, the results presented in this work shed light at least in part on the extreme complexity of the gene regulation network that takes place at the corneal epithelium during wound healing
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